Single-cell Profiling dei neuroni retinici maturi e in sviluppo

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare singole cellule per l'analisi del trascrittoma basata su microarray. Ciò si ottiene sezionando prima la retina dal tessuto circostante e poi dissociandola in singole cellule. Il secondo passo consiste nel raccogliere singole cellule e depositarle in provette PCR contenenti tampone di lisi.

Quindi le cellule vengono lisate e il CDNA viene amplificato utilizzando la trascrizione inversa, seguita dalla reazione a catena della polimerasi. Infine, l'ibridazione della singola cellula CD NA su un microarray A iMatrix viene utilizzata per rivelare gli mRNA espressi in una singola cellula. Il vantaggio principale della profilazione dell'espressione genica in singole cellule rispetto all'utilizzo di approcci a tessuto intero è che l'isolamento di singole cellule consente di accedere a popolazioni molto piccole di cellule che comprenderebbero l'intero tessuto.

Queste cellule potrebbero essere qualsiasi cosa, da diversi tipi di neuroni a piccole popolazioni di cellule staminali. Ciò che la tecnica a cellula singola ci permette di fare per queste cellule è identificare entrambi i tipi di cellule, marcatori specifici per queste piccole popolazioni di cellule, e identificare le reti geniche che sono espresse in questi sottoinsiemi estremamente rari di cellule. Inoltre, la tecnica di profilazione a singola cellula ci consente di identificare le reti geniche che sono espresse transitoriamente durante transizioni di sviluppo molto dinamiche in sottogruppi molto piccoli di cellule.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della genetica dello sviluppo, come ad esempio quando le cellule progenitrici iniziano a esprimere reti geniche associate alla differenziazione e come tali cellule progenitrici differiscono l'una dall'altra. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alle terapie cellulari per malattie neurodegenerative come il glaucoma, perché chiarendo le reti chiave nello sviluppo delle singole cellule siamo un passo più vicini alla possibilità di generare quelle cellule per l'uso nella terapia di sostituzione cellulare. Inizia questa procedura posizionando la retina del topo in un piatto pieno di PBS.

Quindi, rimuovere il vitreo e la lente. Quindi rimuovere tutto l'epitelio pigmentato retinico. Incubare la retina in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri a 37 gradi Celsius per 10 minuti.

Successivamente, picchiettare delicatamente il tubo per rimuovere eventuali cellule depositate. Quindi tri tri valutarlo delicatamente, da 10 a 20 volte con un pipettatore P 1000. Se persistono grandi grumi di tessuto, incubarlo per altri 10 minuti a 37 gradi Celsius e conservarlo in frigorifero da 10 a 20 volte.

Quindi, aggiungi cinque microlitri di dna, uno a 10 unità per microlitro alla retina, e incubalo per cinque minuti. Al trier a temperatura ambiente, dosare delicatamente con il pipettatore P 1000 per altre 10-20 volte. Centrifugare a 3000 giri/min per tre minuti.

Quindi rimuovere il surnatante e lasciare sul fondo da 100 a 200 microlitri di liquido. Battere il tubo per rimuovere il pellet. Quindi, aggiungere un millilitro di HBSS e risospendere il pellet con una tazione delicata.

Centrifugare a 3000 giri/min per tre minuti. Al termine, rimuovere con cura il surnatante. Quindi risus, sospenderlo in 450 microlitri di PBS contenente lo 0,1% di BSA nel passaggio successivo, preparare due piatti da sei centimetri contenenti cinque millilitri di PBS integrati con lo 0,1% di BSA.

Piastra successiva, le cellule dissociate su un piatto. Lasciare riposare le celle per almeno cinque minuti. Successivamente, posizionare il piatto di cellule dissociate sotto un microscopio invertito.

Utilizzare una pipetta a punta fine con un tubo aspiratore per raccogliere una singola cellula. Quindi posizionare la micropipetta vicino alla cellula e entrerà facilmente nella micropipetta tramite un'azione capillare. Successivamente espellere la cellula su un secondo piatto e assicurarsi che venga raccolta solo una cellula per la profilazione dell'espressione genica.

Questo viene fatto rimuovendo le cellule estranee o spostando la cellula di interesse in una posizione diversa con una nuova micropipetta. Quando una singola cellula è completamente isolata dalle cellule vicine, utilizzare una nuova micropipetta per aspirare la cellula di interesse. Quindi, espellerlo direttamente in una provetta PCR da 0,2 millilitri contenente 4,5 microlitri di tampone di lisi cellulare.

Far girare brevemente il campione in una microcentrifuga per immergere la cella nel tampone di lisi. Fallo roteando ogni quinta cella e poi di nuovo alla fine della raccolta. Ricordarsi di tenere la provetta in ghiaccio per tutta la durata dell'isolamento di singole cellule e di raccogliere le singole cellule entro una finestra di due ore dopo la dissociazione per ottenere risultati ottimali in questa procedura, centrifugare brevemente il campione in una microcentrifuga per assicurarsi che la singola cellula sia immersa nel tampone di lisi cellulare.

Per favorire la lisi cellulare, incubare il campione a 70 gradi Celsius per 90 secondi in un termociclatore. Quindi riposizionare immediatamente il tubo sul ghiaccio per due minuti. Per eseguire la trascrizione inversa, aggiungere 0,33 microlitri.

Apice tre a 200 unità per microlitro, 0,05 microlitri inibitore a 40 unità per microlitro e 0,07 microlitri. T quattro gene 32 proteina al tubo. Incubare la miscela di reazione per 50 minuti a 50 gradi Celsius in un termociclatore dopo 50 minuti, inattivare l'enzima a 70 gradi Celsius per altri 15 minuti.

Al termine, rimetti il tubo sul ghiaccio. Per rimuovere il primer gratuito, aggiungere 0,1 microlitri, 10 tampone esonucleasi, 0,8 microlitri, D H2O e 0,1 microlitri. Esonucleasi, una a 20 unità per microlitro nella provetta incubata a 37 gradi Celsius per 30 minuti in un termociclatore.

Dopo 30 minuti, inattivare l'enzima incubando la miscela di reazione a 80 gradi Celsius per 25 minuti. Alla fine, rimetti il tubo sul ghiaccio. Quindi, aggiungere sei microlitri della miscela di reazione di coda al campione.

Incubarlo nel termociclatore a 37 gradi Celsius per 20 minuti, 70 gradi Celsius per 10 minuti, quindi mantenerlo a quattro gradi Celsius. Successivamente, aggiungere 10 microlitri del campione con coda alla miscela di reazione PCR. Eseguire la sintesi del secondo filamento e l'amplificazione PCR per marcare il CDNA.

Al fine di ottenere un'ibridazione robusta su un microarray iMatrix, per prima cosa frammentare il CD NA aggiungendo da 10 a 20 microlitri del CD NA a singola cellula a otto microlitri uno x uno per tutti il tampone. Quindi aggiungere un microlitro di questo DNA diluito a una soluzione di reazione da 80 microlitri. Quindi, aggiungi 20 microlitri, cinque tampone XTDT, 2,5 microlitri di biotina e sei D-D-A-T-P e un microlitro di TDT diluito.

Quindi, aggiungi 20 microlitri, cinque tampone XTDT, 2,5 microlitri, biotina e sei D-D-A-T-P e un microlitro TDT. Incubare la miscela per 90 minuti a 37 gradi Celsius. Poi cinque minuti a 65 gradi Celsius.

Successivamente conservarlo a meno 20 gradi Celsius o ibridarlo immediatamente in un microarray iMatrix. Ecco un esempio rappresentativo di strisci di NA CD a cellula singola e PCR specifici per gene Le corsie A-F-G-N-H contengono robusti strisci di NA CD mentre le corsie B, C, D ed E sono considerevolmente meno robuste. I CDNA sono stati isolati da cellule gangliari retiniche fluorescenti e sono stati quindi testati utilizzando primer PCR specifici per i marcatori delle cellule gangliari retiniche, BRN tre B e PAC sei, PCR gene specifica per il marcatore dei fotorecettori.

CRX è stato utilizzato per determinare il livello di contaminazione nella singola cellula. I CDNA e i sottogruppi di cellule gangliari retiniche sono stati identificati mediante screening per la presenza del gene tachichinina uno. I risultati del microarray per geni selezionati espressi in 22 singole cellule distinte sono mostrati in un formato di mappa termica.

Le intensità dei segnali del microarray sono state scalate per corrispondere all'intensità del colore rosso, mentre il nero indica l'assenza di segnale sul microarray. Seguendo questa procedura, è possibile utilizzare metodi aggiuntivi come la QPCR per confermare il modello di espressione genica osservato nei microraggi. I risultati dell'ibridazione C possono anche essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande che potresti avere sulla posizione delle cellule che esprimono particolari geni.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'idea abbastanza precisa di come dissociare le retine, isolare le singole cellule e generare CDNA da quelle singole cellule. Per l'ibridazione su microarray.