Misura di attività del Fattore V nel plasma umano usando un saggio di coagulazione Microplate

L'obiettivo generale della seguente procedura era quello di sviluppare un test su micropiastra che misurasse l'attività di un fattore V proteico della coagulazione durante la formazione di un coagulo di fibrina nel plasma umano. In risposta alla lesione, il processo di coagulazione del sangue viene attivato e si traduce in una serie di reazioni di conversione da ximogeno a proteasi che alla fine portano alla generazione dell'enzima di coagulazione trombina, le cleves di trombina il fibrinogeno solubile in monomeri di fibrina, che poi si associano per formare un coagulo di fibrina insolubile. Normalmente, il sangue rimane come un liquido che scorre liberamente durante lo stato sano o illeso e la quantità di fibrina formata è uguale alla quantità di fibrina degradata o scomposta.

Tuttavia, in alcune situazioni di malattia, troppa coagulazione porta a malattie cardiache e ictus, mentre una coagulazione insufficiente porta a tendenze emorragiche, che sono spesso osservate nelle emofilie. Il fattore V è una proteina nel plasma che nella sua forma attivata fattore cinque A è un acceleratore critico della generazione di trombina durante la formazione del coagulo di fibrina come parte del complesso enzimatico della protrombina, la protrombina è composta da quattro componenti fattore 10 A, il fattore proteasi cinque A, il cofattore lipidico, la superficie e il calcio. Il fattore meline cinque A aumenta l'efficienza catalitica o kcat del fattore 10 A verso il suo substrato protrombina di circa 3000 volte, migliorando così profondamente la generazione di trombina e la formazione di coaguli di fibrina.

La piattaforma per micropiastre è preferita per misurare gli eventi catalizzati da enzimi a causa della praticità, del costo in termini di tempo, dei piccoli volumi di campioni, del monitoraggio continuo e dell'elevata produttività. L'evento di formazione del coagulo di fibrina può essere monitorato con un lettore di micropiastre misurando l'aumento dell'assorbanza luminosa del plasma quando passa da un aspetto giallo chiaro senza coagulo di fibrina presente e un'assorbanza luminosa minima a un aspetto opaco e torbido con un coagulo di fibrina e massima assorbanza della luce. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i saggi manuali con tubo inclinabile o i saggi con analizzatori automatici, sono che il metodo è veloce, economico, ha requisiti di volume di campione ridotto e ha un'elevata produttività.

Il test misura l'attività del fattore cinque attivato non intenzionalmente e attivato dalla trombina per ottenere una valutazione quantitativa completa della sua attività funzionale totale. A dimostrare questa tecnica sarà Derek Tilley, uno studente del master in laboratorio. Al fine di misurare l'attività del fattore cinque in un campione di plasma, è necessario costruire l'attività del fattore cinque in uno stadio, le curve standard del tempo di formazione del coagulo di fibrina nel pannello A e il tasso iniziale di formazione del coagulo di fibrina nel pannello B utilizzando il plasma umano normale o NHP come standard che contiene per definizione un'unità di attività del fattore cinque per ML scongelare il plasma carente del fattore cinque, plasma umano normale e campioni di plasma sconosciuto e tromboplastina a 37 gradi per 10 minuti.

Mescolare delicatamente il plasma carente di fattore cinque e il trasferimento della plastica per separare i vassoi di lavaggio in plastica e incubare su ghiaccio. Conservare il normale plasma umano e campionare il plasma sconosciuto su ghiaccio dopo aver mescolato delicatamente. Conservare il cloruro di calcio 25 millimolare in acqua distillata in un vassoio di lavaggio separato a temperatura ambiente per il fattore cinque uno Curve standard di attività dello stadio.

Preparare 200 microlitri ciascuno di doppia diluizione seriale di plasma umano normale da 0, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 1, 28, 2, 56 e 512 volte in HBS pH 7,4 utilizzando provette per microcentrifuga da 1,5 ml, agitare bene e incubare su ghiaccio. Per le incognite del campione di plasma, preparare 200 microlitri ciascuna di diluizioni di 40 volte di plasma umano normale e plasma campione sconosciuto in HBS pH 7,4 utilizzando provette per microcentrifuga da 1,5 ML. Posizionare cinque strisce di micropozzetti nel supporto della sagoma del lettore di micropiastre.

Accendere il lettore di micropiastre e accedere al software applicativo per micropiastre Softmax Pro utilizzando una pipetta multicanale. Effettuare aggiunte simultanee di 50 microlitri di plasma carente di fattore cinque a tutti i pozzetti della micropiastra del campione utilizzando una singola pipetta, aggiungere 50 microlitri delle 10 diluizioni seriali preparate del plasma umano normale e le diluizioni 40 volte del plasma umano normale e del plasma del campione sconosciuto per separare i pozzetti della MICROPIASTRA utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 50 microlitri di plastica del trombo a tutti i pozzetti del campione. Incubare nel lettore di micropiastre a 25 gradi Celsius per un minuto agitando durante i 15-25 secondi dell'incubazione di un minuto.

Utilizzando il computer interfacciato con il lettore MICROPLATE, accedere al software applicativo Softmax Pro Microplate. Impostare il lettore di micropiastre sulla lunghezza d'onda di assorbanza a 405 nanometri in modalità di temperatura cinetica a 25 gradi Celsius e programmare il lettore di micropiastre in modo che agiti per i primi cinque secondi dopo l'aggiunta di cloruro di calcio e misurare l'assorbanza a 405 nanometri ogni cinque secondi per sei minuti. Successivamente, l'intervallo di agitazione di cinque secondi non è incluso nei tempi di coagulazione calcolati utilizzando due pipette multicanale che aggiungono contemporaneamente 50 microlitri di cloruro di calcio alle due strisce per micropiastre con i campioni.

Attendere 15 secondi e premere immediatamente l'icona di avvio in Softmax Pro dal computer per iniziare il test. Per ogni campione di plasma analizzato, il tempo di formazione del coagulo è determinato e definito come il tempo in secondi per raggiungere la metà dell'aumento massimo dell'assorbanza. Il tasso iniziale di formazione del coagulo è definito come il tasso di aumento dell'assorbanza nei primi cinque punti temporali della porzione lineare dell'aumento dell'assorbanza rispetto al tempo.

L'entità della formazione di coaguli è definita come la differenza tra l'assorbenza massima e minima raggiunta durante l'evento di formazione del coagulo alla fine della corsa. Utilizzare i profili ASSORBENZA rispetto al tempo di Softmax Pro per determinare il tempo, la velocità iniziale e l'entità della formazione di coaguli per la diluizione seriale del plasma umano normale. Per costruire le curve standard di attività di uno stadio del fattore V, utilizzare i tempi di coagulazione per il plasma umano normale diluito 40 volte e il plasma campione incogniti per interpolare l'attività del fattore cinque in unità per mulino dalla curva standard di attività di uno stadio del fattore cinque.

Questo rappresenta il fattore cinque di attività in uno stadio o quello senza attivazione intenzionale da parte della trombina. Questo è un esempio rappresentativo della formazione di coaguli di fibrina nel saggio del fattore cinque nel tempo generato dal lettore di micropiastre. Il profilo rappresenta la formazione di coaguli di fibrina utilizzando plasma umano normale diluito 32 volte in una singola micropiastra.

Bene, l'asse verticale denota la variazione dell'assorbente a 405 nanometri che si è verificata a seguito della formazione di coaguli di fibrina. Il tempo di formazione del coagulo è stato calcolato come il punto medio della curva dell'assorbanza rispetto al tempo, 36,4 secondi. Il tasso iniziale di formazione del coagulo è stato calcolato in 611,88 milliunità al minuto.

L'entità della formazione delle nuvole è stata calcolata in 0,35 unità. Il test del fattore cinque misura con precisione il tempo, il tasso iniziale e l'entità della formazione delle nuvole. L'ispezione dei pozzetti al termine del saggio ha confermato che si è verificata la formazione di coaguli.

Tutte le reazioni hanno raggiunto approssimativamente la stessa estensione di CloudFormation con una variazione generale dell'assorbanza a 405 nanometri compresa tra 0,35 e 0,45 unità tra l'assorbanza iniziale prima e l'assorbanza massima dopo la termoplastica e il cloruro di calcio. Addizione sono esempi rappresentativi dell'attività del fattore cinque in uno stadio, della curva standard del tempo di coagulazione in secondi rispetto all'attività del fattore cinque in unità per mil e del tasso iniziale di formazione dell'unghia in milli unità al minuto rispetto al fattore cinque. L'attività in unità per mil per il plasma umano normale è mostrata rispettivamente nel pannello A e nel pannello B.

Poiché il fattore cinque è normalmente attivato con trombina. Il coefficiente attivo del fattore cinque A, un secondo test dopo l'aggiunta e l'incubazione con trombina, è fondamentale per misurare con precisione l'attività del fattore cinque in due fasi di un campione di plasma con attivazione intenzionale mediante aggiunta di trombina per il test del fattore cinque in due stadi. Preparare da 200 a 300 microlitri di trombina purificata alla sua concentrazione finale di cento nanomolari in HBS pH 7.4 e incubare su ghiaccio, diluire 120 microlitri del plasma umano sopra il normale e campionare i plasmi da 40 a 100 volte con 170 microlitri di HBS pH 7.4 contenente 2,8 millimolari.

cloruro di calcio. Aggiungere 10 microlitri di trombina per ottenere una concentrazione finale di 10 nanomolari a ciascun campione. Vortice. Bene da miscelare e incubare a 37 gradi Per un minuto, diluire il plasma umano normale e campionare il plasma a 500 volte aggiungendo 400 microlitri di HBS pH 7.4.

Determinare il tempo di coagulazione per il plasma umano normale in ciascuno dei campioni di plasma sconosciuto dal profilo di assorbanza rispetto al tempo in soft max Pro. Tenendo conto della diluizione di 500 volte, utilizzare il tempo di coagulazione per ciascun campione per calcolare il fattore cinque di due stadi di attività dal fattore cinque una curva standard del tempo di coagulazione rispetto all'attività. Questo rappresenta il fattore cinque di attività a due stadi o quello con attivazione intenzionale da parte della trombina.

L'attività totale del fattore cinque può quindi essere calcolata come il fattore cinque attività a due stadi meno il fattore cinque a uno stadio di attività. La curva standard del tempo logaritmico del coagulo rispetto all'attività del fattore cinque è stata utilizzata per misurare l'attività del fattore cinque nel plasma umano normale e nei plasmi di nove pazienti con coagulazione intravascolare disseminata o CID, tutti e nove i pazienti con CID. Ha mostrato attività del fattore cinque in uno stadio e tassi iniziali di formazione di coaguli che sono diminuiti in media del 54 e del 18%Il fattore cinque in due stadi e l'attività totale sono diminuiti in media nei pazienti con CID del 44 e del 42% rispetto al plasma umano normale.

Il fattore cinque e i pazienti con CID hanno provocato un tempo prolungato e una diminuzione del tasso di formazione di coaguli di fibre. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di come implementare questo metodo nel tuo laboratorio. Il metodo può essere facilmente adattato per misurare l'attività di qualsiasi fattore di coagulazione nel plasma, rendendolo adatto a un'ampia gamma di applicazioni cliniche e di ricerca.

In definitiva, queste informazioni sul fattore V avranno un impatto positivo sugli ambienti sanitari attraverso la diagnosi precoce e il trattamento di disturbi trombotici o emorragici come la CID.