Name: Crescita Mycobacterium tuberculosis I biofilm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Impara a coltivare biofilm di Mycobacterium tuberculosis su interfaccia aria-mezzo e a determinare la frequenza di persister tolleranti ai farmaci. Questo metodo rivela proprietà uniche dell'architettura multicellulare.

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Il lavoro è stato realizzato con il sostegno finanziario del National Institute of Health e la American Lung Association.

1. Biofilm crescente di M. tubercolosi in una bottiglia con tappo a vite 250mL <ol><li> Preparazione Media: sciogliere 0,5 g di KH 2 PO 4, 0,5 g di MgSO 4, 4 g di L-asparagina, 2 g di acido citrico, 0,05 g di citrato ferrico di ammonio, 60 ml di glicerolo in 900 ml di acqua. Regolare il pH a 7,0 con NaOH. Autoclave, fresco e appena prima di iniziare l&#39;esperimento, ZnSO 4 aggiungere sterile ad una concentrazione finale di 0,1% w / v Dal 7000 mc 2 è un auxotroph pantotenato questo sforzo richiede anche l&#39;acido pantotenico al 10μg/mL di concentrazione finale. </li></ol> Nota: Questa è una composizione standard dei supporti utilizzati per la Sauton di M. tuberculosis. Tuttavia, se richiesto altri media specializzati possono essere utilizzati anche per altre specie micobatteriche. <ol start="2"><li> Inoculums preparazione: Grow M. tubercolosi in 7H9OADC con 0,05% Tween-80 per una settimana, o OD 600 di 0,7 1,0. Il culture può essere direttamente utilizzata come inoculo in una diluizione 1:100. </li><li> Distribuire 25mL di media Sauton ad un Flacone da 250 ml con tappo a vite di polistirene (Corning). Aggiungere 250μl di inoculo al mezzo, tappo della bottiglia molto strettamente e collocarlo in un indisturbato umidificata a 37 ° C incubatore per 3 settimane. Osservare la bottiglia una volta al giorno per assicurarsi che non vi è alcuna contaminazione. </li><li> Alla fine della terza settimana, svitare il tappo della bottiglia per consentire l&#39;ulteriore crescita di M. tubercolosi all&#39;interfaccia. Se il tappo non è allentato in questa fase quindi la concentrazione di ossigeno insufficiente nel contenitore ritardare l&#39;ulteriore crescita di batteri. </li></ol> 2. La crescita di M. biofilm tubercolosi a 12 pozzetti <ol><li> Preparare la media e inoculo di mc 2 7000, come descritto nelle sezioni A1 e A2. </li><li> Mescolare 60ml di media con 600μl di inoculo. Dispensare 4,5 mL della miscela in ciascun pozzetto della piastra. Coprire la piastra con il coperchio. Avvolgere la piastra più volte con parafilm. Incubare la piastra indisturbato in incubatore umidificato a 37 ° C per 5 settimane. </li></ol> 3. Determinare la frequenza di persistenti droga tolleranti in M. la tubercolosi biofilm <ol><li> Grow M. biofilm tubercolosi nell&#39;arco di 12 pozzetti, come descritto nella sezione B. Questo richiederà un totale di circa 5 settimane. </li><li> Una volta che i biofilm sono maturati (dopo 5 settimane di incubazione) iniettare la vostra scelta di antibiotici a concentrazione desiderata nei media sotto i biofilm utilizzando una micropunta in una pipetta. </li></ol> Nota: Il volume dei supporti sotto le pellicole riduce a circa 3.0mL. Così gli investigatori dovrebbero di conseguenza calcolare la quantità di farmaco. <ol start="3"><li> Agitare delicatamente la piastra in modo che l&#39;antibiotico viene accuratamente diffuso nel mezzo. Per ottenere risultati statisticamente significativi, iniettare il antibioticiotic in quattro pozzi. Parallelamente, iniettare lo stesso volume di solvente in cui l&#39;antibiotico è stato sciolto in altre quattro pozzetti, e lasciare gli ultimi quattro pozzetti della piastra intatto. Coprire la piastra con il coperchio e mettere nuovi strati di parafilm intorno alla piastra. Mettere di nuovo in incubatrice per un periodo di tempo desiderato. </li><li> Al termine dell&#39;incubazione, aprire la piastra e aggiungere Tween-80 alla concentrazione finale dello 0,1% (volume / volume) in ciascuno dei pozzetti. Agitare gentilmente l&#39;intera piastra di dispersione uniforme del detersivo. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 minuti. Mescolare il contenuto di ciascun pozzetto con pipette volte in modo che l&#39;intero contenuto può essere uniformemente trasferiti in un tubo conico 15mL. </li><li> Rallenta il contenuto del tubo a 4000rpm per 10 minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in 5 ml di tampone di lavaggio fresca (PBS con 10% di glicerolo e 0,05% Tween-80). Ripetere il lavaggio tre volte. Risospendere il pellet in 5 ml di tampone di lavaggio. Keep it sul bilanciere per overnight a 4 ° C. </li></ol> Nota: Anche se a bassa temperatura è stato originariamente sviluppato per M. smegmatis (per ridurre al minimo la sua crescita durante la dispersione) e utilizzati per M. tuberculosis pure, le specie a lenta crescita può molto probabilmente essere cullato a temperatura ambiente senza alcun impatto sul risultato. Dondolo a temperatura ambiente può essere necessario se si lavora in BSL-3 struttura. <ol start="6"><li> Preparare una siringa sterile dotato di micropunta (2-200 pl), tagliando la sua estremità ampia per la dimensione appropriata, adattandosi alla siringa e avvolgendolo con parafilm. Passare tutto il contenuto del tubo attraverso la punta attrezzata siringa e raccogliere in un tubo fresco 15ml. Ripetere questo passaggio da 5 a 6 volte fino ad osservare una sospensione abbastanza omogenea. </li><li> Preparare diluizioni seriali della sospensione e le diluizioni piastra sulla piastra 7H11OADC per determinare il numero di colonie vitali in ciascun pozzetto. Incubare le piastre per tre settimane a 37 ° C incubatore. Determinare la frequenficienza di persistenti nella popolazione biofilm calcolando il rapporto tra numero di colonie ottenute nel trattamento antibiotico a quelli ottenuti solvente lastre trattate. </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Quando coltivate in una bottiglia, crescita di M. tuberculosis può essere visto alla base della bottiglia dalla fine della prima settimana. Alla fine della seconda settimana, la crescita di batteri chiazze sulla interfaccia aria-media può essere visto, anche se la crescita all&#39;interfaccia aria-media interfaccia è sempre visibile alla fine della terza settimana (Fig. 1A). In questo momento l&#39;attacco dei batteri alla parete del contenitore è anche osservato. Da questo punto in poi la crescita della coltura avviene principalmente sulla interfaccia aria-media. Il liquido sotto la superficie di crescita è chiara. Tipicamente, la struttura matura dalla fine della quinta settimana (Fig. 1B). Se incubazione è prolungata, le strutture inizierà a depositarsi sul fondo del contenitore. Curiosamente,serraggio del tappo fino alla fine della terza settimana è un passo importante nel processo, e per ragioni sconosciute un loose-flacone con tappo ritarda notevolmente l&#39;inizio della crescita sull&#39;interfaccia 9. Nella 12-pozzetti, uno biofilm robusta all&#39;interfaccia aria-media interfaccia è visto in ciascuno dei pozzetti alla fine di cinque settimane (Fig. 2A). Se le piastre non sono avvolte completamente quindi crescita biofilm differenziale viene osservata. Nel caso peggiore, significativa evaporazione media possono ritardare la crescita dei batteri (Fig. 2B). Così, avvolgimento della piastra è necessaria sia per evitare l&#39;evaporazione e per fornire un ambiente per la formazione di biofilm (vedi paragrafo precedente). Il numero di bacilli vitali in biofilm determinati con questa tecnica è molto riproducibile. Risposta di M. tubercolosi biofilm varia con la natura degli antibiotici. Per un antibiotico battericida, come la rifampicina, perdita di vitalità segue un bipha<html> sic trend 9. Una rapida riduzione della redditività durante i primi tre o quattro giorni seguita da una fase persistente in cui una piccola percentuale della popolazione restano completamente recalcitrante agli antibiotici indipendentemente dalla concentrazione di antibiotico o il tempo di esposizione. La Figura 3 mostra il numero di bacilli vitali in biofilm maturi dopo 7 giorni di esposizione a 50μg/mL (50 volte superiore alla MIC) di rifampicina. <img alt="Figura 1A." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig1A.jpg" /> Figura 1A. Comparsa precoce di M. bacilli tubercolosi sulla interfaccia aria-media di batteri dopo 3 settimane di incubazione. <img alt="Figura 1B." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig1B.jpg" /> Figura 1B. Stagionato biofilm di M. tubercolosi in onda-Media Interface dopo cinque settimane di incubazione. 820/3820fig2A.jpg &quot;/&gt; Figura 2A. 5 settimane biofilm vecchi M. tubercolosi cresciuta in 12-pozzetti. <img alt="Figura 2B." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig2B.jpg" /> Figura 2B. Un tentativo fallito di crescere biofilm M. tuberculosis in 12 pozzetti senza parafilm. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3820/3820fig3.jpg" /> Figura 3. Un grafico rappresentante che mostra la frequenza di persistenti droga tolleranti in M. tubercolosi biofilm cresciuto in 12 pozzetti ed esposte a 50μg/mL di rifampicina per sette giorni.

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</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

La tubercolosi (TB), causata da l&#39;infezione di Mycobacterium tuberculosis, rimane una grave minaccia per la salute pubblica globale. Quasi un terzo della popolazione mondiale è stimata essere asintomatica infettati dal patogeno, circa 9 milioni di nuovi casi appaiono in clinica ogni anno con sintomi di TB attiva e circa 1,7 milioni muoiono di infezione ogni anno 11. L&#39;enorme peso della malattia è principalmente contribuito la mancanza di un vaccino e di una chemioterapia altamente complessa c...

<table><tbody><tr><td>Incubatrice</td><td>VWR international</td><td>Modello # 1923/25</td><td></td></tr><tr><td>Flaconi di coltura in polistirene</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-374-300</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di coltura in tessuto a 12 pozzetti</td><td>VWR international</td><td>62406-165</td><td></td></tr><tr><td>Tubi conici da 50 mL</td><td>VWR international</td><td>89039-660</td><td></td></tr><tr><td>Rocker</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>57019-662</td><td></td></tr><tr><td>Refrigeratore cromatografico</td><td>VWR international</td><td>55702-520</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri</td><td>VWR international</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (monobasico)</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1565-1</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>L-asparagina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4284-100G</td><td></td></tr><tr><td>acido citrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1857-100G</td><td></td></tr><tr><td>citrato ferrico ammonico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5879-100G</td><td></td></tr><tr><td>glicerolo</td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z4750-500G</td><td></td></tr><tr><td>acido D-pantotenico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2250-25G</td><td></td></tr><tr><td>Difco Middlebrook 7H9 Broth</td><td>BD Biosciences</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Arricchimento Middlebrook OADC</td><td>BBL</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164-500</td><td></td></tr><tr><td>Flacone da 250 mL per conservazione</td><td>Corning</td><td>430281</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 12 pozzetti</td><td>Falcon BD</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>rifampicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501-1G</td><td></td></tr><tr><td>metanolo</td><td>JT Baker</td><td>9070-05</td><td></td></tr><tr><td>siringa da 10 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>Punte per pipetta da 1-200&amp;mu;L</td><td>VWR international</td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>VWR international</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Tubo da centrifuga da 15 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188-285</td><td></td></tr><tr><td>Difco Mycobacteria 7H11 Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>283810</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (dibasico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

crescita mycobacterium tuberculosis i biofilm

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, l&#39;agente eziologico della tubercolosi umana, ha una straordinaria capacità di sopravvivere contro gli stress ambientali, compresi gli antibiotici. Sebbene la tolleranza allo stress di M. la tubercolosi è uno dei contributori probabili a 6 mesi di chemioterapia lunga serie di tubercolosi 1, i meccanismi molecolari alla base di questo fenotipo caratteristico del patogeno rimangono poco chiari. Molte specie microbiche sono evoluti per sopravvivere in ambienti stressanti con l&#39;auto-assemblaggio in altamente organizzato, superficie attaccata, e matrice di strutture incapsulate chiamata biofilm 2-4. La crescita nelle comunità sembra essere una strategia di sopravvivenza preferito di microbi, e si ottiene attraverso componenti genetiche che regolano la superficie di applicazione, le comunicazioni intercellulari, e la sintesi di sostanze polimeriche extracellulari (EPS) 5,6. La tolleranza allo stress ambientale è probabilmente facilitata da EPS, e forse dal fisiologicoadattamento gico di bacilli individuale microambienti eterogenei all&#39;interno della complessa architettura dei biofilm 7. In una serie di lavori recenti abbiamo stabilito che M. smegmatis Mycobacterium tuberculosis e hanno una forte propensione a crescere in strutture organizzate pluricellulari, chiamata biofilm, che può tollerare più di 50 volte le concentrazioni minime inibenti dei farmaci antitubercolari isoniazide e rifampicina 8-10. M. la tubercolosi, però, richiede intrigante condizioni specifiche per formare biofilm maturi, in particolare il rapporto di 9:01: spazio di testa dei media così come limitato scambio d&#39;aria con l&#39;atmosfera 9. Requisiti di specializzati condizioni ambientali potrebbe essere legato al fatto che M. la tubercolosi è un patogeno obbligato umana e quindi si è adattata agli ambienti dei tessuti. In questa pubblicazione si dimostra metodi di coltura M. tubercolosibiofilm in una bottiglia e un 12-pozzetti piastra, che è conveniente per studi batteriologici nonché genetica. Abbiamo descritto il protocollo per un ceppo attenuato di M. la tubercolosi, mc 2 7000, con l&#39;eliminazione nei due loci, i panCD e RD1, che sono fondamentali per la crescita del patogeno vivo 9. Questo ceppo può essere tranquillamente utilizzato in un BSL-2 di contenimento per la comprensione della biologia di base del patogeno della tubercolosi evitando così l&#39;esigenza di un costoso impianto di BSL-3. Il metodo può essere esteso, con le opportune modifiche in media, a crescere biofilm di altre specie coltivabili micobatteri. Nel complesso, un protocollo uniforme di biofilm coltura dei micobatteri aiuterà i ricercatori interessati a studiare le caratteristiche di base di micobatteri resistenti. Inoltre, un metodo chiaro e conciso di biofilm che crescono micobatteriche aiuterà anche i inv clinico e farmaceuticoestigators per testare l&#39;efficacia di un potenziale farmaco.

Mycobacterium tuberculosis forma biofilm droga tolleranti, quando coltivate in determinate condizioni. Qui si descrivono i metodi per la coltura M. biofilm tubercolosi e che determinano la frequenza di persistenti droga tolleranti. Questi protocolli saranno utili per ulteriori studi sui meccanismi di tolleranza al farmaco in M. tubercolosi.

Crescita Mycobacterium tuberculosis I biofilm

*Mycobacterium tuberculosis*, l'agente eziologico della tubercolosi umana, possiede una straordinaria capacità di sopravvivere a stress ambientali, tra cui...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un metodo per coltivare biofilm di M. tuberculosis all'interfaccia aria-mezzo, e determinare la frequenza di batteri tolleranti ai farmaci presenti nei biofilm. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto il mezzo e l'inoculo appropriati. Il secondo passaggio consiste nella coltivazione di biofilm di M. tuberculosis in piastre da 12 pozzi.Quindi viene aggiunto un antibiotico di prova a una concentrazione desiderata e si determina la frequenza dei persisters tolleranti ai farmaci. In *M. tuberculosis*, i biofilm possono essere determinati. In ultima analisi, la tecnica può essere sfruttata per comprendere le basi dello sviluppo del biofilm e decifrare i meccanismi di tolleranza ai farmaci in *M. tuberculosis*. Il vantaggio principale della coltura di biofilm *in vitro* di *M. tuberculosis* in un mezzo privo di detergenti è che la crescita spontanea dell'architettura multicellulare complessa del ceppo di riferimento rivela proprietà uniche dell'organismo non osservabili in colture planctoniche.Questi includono l'adesione alla superficie, le interazioni intercellulari, la sintesi della matrice accessoria e l'adattamento fisiologico all'interno del microambiente eterogeneo di questa struttura. In particolare, queste informazioni saranno altamente rilevanti per comprendere le basi della persistenza di M. tuberculosis in nicchie specializzate come le cavità, dove è probabile che una crescita esuberante di basi in un ambiente accessorio avvenga all'interno di strutture multicellulari. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso una terapia più breve della tubercolosi, poiché l'identificazione e il targeting dei fattori associati ai biofilm potrebbero ridurre la frequenza di sottopopolazioni tolleranti ai farmaci nei biofilm.In questo protocollo, viene utilizzata una composizione standard del mezzo soans per la coltivazione di M tuberculosis. Tuttavia, quando si coltivano biofilm di altre specie micobatteriche, utilizzare i rispettivi mezzi specializzati appropriati, preparare l'inoculo primario di M tuberculosis in bottiglie di plastica da 125 millilitri contenenti 15 millilitri di mezzo liquido.Entre 80 e la crescita. Le colture in condizioni standard fino a quando il loro OD 600 è compreso tra 0,7 e 1,0, il che richiede circa una settimana. A questa densità, la coltura può essere utilizzata direttamente come incolo in un rapporto di diluizione di uno a 100. Una volta preparato l'incolo, aggiungere 600 microlitri a 60 millilitri di mezzo Sawtons.Dopo aver mescolato delicatamente l'inoculo nel mezzo, distribuire 4,5 millilitri della miscela in ogni pozzetto di una piastra a 12 pozzetti, coprire la piastra e avvolgerla più volte con parafilm. Quindi incubare la piastra in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius.Dopo cinque settimane di crescita indisturbata, procedere con il test per i batteri persistenti tolleranti ai farmaci. Dopo cinque settimane di maturazione, il volume del mezzo si sarà ridotto a circa tre millilitri per pozzetto in quattro pozzetti. Iniettare un antibiotico di interesse appena al di sotto del biofilm, nel mezzo.Quattro altri pozzetti devono essere inoculati con il solo solvente e gli ultimi quattro pozzetti devono essere lasciati liberi. Questo fornisce un'adeguata robustezza statistica e i controlli appropriati gonfiano delicatamente la piastra in modo che l'antibiotico si diffonda completamente nel mezzo. Ora coprire la piastra.Aggiungere strati freschi di paraformaldeide intorno alla piastra e incubare la piastra per un periodo compreso tra uno e sette giorni, in base all'esperimento. Al termine dell'incubazione, aggiungere Tween 80 a ciascun pozzetto. Scuotere delicatamente l'intera piastra per distribuire in modo uniforme il detergente.Quindi incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo 15 minuti, utilizzare una pipetta per mescolare il contenuto di ogni pozzetto fino a ottenere una soluzione omogenea. Successivamente, trasferire la coltura in un tubo conico da 15 millilitri.Centrifugare il tubo conico e risospendere. Sospendere il pellet in cinque millilitri di tampone di lavaggio fresco, centrifugare e risospendere. Sospendere le cellule nel tampone di lavaggio altre tre volte.Quindi mantenere le cellule nel buffer di lavaggio tutta la notte su un agitatore in una stanza fredda. Sebbene la bassa temperatura sia stata inizialmente sviluppata per il magmatico EMS per minimizzare la sua crescita durante la dispersione e l'uso per M tuberculosis. Le specie a crescita lenta possono molto probabilmente essere agitate a temperatura ambiente senza alcun impatto sui risultati.Agitare a temperatura ambiente potrebbe essere necessario se si lavora in un impianto di livello di sicurezza biologica tre. Il giorno successivo, preparare una siringa per omogeneizzare e trasferire. Ogni sospensione richiede un puntale per micropipetta adattato a una siringa sterile. Tagliare la parte larga del puntale alla dimensione appropriata, collegarlo alla siringa e avvolgere il giunto con pellicola parafilm.Filtrare la sospensione cellulare fredda attraverso la siringa dotata di ago e versare il contenuto in un tubo conico pulito da 15 millilitri. Ripetere questo passaggio da cinque a sei volte, sostituendo continuamente il tubo, fino a quando la sospensione appare molto omogenea. Preparare ora delle diluizioni seriali di ciascuna sospensione e seminare ogni diluizione su una piastra di agar.Dopo aver incubato le piastre per tre settimane, determinare la frequenza dei batteri persistenti nella popolazione del biofilm confrontando il numero di colonie sulle piastre trattate con antibiotico e sulle piastre di controllo. Quando coltivato in una bottiglia, durante la prima settimana il M. tuberculosis è cresciuto alla base della bottiglia.Al termine della seconda settimana è stata osservata una crescita discontinua di batteri all'interfaccia aria-mezzo, che è diventata ancora più evidente alla fine della terza settimana. È stato inoltre osservato l'attacco dei batteri alla parete del contenitore, e la crescita della coltura si è verificata principalmente all'interfaccia aria-mezzo. Il liquido al di sotto della crescita superficiale era limpido.Entro la fine della quinta settimana, la struttura si era completamente maturata. In un formato a 12 pozzetti dopo cinque settimane di incubazione, un biofilm robusto all'interfaccia aria-mezzo di coltura era visibile in ciascun pozzetto sui piatti che non erano stati completamente avvolti. È stata osservata una crescita differenziale del biofilm, nonché un'evaporazione significativa del mezzo di coltura.La crescita batterica su queste piastre è stata bloccata. Il numero di bacilli vitali nei biofilm era piuttosto riproducibile e variava in base ai diversi antibiotici. Ad esempio, in presenza di rifampicina, un antibiotico battericida, si è osservato un rapido calo della vitalità durante i primi tre-quattro giorni, seguito da una fase persistente in cui una piccola percentuale della popolazione rimane completamente refrattaria agli antibiotici, indipendentemente dalla concentrazione dell'antibiotico o dal tempo di esposizione.La stessa procedura può essere utilizzata nel screening di mutanti al fine di identificare geni coinvolti nell'adesione di Mycobacterium tuberculosis alla superficie del biofilm, nella crescita batterica all'interfaccia e nella maturazione di Pecos. Non dimenticare che lavorare con M. tuberculosis può essere estremamente pericoloso e che precauzioni, come l'utilizzo di contenimenti di livello di sicurezza biologica tre, devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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