Name: Single-cell Profiling dei neuroni retinici maturi e in sviluppo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Impara il profilo di espressione genica in singole cellule retiniche per studiare l'eterogeneità cellulare e identificare marcatori di popolazioni rare. Questo metodo consente di analizzare reti geniche transienti durante lo sviluppo neuronale.

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1. Dissociazione cellulare <ol><li> Un diagramma di flusso che illustra il protocollo viene mostrata è Figura 1. Per i numeri di catalogo dei particolari reagenti usati in questo protocollo, si prega di fare riferimento alla Tabella 1. Sezionare la retina in un bagno PBS. Durante la dissezione, è preferibile rimuovere il vitreo e la lente dal tenendoli con la retina può impedire la dissociazione. Non è sempre di fondamentale importanza per rimuovere tutto l&#39;epitelio pigmentato retinico (RPE) e in alcuni casi può essere impossibile rimuoverla completamente. Tuttavia, per esperimenti singoli profili cellule di fotorecettori, la RPE deve essere rimosso. La mancata rimozione della RPE può portare alla contaminazione dei profili della cellula a bastoncello con RPE geni espressi. Questo è presumibilmente dovuto al collegamento tra i fotorecettori e dell&#39;epitelio pigmentato. Per la dissociazione, interi retine adulti murini sono incubate a 37 ° C per 10 min in una provetta da 1,5 ml contenente 20microlitri attivato papaina, 20 pl cisteina 25 mM a 5 mM EDTA, e 360 ​​microlitri di Hank soluzione salina bilanciata (HBSS) supplementato con 10 mM di HEPES. Col filtro puntali vengono utilizzati per tutte le fasi di tutto il protocollo per minimizzare la contaminazione potenziale. La concentrazione papaina e il tempo di incubazione varierà a seconda dell&#39;età e la natura del tessuto. Ad esempio, per dissociare sviluppo retine isolato al giorno postnatale 0 (P0), incubare la retina in 10 pl attivato papaina, 10 pl 25 cisteina mM a 5 mM EDTA, e 380 microlitri di Hank soluzione salina bilanciata (HBSS) supplementato con 10 mM di HEPES per 10 min a 37 ° C. Retine di specie diverse anche esigere condizioni leggermente diverse. Retine di pollo sono più sottili di retina di topo alla maggior parte delle fasi di sviluppo. Utilizzo di 10 pl attivato papaina, 10 microlitri 25 mM cisteina in 5 mM EDTA, e soluzione salina bilanciata di 380 pl di Hank (HBSS) supplementato con 10 mM di HEPES per 5 min a 37 ° C è sufficiente per dissociare these retine. </li><li> Battere delicatamente il tubo per rimuovere tutte le cellule si stabilirono, quindi triturare delicatamente 10-20 volte con una pipetta P1000. Incubare per altri 10 min a 37 ° C se si osservano grandi di tessuto persistono e poi ri-triturare 10-20 volte. </li><li> Aggiungere 5 pl di DNasi I (10 U / pl) e incubare per 5 min a temperatura ambiente. Triturare delicatamente con una pipetta P1000. Il numero esatto di volte che dovrà essere determinata in modo empirico, ma cade in genere tra i 10-20. </li><li> Centrifugare in un tavolo centrifugare a 3000 rpm per 3 min Rimuovere il surnatante, lasciando 100-200 ul di liquido sul fondo, e toccare il tubo per rimuovere il pellet. Aggiungere 1 ml di HBSS e risospendere il pellet con la triturazione gentile. Toccando il tubo è fondamentale qui semplicemente come risospendere il pellet con molti lisi delle cellule retiniche. Ciò è vero soprattutto con adulti retine murine. </li><li> Centrifugare a 3000 rpm per 3 min Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere in 450 microlitri di PBS contieneING BSA 0,1%. È importante rimuovere la maggior quantità di supernatante possibile per minimizzare la presenza di mRNA da cellule lisate e altri prodotti dalla dissociazione che potrebbe inibire reazioni future. </li></ol> 2. Raccolta di cellule singole <ol><li> Preparare due piatti 6 cm contenenti 5 ml di PBS supplementato con 0,1% BSA. Piastra di cellule dissociate su un piatto e consentono alle cellule di riposare per almeno 5 min. La densità cellulare usata dipende molto dalla natura delle singole celle essendo profilati. Ad esempio, per le celle molto rari marcate con un marcatore fluorescente tale GFP, intere retine dissociate sono piastrate su un piatto unico 6 cm. Per le celle che sono un po &#39;più abbondante, meno cellule vengono piastrate inizialmente per rendere più facile il raccolto uno (o molto vicino a uno) cella con la prima micropipetta. </li><li> Porre la piastra di cellule dissociate su un microscopio invertito. Usiamo l&#39;IMT-2 modello da Olympus. Utilizzo di micropipette che sono stati attirati da una fiNE punta (diametro interno 0,5 mm, diametro esterno 1,04 millimetri) (Figura 2) e con un tubo aspiratore, raccogliere una singola cella. Le cellule facilmente entrare nella micropipetta quando è posto vicino a loro sul piatto. E &#39;fondamentale che il tubo di aspirazione non è né troppo lungo né troppo corto per la distanza alla fase associata al microscopio invertito (I tubi aspiratori che usiamo con il nostro microscopio invertito sono 38,1 cm di lunghezza). Se il tubo è troppo lungo, le cellule non può essere espulso in modo efficiente dal micropipetta nel tubo di raccolta. La ragione principale che usiamo il vecchio modello IMT-2 microscopio invertito è che abbiamo trovato è la distanza ideale per la fase di tubi aspiratori nostra assemblea. Dopo aver inserito la micropipetta, la cella (o celle) viene espulso su una seconda piastra (piastra lavaggio) per assicurare che uno e solo una cella viene raccolto per profili di espressione genica. Sulla seconda piastra è spesso necessario rimuovere o cellule estranee con una micropipetta nuovao spostare la cella di interesse in una posizione diversa per assicurare che solo una singola cellula entra micropipetta. </li><li> Quando una singola cella è completamente isolato da cellule vicine, utilizzare una micropipetta nuovo per aspirare la cella di interesse come al punto 2.2 e quindi espellere direttamente in una provetta da 0,2 ml PCR contenente 4,5 microlitri tampone di lisi cellulare. La cella viene espulso sul lato del tubo, facendo attenzione a non rompere la punta della micropipetta nel tubo. I campioni possono essere centrifugati brevemente in una microcentrifuga da banco per immergere la cella in tampone di lisi. Questo filatura viene solitamente eseguita dopo ogni cella 5a e quindi nuovamente alla fine della collection.Tubes contenenti singole cellule in tampone di lisi devono essere tenuti in ghiaccio per tutta la durata della isolamento singola cella. Per ottenere risultati ottimali, le singole celle vengono raccolte all&#39;interno di una finestra di due ore post-dissociazione. Trascorso questo tempo è trascorso, è meglio procedere alla fase di trascrizione inversa in quanto tempo supplementare è stato ossered aumentare le possibilità di degradazione dell&#39;RNA. </li></ol> 3. Trascrizione inversa <ol><li> Brevemente girare i campioni in un minicentrifuge banco per assicurare che tutte le singole cellule sono immerse nel buffer di lisi cellulare. Per promuovere la lisi cellulare, incubare il campione a 70 ° C per 90 sec. in un termociclatore. Porre immediatamente i tubi di nuovo sul ghiaccio. </li><li> Lasciare le provette su ghiaccio per 2 min. Per tutte le aggiunte di reagente, utilizzare il filtro-punta punte di pipetta per evitare contaminazioni. Per eseguire la trascrizione inversa, aggiungere 0,33 microlitri Superscript III (200 U / pl), 0,05 pl inibitore della RNasi (40 U / pl), e 0,07 microlitri gene T4 32 proteina. Incubare la miscela di reazione per 50 min a 50 ° C in un termociclatore. Inattivare l&#39;enzima a 70 ° C per 15 min e posto su ghiaccio. </li><li> Per rimuovere il primer libero, aggiungere 0,1 microlitri esonucleasi Buffer (10X), 0,8 microlitri dH 2 0 (per biologia molecolare), e 0,1 microlitri esonucleasi I (20 U / mL). Incubare a 37 ° C per 30 min inun termociclatore. Inattivare l&#39;enzima incubando la reazione a 80 ° C per 25 min e quindi posizionare i tubi in ghiaccio. </li></ol> 4. Tailing e Single-Cell PCR <ol><li> Aggiungere 6 pl della miscela di reazione tailing e utilizzare un termociclatore per incubare il campione a 37 ° C per 20 min, 70 ° C per 10 min, e mantenere a 4 ° C </li><li> Aggiungere 10 microlitri del campione coda alla miscela di reazione PCR ed eseguire la sintesi secondo filamento e amplificazione PCR usando le seguenti condizioni: <ol><li> 95 ° C per 2 min </li><li> 37 ° C per 5 min </li><li> 72 ° C per 16 min </li><li> 93 ° C per 40 sec </li><li> 67 ° C per 1 min </li><li> 72 ° C per 6 minuti, aggiungendo 6 sec per ciclo </li><li> Passare al punto 4 34 volte </li><li> 72 ° C per 10 min </li><li> Mantenere a 4 ° C </li></ol></li></ol> 5. Etichettatura per Chips Affymetrix <ol><li> Etichetta 10-20 pg di cDNA (la concentrazione del risultato cDNA amplificatore da una singola cellula è di solito ~ 1 pg / pl) per ottenere un forte ibridazione su microarray Affymetrix. In primo luogo, il frammento di cDNA aggiungendo 10-20 pl della singola cellula cDNA di 8 microlitri 1X One-Phor All-tampone e 1 ml di diluito (1:10 in 1X One-Phor-Tutto buffer) DNaseI in 80 pl reazione. Incubare in un termociclatore per 13 min a 37 ° C. Inattivare la DNasi per 15 min a 100 ° C e posto su ghiaccio. </li><li> Aggiungere 20 ul tampone TdT 5X, 2,5 microlitri Biotina N6-ddATP (Enzo Biosciences), e 1 pl TdT (diluito 1:8 in tampone TdT). </li><li> Incubare per 90 min a 37 ° C, quindi 5 min a 65 ° C. Conservare a -20 ° C o ibridarsi immediatamente ad un microarray Affymetrix. La ibridazione viene eseguita utilizzando protocolli standard Affymetrix. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Per valutare la qualità del cDNA, 10 microlitri del campione di cDNA è stato caricato su un gel di agarosio all&#39;1%. Il cDNA è principalmente giudicata dal campo di dimensioni (500-2000 bp)e l&#39;intensità della macchia cDNA (Figura 1 e Figura 3a). Nel gel illustrato in Figura 1, ogni altra corsia mostra una striscio cDNA isolato da cellule retiniche E16.5. Le corsie tra mostrano gli strisci risultanti quando solo supporti viene aspirata nella dell&#39;ago e depositato nel tubo PCR. Queste linee non sono completamente privi di uno striscio debole, ma non mostrano alcun risultato quando gene-specifici primer PCR sono utilizzati per amplificare i geni da loro. Inoltre, l&#39;intensità del striscio cDNA può variare un po &#39;(comparare Figura 1 e Figura 3a). In Figura 3a corsia a, f, g, h e contenere robusti strisci di cDNA, mentre corsie b, c, d, ed e sono molto meno robusti. Gene-specifico PCR viene utilizzato come schermo secondario della qualità del cDNA da una singola cellula. I cDNA in figura 3 sono stati isolati da cellule gangliari retiniche fluorescenti ed erano tested utilizzando primer PCR per l&#39;ganglio retinico cella marcatori Brn3b e Pax6. Per questo saggio, 1 microlitri del cDNA è stato sottoposto a PCR per 30 cicli. Real-PCR quantitativa in tempo sarebbe un saggio preferibile, ma può essere costosa e non è necessaria soltanto per valutare la qualità cDNA. Tutte 8 delle singole celle sono risultati positivi per Brn3b e 6 su 8 per Pax6 (Figura 3b). Anche gli strisci di cDNA che erano meno robusta band prodotte per Brn3b e Pax6. Nonostante questi risultati PCR, è la nostra esperienza che strisci di cDNA come quelle corsie b, c, d, ed e non cedono ibridazioni robusti su array Affymetrix e sono generalmente evitato. Gene PCR specifici per il marcatore fotorecettore Crx è stato utilizzato per determinare il livello di contaminazione dei cDNA singola cellula (Figura 3b). Un marcatore fotorecettore è stato scelto perché queste cellule costituiscono la maggioranza della retina (~ 70%) e, pertanto, qualsiasi lisi cellulare che si è verificato molto probabilmente comporta asta photoreceptors. C&#39;era solo una quantità debole Crx presenti in queste preparazioni di cDNA anche dopo 30 cicli di PCR. Infine, questo PCR basato schermo può essere usato per iniziare a determinare quale sottoinsiemi di un particolare tipo di cellula i cDNA sono stati derivati ​​da prima di sottoporli ad una profilatura microarray completo. Ciò può aiutare a priorità le cellule che sono sagomati, in quanto questo è il passo più costoso nel processo. Ad esempio, abbiamo identificato sottoinsiemi di cellule gangliari retiniche mediante screening loro per la presenza del gene Tachykinin1 (Figura 3b). Dal piccolo PCR basato schermo, particolari cellule singole sono scelti e loro cDNA ibridati uno microarray Affymetrix. I dati microarray viene confrontato e modelli può essere scoperto usando algoritmi di clustering standard. Mappe di calore, come in figura 4, vengono generati a rappresentare graficamente i dati. Ci sono due conclusioni principali per quanto riguarda i singoli dati delle celle di profilatura in figura4. In primo luogo, i geni espressi in specifici tipi cellulari si trovano quasi esclusivamente in questi tipi di cellule dopo il protocollo singola cella viene eseguita. Nella maggior parte dei casi in cui si trovano i geni marcatori di un tipo di cellula anche in un secondo tipo di cellule, come l&#39;osservazione che le cellule esprimono bipolari alcuni geni &quot;asta&quot; a bassi livelli, questa espressione nel secondo tipo di cellule è confermato facilmente da o in situ ibridazione o colorazione anticorpale. In secondo luogo, all&#39;interno del amacrine più diversificata e profili delle cellule gangliari, l&#39;eterogeneità di espressione genica è immediatamente evidente. Pou4f1 è espresso solo in circa 1/4 delle cellule gangliari in via di sviluppo, mentre Nr4a2 e Scube2 sono due esempi di geni espressi in modo eterogeneo diversi cellule amacrine. Infatti, i geni mostrati nella heatmap sono solo un piccolo campione di diverse centinaia di geni sono stati identificati e confermati come marcatori di cellule gangliari sviluppo o come marcatori di differenti popolazioni di cellule amacrine 2,4. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig1.jpg" /> Figura 1. Diagramma di flusso del metodo di profiling singola cellula. Retine primi saranno isolati e si dissociano in singole celle usando la papaina. In secondo luogo, le singole celle vengono raccolte con un ago di vetro tirato e depositato in provette PCR. Le cellule vengono lisate e il cDNA amplificato mediante trascrizione inversa seguita da PCR. La qualità cDNA risultante è valutata su gel di agarosio come quello illustrato. Dopo la scala DNA nella prima fila, le corsie mostrano strisci di cDNA da cellule singole (indicata con le parentesi rosse) alternati con prodotti di amplificazione di controlli multimediali. Strisci di questa qualità (parentesi rosse) sono ibridate al microarray Affymetrix. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig2.jpg" /> Figura 2. Foto degli aghi e tubi di montaggio aspiratore. Singole cellule vengono isolate mediante l&#39;azione capillare di untirato micropipetta di vetro (diametro interno 0,5 mm, diametro esterno 1,04 millimetri) e vengono trasferiti dalla pressione della soffiatura dell&#39;aspiratore. È importante che il tubo aspiratore sia abbastanza lungo per manipolare facilmente e abbastanza breve per scaricare affidabile singole celle. Una vista ravvicinata del capillare tirato in un ago è mostrata in B. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig3.jpg" /> Figura 3. Esempio rappresentativo di strisci cellulari singoli cDNA PCR gene e specifici. Per determinare la qualità della singola cella cDNA Dopo l&#39;amplificazione, 10 pl di ciascun campione singola cella sono stati analizzati su un gel di agarosio 1%, con un controllo negativo (A). Uno striscio dovrebbe apparire tra 500-2000 bp. Ulteriori PCR-screening per geni specifici può aiutare a identificare / confermare il tipo di cella che è stato isolato e la quantità di contaminazione presente nel campione (B). Primer specifici per la cellula gangliari retiniche marcatori Brn3bPax6 e sono stati testati per confermare l&#39;identità di queste cellule (righe 1 e 2). Per valutare la quantità di contaminazione dei fotorecettori nella preparazione, primer specifici per il marcatore fotorecettore Crx sono stati utilizzati (riga 3). Sottoinsiemi di cellule gangliari possono essere identificati attraverso lo screening per i marcatori come Tachykinin1 (riga 4). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3824/3824fig4.jpg" /> Figura 4. Espressione cella singola di geni marcatori. I risultati microarray di geni selezionati espressi in cellule distinte 22 singole sono visualizzati in un formato heatmap. L&#39;intensità dei segnali microarray sono stati ridotti a corrispondere con l&#39;intensità del colore rosso. Nera indica l&#39;assenza del segnale sul microarray. Le cellule gangliari retiniche (RGC) precursori indicati sono stati isolati da punti temporali embrionali, mentre le altre cellule sono state isolate da retine adulti.

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<li>Subkhankulova, T., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+linear+and+exponential+amplification+techniques+for+expression+profiling+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of linear and exponential amplification techniques for expression profiling at the single-cell level.</a> Genome Biol. 7, R18(2006).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Un sempre crescente numero di studi stanno rivelando robusta cellula-cellula variabilità nelle popolazioni che sono state ritenute più omogenee per quanto riguarda la loro espressione genica 6,8. In almeno un caso, questa espressione genica &quot;rumore&quot; ha dimostrato di giocare un importante funzione biologica 13. Le differenze di espressione genica tra le singole cellule sono oscurate con i tradizionali metodi di interi tessuti. Questi esperimenti generare il profilo di espressione di una ce...

single-cell profiling dei neuroni retinici maturi e in sviluppo

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Popolazioni altamente specializzati, ma estremamente piccola di cellule svolgono un ruolo importante in molti tessuti. L&#39;identificazione di markers specifici delle cellule di tipo e programmi di espressione genica per sottopopolazioni cellulari estremamente rare è stata una sfida utilizzando le normali intero tessuto approcci. Profili di espressione genica di singole celle consente un accesso senza precedenti tipi di cellule che comprendono solo una piccola percentuale del tessuto totale 1-7. Inoltre, questa tecnica può essere usata per esaminare i programmi di espressione genica che vengono espresse transitoriamente in piccoli numeri di cellule durante transizioni dinamiche di sviluppo 8. Questo problema della diversità cellulare si pone più volte nel sistema nervoso centrale (SNC) in cui le connessioni neuronali si può verificare tra le cellule molto diverse 9. Il numero esatto di tipi cellulari diversi non è nota con precisione, ma è stato stimato che vi possono essere fino a 1000 diversi tipi nella corteccia itself 10. La funzione (s) di complessi circuiti neuronali possono contare su alcuni dei tipi rare neuronali ei geni che esprimono. Identificando nuovi marcatori e contribuendo a classificare molecolarmente neuroni differenti, la singola cella approccio è particolarmente utile per l&#39;analisi dei tipi di cellule del sistema nervoso. Può anche aiutare a chiarire i meccanismi di sviluppo neurale identificando i geni differenzialmente espressi e le vie del gene durante le prime fasi dello sviluppo progenitore neuronale. Come un semplice, il tessuto facilmente accessibili con notevole diversità neuronale, la retina dei vertebrati è un sistema eccellente modello per lo studio dei processi di sviluppo cellulare, la differenziazione neuronale e la diversificazione neuronale. Tuttavia, come in altre parti del sistema nervoso centrale, questa diversità cellulare può rappresentare un problema per la determinazione dei percorsi genetici che guidano progenitrici della retina di adottare un destino specifico della cellula, soprattutto considerando che bastoncelli costituiscono la magioranza della popolazione totale delle cellule della retina 11. Qui riportiamo un metodo per l&#39;identificazione dei trascritti espressi in singole cellule retiniche (Figura 1). La cella singola tecnica di profilatura consente la valutazione della quantità di eterogeneità presente all&#39;interno diverse popolazioni cellulari della retina 2,4,5,12. Inoltre, questo metodo ha rivelato una serie di nuovi geni che può svolgere il ruolo (s) nel fato cella processi decisionali che si verificano in sottogruppi di cellule progenitrici retiniche 8. Con alcune semplici regolazioni per il protocollo, questa tecnica può essere utilizzato per molti tessuti e tipi di cellule.

Un metodo per l&#39;isolamento di singole cellule retiniche e successiva amplificazione del cDNA è descritto loro. Unicellulari trascrittomica rivela il grado di eterogeneità cellulare presente in un tessuto e scopre nuovi geni marcatori per le popolazioni di cellule rare. Il protocollo di accompagnamento può essere regolato secondo molti tipi cellulari differenti.

Single-cell Profiling dei neuroni retinici maturi e in sviluppo

Popolazioni cellulari altamente specializzate, sebbene estremamente esigue, svolgono ruoli importanti in molti tessuti. L'identificazione di marcatori specifici per il tipo cellulare e...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare singole cellule per l'analisi del trascrittoma basata su microarray. Questo viene ottenuto dapprima dissezionando la retina dal tessuto circostante e successivamente dissociandola in singole cellule. Il secondo passaggio consiste nel raccogliere singole cellule e depositarle in provette PCR contenenti tampone di lisi.Quindi le cellule vengono lisate e il cDNA viene amplificato mediante trascrizione inversa, seguita da reazione a catena della polimerasi. Infine, l'ibridazione del cDNA di una singola cellula su un microarray A iMatrix viene utilizzata per rivelare gli mRNA espressi in una singola cellula. Il vantaggio principale del profilo dell'espressione genica a livello di singola cellula rispetto agli approcci su tessuto intero è che l'isolamento di singole cellule consente di accedere a popolazioni cellulari molto ridotte che altrimenti sarebbero incluse nell'intero tessuto.Queste cellule possono essere di diversi tipi, dai vari tipi di neuroni a piccole popolazioni di cellule staminali. La tecnica della singola cellula ci consente di identificare sia i tipi cellulari, sia marcatori specifici per queste piccole popolazioni di c

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Fonte: Gómez-Villafuertes, R., et. Al., Imaging in tempo reale seguito da tracciamento di singole cellule per monitorare la biologia cellulare e la progressione del lignaggio di più popolazioni neurali. J. Vis. Exp. (2017) Il Il video mostra il processo di preparazione, imaging e monitoraggio delle cellule staminali neurali adulte in tempo reale per studiare i comportamenti cellulari, tra cui la divisione e la differenziazione.

 Imaging in tempo reale e tracciamento di singole cellule per monitorare il lignaggio neurale nelle cellule staminali neurali adulte

Fonte: Laboissonniere, et. al. RNA-seq a singola cellula di sottoinsiemi definiti di cellule gangliari retiniche. J. Vis. Exp. (2017).  Questo video mostra una tecnica di tracciamento fluorescente per identificare i sottotipi di cellule gangliari retiniche (RGC) in una retina di topo transgenico. Il processo prevede il fissaggio della retina isolata in una camera di registrazione, il mantenimento della vitalità cellulare con perfusione ossigenata e il targeting di RGC marcate in fluorescenza...

Identificazione dei sottotipi di cellule gangliari retiniche di topo mediante tracciatura fluorescente

Riportiamo un metodo basato sul Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) per isolare le cellule staminali neurali (NSC) e la loro progenie dalla zona subventricolare (SVZ) del cervello del topo adulto. Applicato a topi transgenici FUCCI (Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator), consente lo studio della progressione del ciclo cellulare mediante imaging dal vivo.

Ordinamento delle cellule staminali neurali e di cellule progenitrici del topo adulto subventricolare Zone e Live-imaging loro dinamiche del ciclo cellulare

Qui presentiamo un approccio combinatorio per la classificazione di tipi di cellule neuronali prima dell'isolamento e per la successiva caratterizzazione di transcriptomi a singola cellula. Questo protocollo ottimizza la preparazione di campioni per il successo RNA Sequencing (RNA-Seq) e descrive una metodologia studiata appositamente per una migliore comprensione della diversità cellulare.

Sequenza RNA a singola cellula di sottogruppi definiti delle cellule del Ganglio retinico

È descritto un protocollo robusto per monitorare le popolazioni neurali di time-lapse video-microscopia seguita da basati su software di post-elaborazione. Questo metodo rappresenta un potente strumento per identificare gli eventi biologici in una popolazione selezionata durante esperimenti dal vivo di formazione immagine.

Seguita dalla singola cellula di rilevamento a Monitor biologia cellulare e la progressione di lignaggio di popolazioni neurali Multiple immagini dal vivo

Questo protocollo descrive l'uso di un perossido di idrogeno geneticamente codificato (H2O2)biosensore nei neuroni e nelle larve di zebrafish coltivati per valutare i ruoli fisiologici di segnalazione di H2O2 durante lo sviluppo del sistema nervoso. Può essere applicato a diversi tipi di cellule e modificato con trattamenti sperimentali per studiare specie reattive dell'ossigeno (ROS) in generale sviluppo.

Imaging cellulare vivo ROS durante lo sviluppo neuronale

Qui, presentiamo un metodo per studiare la morfogenesi dei neuriti negli espianti retinici postnatali di topo mediante microscopia confocale time-lapse. Descriviamo un approccio per l'etichettatura sparsa e l'acquisizione di tipi di cellule retiniche e dei loro processi fini utilizzando vettori virali adeno-associati ricombinanti che esprimono proteine fluorescenti mirate alla membrana in modo Cre-dipendente.

Imaging time-lapse dell'arborizzazione neuronale utilizzando l'etichettatura del virus adeno-associato sparso di popolazioni di cellule retiniche geneticamente mirate

Qui descriviamo un sistema di induzione organoide retinica ottimizzato, adatto a varie linee di cellule staminali pluripotenti umane per generare tessuti retinici con elevata riproducibilità ed efficienza.

Sistema di induzione organoide retinica per la derivazione di tessuti retinici 3D da cellule staminali pluripotenti umane

Questo protocollo fornisce una procedura di preparazione ottimizzata ed elaborata per campioni di organoidi retinici per la microscopia elettronica a trasmissione. È adatto per applicazioni che prevedono l'analisi delle sinapsi in organoidi retinici maturi.

Preparazione di campioni di organoidi retinici per la microscopia elettronica a trasmissione

La retina mostra una complessa organizzazione spaziale attraverso la sua struttura laminare. Le moderne tecniche di trascrittomica spaziale e sequenziamento richiedono sezioni di tessuto &lt; 20 μm di spessore, limitandone l'applicabilità nella ricerca retinica. Questo metodo di criosezione appena congelato produce sottili sezioni en face della retina di topo preservando le relazioni spaziali planari, consentendo una mappatura molecolare completa tra le lamine.

En face Criosezione della retina di topo per analisi molecolare spaziale ad alta dimensione

Questo protocollo combina la chiarificazione ottica e l'immunomarcatura per l'imaging confocale a volume completo di organoidi retinici a montaggio intero. Preserva la struttura 3D, consentendo la visualizzazione dettagliata dei percorsi neuronali chiave, migliorando lo studio della maturazione retinica, l'organizzazione spaziale e le sue potenziali applicazioni nella modellazione delle malattie e nella medicina personalizzata.

Visualizzazione di organoidi retinici a montaggio intero con risoluzione cellulare

Impara il profilo di espressione genica in singole cellule retiniche per studiare l'eterogeneità cellulare e identificare marcatori di popolazioni rare. Questo metodo consente di analizzare reti geniche transienti durante lo sviluppo neuronale.

Single-cell Profiling dei neuroni retinici maturi e in sviluppo

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