Single-cell Profiling dei neuroni retinici maturi e in sviluppo

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare singole cellule per l'analisi del trascrittoma basata su microarray. Questo viene ottenuto dapprima dissezionando la retina dal tessuto circostante e successivamente dissociandola in singole cellule. Il secondo passaggio consiste nel raccogliere singole cellule e depositarle in provette PCR contenenti tampone di lisi.

Quindi le cellule vengono lisate e il cDNA viene amplificato mediante trascrizione inversa, seguita da reazione a catena della polimerasi. Infine, l'ibridazione del cDNA di una singola cellula su un microarray A iMatrix viene utilizzata per rivelare gli mRNA espressi in una singola cellula. Il vantaggio principale del profilo dell'espressione genica a livello di singola cellula rispetto agli approcci su tessuto intero è che l'isolamento di singole cellule consente di accedere a popolazioni cellulari molto ridotte che altrimenti sarebbero incluse nell'intero tessuto.

Queste cellule possono essere di diversi tipi, dai vari tipi di neuroni a piccole popolazioni di cellule staminali. La tecnica della singola cellula ci consente di identificare sia i tipi cellulari, sia marcatori specifici per queste piccole popolazioni di cellule, nonché di individuare le reti geniche espresse in questi sottoinsiemi estremamente rari di cellule. Inoltre, la tecnica di profilazione della singola cellula ci permette di identificare le reti geniche espresse in modo transitorio durante transizioni di sviluppo altamente dinamiche in sottoinsiemi molto piccoli di cellule.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della genetica dello sviluppo, ad esempio quando le cellule progenitrici iniziano ad esprimere reti geniche associate alla differenziazione e in che modo tali cellule progenitrici differiscono tra loro. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alle terapie cellulari per malattie neurodegenerative come il glaucoma, poiché chiarificando le reti chiave nello sviluppo delle singole cellule ci avviciniamo di un passo alla possibilità di generare tali cellule per l'uso nella terapia di sostituzione cellulare. Iniziare questa procedura posizionando la retina del topo in una piastra riempita con PBS.

Successivamente, rimuovere l'umor vitreo e il cristallino. Quindi rimuovere tutto l'epitelio pigmentato retinico. Incubare la retina in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri a 37 gradi Celsius per 10 minuti.

In seguito, battere leggermente sul tubo per staccare eventuali cellule sedimentate. Quindi aspirare e rilasciare delicatamente 10-20 volte con una pipetta P1000. Se persistono grossi aggregati di tessuto, incubare per altri 10 minuti a 37 gradi Celsius e quindi aspirare e rilasciare nuovamente 10-20 volte.

Successivamente, aggiungere cinque microlitri di DNA, uno a 10 unità per microlitro, alla retina e incubare per cinque minuti. A temperatura ambiente, agitare delicatamente con la pipetta P 1000 per altre 10-20 volte. Centrifugare a 3000 giri al minuto per tre minuti.

Quindi rimuovere il soprannatante e lasciare 100-200 microlitri di liquido sul fondo. Toccare delicatamente il tubo per staccare il pellet. Successivamente, aggiungere un millilitro di HBSS e risospendere il pellet con un'agitazione delicata.

Centrifugare a 3000 giri al minuto per tre minuti. Al termine, rimuovere con attenzione il soprannatante. Successivamente, risospendere in 450 microlitri di PBS contenente lo 0,1% di BSA; nel passaggio successivo, preparare due piastre da sei centimetri contenenti cinque millilitri di PBS integrato con lo 0,1% di BSA.

Piastrare successivamente le cellule dissociate in una piastra. Lasciare sedimentare le cellule per almeno cinque minuti. Successivamente, posizionare la piastra con le cellule dissociate sotto un microscopio invertito.

Utilizzare una pipetta a punta fine con un tubo aspiratore per raccogliere una singola cellula. Avvicinare quindi la micropipetta alla cellula, che entrerà facilmente nella micropipetta grazie all'azione capillare. Successivamente, espellere la cellula su una seconda piastra e assicurarsi che venga raccolta una sola cellula per il profilo dell'espressione genica.

Questo viene fatto rimuovendo cellule estranee oppure spostando la cellula di interesse in una posizione diversa mediante una nuova micropipetta. Quando una singola cellula è completamente isolata dalle cellule adiacenti, utilizzare una nuova micropipetta per aspirare la cellula di interesse. Successivamente, espellerla direttamente in una provetta PCR da 0,2 millilitri contenente 4,5 microlitri di tampone per la lisi cellulare.

Centrifugare brevemente il campione in una microcentrifuga per immergere la cellula nel buffer di lisi. Eseguire questa centrifugazione dopo ogni quinta cellula e nuovamente alla fine della raccolta. Ricordare di mantenere la provetta sul ghiaccio per tutta la durata dell'isolamento delle singole cellule e di raccogliere le cellule singole entro una finestra di due ore dalla dissociazione per ottenere risultati ottimali in questo protocollo; centrifugare brevemente il campione in una microcentrifuga per assicurare che la singola cellula sia completamente immersa nel buffer di lisi cellulare.

Per favorire la lisi cellulare, incubare il campione a 70 gradi Celsius per 90 secondi in un termociclatore. Successivamente, riporre immediatamente il tubo sul ghiaccio per due minuti. Per eseguire la trascrizione inversa, aggiungere 0,33 microlitri.

Superscript tre a 200 unità per microlitro, 0,05 microlitri di inibitore a 40 unità per microlitro e 0,07 microlitri. Proteina T quattro gene 32 nel tubo. Incubare la miscela di reazione per 50 minuti a 50 gradi Celsius in un termociclatore; dopo 50 minuti, inattivare l'enzima a 70 gradi Celsius per altri 15 minuti.

Una volta terminato, riporre il tubo sul ghiaccio. Per rimuovere l'innesco libero, aggiungere 0,1 microlitri di tampone 10x per esonucleasi, 0,8 microlitri di H2O e 0,1 microlitri di esonucleasi, 1 a 20 unità per microlitro, nel tubo, quindi incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti in un termociclatore.

Dopo 30 minuti, inattivare l'enzima incubando la miscela di reazione a 80 gradi Celsius per 25 minuti. Alla fine, riporre il tubo sul ghiaccio. Successivamente, aggiungere sei microlitri della miscela di reazione di coda al campione.

Incubare in termociclatore a 37 gradi Celsius per 20 minuti, a 70 gradi Celsius per 10 minuti, quindi mantenere a quattro gradi Celsius. Successivamente, aggiungere 10 microlitri del campione con coda alla miscela di reazione PCR. Eseguire la sintesi del secondo filamento e l'amplificazione PCR per etichettare il CDNA.

Per ottenere un'ibridazione robusta su microarray iMatrix, frammentare prima il CD NA aggiungendo da 10 a 20 microlitri di CD NA monocellulare a otto microlitri di buffer uno x uno per tutti. Quindi aggiungere un microlitro di questo DNA diluito a una soluzione di reazione da 80 microlitri. Successivamente, aggiungere 20 microlitri di buffer cinque XTDT, 2,5 microlitri di biotina e sei D-D-A-T-P e un microlitro di TDT diluito.

Successivamente, aggiungere 20 microlitri di buffer XTDT, 2,5 microlitri di biotina, sei D-D-A-T-P e un microlitro di TDT. Incubare la miscela per 90 minuti a 37 gradi Celsius. Poi per cinque minuti a 65 gradi Celsius.

Successivamente, conservarlo a meno 20 gradi Celsius oppure ibridizzarlo immediatamente a un microarray a iMatrix. Di seguito è riportato un esempio rappresentativo di strisci di CD NA di singola cellula e corsie di PCR specifiche per geni: le corsie A-F-G-N-H contengono strisci di CD NA robusti, mentre le corsie B, C, D ed E sono notevolmente meno robuste. I CDNA sono stati isolati da cellule gangliari retiniche fluorescenti e successivamente analizzati mediante primer di PCR specifici per i marcatori delle cellule gangliari retiniche, BRN tre B e PAC sei, e PCR specifica per il marcatore dei fotorecettori.

CRX è stato utilizzato per determinare il livello di contaminazione nella singola cellula. Le cdNA e i sottoinsiemi di cellule gangliari retiniche sono stati identificati mediante screening per la presenza del gene tachykinin one. I risultati dell'analisi con microarray per geni selezionati espressi in 22 singole cellule distinte sono mostrati in un formato di mappa termica.

Le intensità dei segnali provenienti dal microarray sono state scalate in modo da corrispondere all'intensità del colore rosso, mentre il nero indica l'assenza di segnale sul microarray. Seguendo questa procedura, ulteriori metodi come la QPCR possono essere utilizzati per confermare il profilo di espressione genica osservato nel microarray. I risultati dell'ibridazione in C possono inoltre essere utilizzati per rispondere ad altre domande riguardanti la localizzazione delle cellule che esprimono geni specifici.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'idea abbastanza chiara di come dissociare le retine, isolare singole cellule e generare cDNA da queste singole cellule, per l'ibridazione su microarray.