Name: Misura della chemiotassi cellulari con ECIS / Taxi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Scopri la misura automatizzata della chemiotassi cellulare in tempo reale con il sistema ECIS/Taxis utilizzando elettrodi e agarosio. Questo metodo basato su impedenza elettrica consente di analizzare il movimento cellulare verso elettrodi target.

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Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni da parte del National Institutes of Health (ES07408 e EB00208).

1. ECIS / Taxi elettrodi Preparazione <ol><li> La superficie d'oro del ECIS / taxi matrice di elettrodi (composto 8 camere per vetrino) viene prima stabilizzato mediante pre-trattamento con sterile cisteina 10 mM in acqua deionizzata (dH 2 O) per 15 min a temperatura ambiente in condizioni sterili. </li><li> Aspirare la soluzione cisteina da ciascuna camera di elettrodo, risciacquare 3 volte con sterile dH 2 O, e sostituirlo con 250 pl di mezzo completo (RPMI 1640, FBS 10%, 25 mM di tampone HEPES). </li><li> Collegare la matrice di elettrodi a contatto pin sul possessore dello strumento matrice per eseguire il controllo elettrodo. </li><li> Chambers che sono collegati correttamente sarà evidenziato in verde sullo schermo del computer. Se i contenitori sono evidenziati in rosso, non sono collegati e l'elettrodo deve essere riposizionato nel supporto matrice di stabilire contatti per tutte le camere. </li><li> Una volta che tutte le camere sono collegati, fare clic sul pulsante "check" nel software di controllo per scoraggiareminare la resistenza iniziale e valori di capacità per ogni camera. I valori della resistenza deve essere compresa tra 1600 e 2000 ohm, e valori di capacità deve essere compresa tra 5 e 6 nanofarads per una matrice 8 camera. Se una camera non è all'interno di questi parametri accettabili, la camera individuo non deve essere utilizzato per raccogliere dati. </li><li> Scollegare l'elettrodo dal titolare array per preparare le singole camere agarosio. Aspirare il terreno dalle camere e lavare ogni camera 3 volte con sterile dH 2 O. </li></ol> 2. Preparazione Agarose Chambers <ol><li> In un tubo di polipropilene sterile 15 ml conica, misura 0,03 g di Seakem GTG agarosio e aggiungere 1 ml di PBS sterile. Rimettere il tappo del tubo in modo impreciso, e sciogliere l'agarosio in autoclave per un ciclo di 2 min liquido (fusione in un forno a microonde non è efficace per questo test). Questo breve periodo di tempo non si scioglierà il tubo conico. Per le celle meno esigenti che non richiedono siero per la cultura, (ad esempio Dictyostelium discoideum) 0,5%agarosio può essere fatto nel mezzo appropriato e fusi in un forno a microonde. L'autoclave è necessaria per le celle che richiedono siero, come sarà denaturato se fuso in forno a microonde. </li><li> Aggiungere 5 ml di mezzo RPMI completo riscaldato in un bagno di acqua (55 ° -60 ° C) direttamente al agarosio caldo, ad una concentrazione finale di 0,5% agarosio e pipettare su e giù delicatamente per miscelare. </li><li> Pipettare 300 pl di mezzo fuso agarosio in ciascuna camera, sostituire le ECIS / matrice copertura taxi e permettono di gel a temperatura ambiente. </li><li> Pipettare rimanente agarosio nel tappo della provetta 15 ml di valutare gelificazione agarosio. Questo eccesso di agarosio sarà utilizzato anche in parte 4: Taglio di pozzi in agarosio. </li></ol> 3. Costruzione e affilatura la cannula strumento Well taglio <ol><li> Contrasta due cannule 14 estremità smussata calibro, con un "5/64 bit. Ruotare la punta del trapano in ciascuna apertura cannula con un trapano a bassa velocità, rendendo certa la punta taglia tutta bordo interno di ogni op cannulazare per formare un bordo tagliente (Figura 4A). </li><li> Praticare due fori attraverso i 1 "x 2" x "in plexiglass (Figura 4B-D) con un 5/64" ¼ bit in un trapano a colonna. Inserire ogni affilato cannula calibro 14 in modo che sporga una distanza uguale in ogni foro plexiglass. </li></ol> 4. Taglio Wells in agarosio <ol><li> Sterilizzare il 14 cannule di calibro con una leggera fiammeggianti le punte. Prima di taglio pozzetti nella camera ECIS, permettono la cannule raffreddare a temperatura ambiente, o raffreddare le cannule toccando l'agarosio nel tappo del tubo 15 ml. Se la temperatura della cannula è troppo elevata, l'agarosio si scioglierà come i pozzetti camera sono tagliate, rendendo i pozzetti deformi e difettoso. </li><li> Allineare la coppia cannula sopra i due punti d'oro che circondano l'elettrodo bersaglio in ciascuna camera (figura 2c e 5). Inserire la cannula verticalmente, senza alcun movimento orizzontale, fermandosi al contatto tra la cannula dolce ela superficie dell'elettrodo. Rimuovere con cautela la cannula, ancora una volta senza alcun movimento orizzontale. Posizionamento dei pozzi aggiuntivi per opporsi gradienti è possibile anche con una riconfigurazione del jig cannula. </li><li> Aspirare delicatamente il tappo di agarosio lasciato dalla cannula, con una sterile 9 "pipetta Pasteur, collegato alla bassa pressione di vuoto, con una trappola a vuoto cattura dei rifiuti agarosio. </li><li> Aggiungere 300 pl di mezzi completi RPMI alla superficie di ciascuna camera a 37 ° C, per 2 min per saturare la agarosio, e quindi delicatamente aspirare il supporto dalla superficie ed i pozzetti senza disturbare l'agarosio. </li></ol> 5. Caricamento del Wells <ol><li> Ogni bene è in grado di contenere un volume di 7 pl. Per un pozzetto in ogni camera, si aggiungono 7 microlitri di sospensione di cellule. Per cellule T Jurkat, utilizzare 2 x10 7 cellule / ml. Queste cellule risponderà a 7 microlitri di 200 ng / ml SDF-1α diluito in RPMI incompleto, che manca di siero. Utilizzare mezzi completi da solo come un cont negativorol. </li><li> Dopo che i pozzetti vengono caricati, visualizzare ogni camera della matrice con un microscopio invertito per garantire che tutti i pozzetti sono stati tagliati e riempito correttamente. Le cellule devono essere entro i confini del confine del pozzo. Se si sono visti in entrambi i pozzetti, o si stanno diffondendo al di là delle frontiere delle cellule e, quindi un divario si è formato sotto l'agarosio. Nota: i pozzi impropriamente istituiti, in quanto i dati non possono essere interpretati in modo affidabile da quelle camere. </li></ol> 6. Raccolta dei dati <ol><li> Posizionare l'elettrodo nel supporto matrice e ri-collegare gli elettrodi d'oro sulla matrice di elettrodi ai molla pogo pin del titolare e fare clic su "setup". I pozzi che sono stati collegati correttamente sarà evidenziato in verde. Se i pozzetti sono rossi, essi non sono collegati e l'elettrodo deve essere riposizionato nel supporto matrice. </li><li> Selezionare "8WE1" (8 e 1 elettrodo) dal menu a tendina nel pannello software per indicare la configurazione dell'array. </li><li> Selezionare "Controlla" nel software contrpannello olo per determinare la resistenza iniziale e valori di capacità per ciascun pozzetto. I valori di resistenza deve essere compresa tra 1600 e 2000 ohm, mentre i valori di capacità dovrebbero essere tra 5 e 6 nanofarads. </li><li> Selezionare più frequenze per misurare la resistenza a diverse frequenze. Vi è una scelta di personalizzazione frequenze, o utilizzando un set di frequenze raccomandate. Le impostazioni standard, più frequenza di acquisizione acquisire i dati a 11 frequenze preimpostate (52,5, 125, 250, 500, 1.000, 2.000, 4.000, 8.000, 16.000, 32.000 e 64.000 Hz) ad una velocità di 8 pozzetti / min. L'intervallo di tempo tra le misurazioni possono anche essere personalizzati. La raccolta di dati di frequenza più consente di analizzare capacità, impedenza, e resistenza. Raccogliere valori di resistenza a 4.000 Hz è in genere sufficiente per gli studi chemiotassi di cellule di mammifero, ma le frequenze aggiuntive possono fornire informazioni in altri contesti 12,13. </li><li> Durata dell'esperimento totale può essere impostata, sulla destrapannello o l'esperimento può essere fermato manualmente, facendo clic su "finish" una volta che le cellule hanno prodotto la resistenza che sono indicativi di arrivo dell'elettrodo. Il tempo necessario per le cellule per arrivare al elettrodo dipende dal tipo cellulare utilizzato. </li><li> Fare clic su "Start" per avviare la raccolta dei dati. </li></ol> 7. Data Management <ol><li> Anche se i dati possono essere esportati in Excel, il software ECIS 1600R, che accompagna il sistema ECISθ è il metodo più efficiente per analizzare i dati di ECIS / Taxi. </li><li> I dati del software di analisi barra degli strumenti contiene i pulsanti di opzione Z, R, e C. Si tratta di stabilire se l'impedenza, la resistenza, o di capacità, rispettivamente, viene tracciata sull'asse verticale contro l'asse x (tempo trascorso). </li><li> ECIS / Taxi dati vengono visualizzati come più efficace resistenza nel tempo a 4.000 Hz. Rapide fluttuazioni resistenza, o microtransients (Figura 1), sono prove di movimento cellulare sull'elettrodo. Compilazione, obinning r i punti dati in modo che non tutti i punti sono rappresentati graficamente, non è raccomandato per ECIS / Taxi, dato che microtransients media fuori dei dati. </li><li> Una volta che il grafico è stato realizzato con il software ECIS1600R, può essere esportato scegliendo "grafico export" dal menu file e salvato come. Tif o. File jpg. </li></ol> 8. Risultati rappresentativi Chemiotassi cellulare è indicata da un aumento della resistenza a 4.000 Hz. L'arrivo di celle sul elettrodo bersaglio è anche indicata dalla comparsa di rapide fluttuazioni resistenza chiamati microtransients o micromovimento come descritto in Opp et. al., 2009 (Figura 1) 14. Un risultato negativo è indicato da costante, o una leggera diminuzione, in resistenza a 4.000 Hz, come visto in rosso in figura 1. L'assenza di microtransients è anche un segno di un'assenza di movimento delle cellule all'elettrodo. L'aumento della resistenza è direttamente proporzionaleproporzionale al numero di celle che attraversano l'elettrodo 10. L'aggiunta di anticorpo monoclonale specifico per un fattore chemiotattico o tossine conosciute per interferire con i recettori accoppiati a proteina G può bloccare chemiotassi 11. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig1.jpg"> Figura 1. La chemiotassi di cellule Jurkat T umane in risposta a SDF1α. Umane cellule T Jurkat (2.0x10 6 cellule / ml) sono stati esposti a un gradiente di SDF-1α (concentrazione iniziale 100 ng / ml) o RPMI 1640 come controllo negativo. La resistenza normalizzata a 4000 Hz è stata rappresentata graficamente. Umane cellule T Jurkat spostata in risposta a SDF-1α, come dimostra l'aumento di resistenza e microtransients, mentre nessun movimento è stato visto con esposizione a RPMI 1640. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig2.jpg"> Figura 2. Vista dall'alto di un ECIS / Taxi elettrodi without agarosio. Ogni ECIS / taxi elettrodo è composto da 8 camere singole. Ogni camera condivide un elettrodo grande (a), e contiene un singolo elettrodo bersaglio (b). Ogni camera ha anche 2 cerchi oro (c), che sono utilizzati come guida per il taglio dei pozzetti nel agarosio con le cannule. I quadrati oro (d) sono le piazzole di contatto che si collegano ai perni pogo per applicare la corrente AC all'elettrodo. Gli elettrodi target individuali sono ciascuno in circuito con controelettrodo maggiore (e). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig3.jpg"> Figura 3. Due pozzetti sono tagliati in ciascuna camera di agarosio-riempita. Quando il chemioattraente è aggiunto a un pozzetto si diffonde per creare un gradiente di agarosio, con la maggiore concentrazione di chemoattract più vicino al chemioattrattore bene. Le cellule viaggiano sotto l'agarosio verso alte concentrazioni di chemioattraente e può passare sopra l'elettrodo di destinazione. Comele cellule attraversano l'elettrodo di destinazione, un aumento di resistenza è registrato dal software ECIS 1600R. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig4.jpg"> Figura 4. Inserimento di due cannule calibro 14 in plexiglass. A) A 5/64 "punta viene usato per affilare la punta della cannula. B) Due fori devono essere praticati in plexiglass per ospitare il 14 cannule calibro secondo il colpo layout. C) Utilizzare un trapano a colonna per garantire che i fori sono perpendicolari alla superficie pleixglass. D) due cannule affilato vengono inseriti attraverso ¼ "in plexiglass, 2 mm di distanza (misurata dai bordi interni). Queste cannule vengono accuratamente affilati inseriti agarosio per tagliare i pozzi. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3840/3840fig5.jpg"> Figura 5. Allineamento cannule con punti d'oro in ECIS / Taxi da camera. Per tagliare i pozzi, le cannule affilata deveessere allineati con i punti d'oro che fiancheggiano l'elettrodo bersaglio sul fondo della ECIS / Taxis camera. La cannula deve essere inseriti verticalmente, senza alcun movimento orizzontale, e rimosso allo stesso modo.

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</ol>

David A Knecht e Michael A Lynes avere un brevetto rilasciato per la ECIS / Taxi tecnologia, che, come è stato autorizzato dalla University of Connecticut di Biofisica Applicata, Inc.

Caratteristiche innovative della ECIS / Taxi test includono la capacità di automatizzare la raccolta dei dati in tempo reale, come le cellule rispondono a chemoattractant. Mentre l&#39;applicazione più comune di questa tecnologia è quello di misurare le risposte cellulari a gradienti chemiotattici individuali, o per gradienti costituiti da miscele di agonisti e antagonisti chemiotassi, la ECIS / Taxi approccio è anche soggetto a variazioni a queste configurazioni che possono essere molto utile nella valutazione della ri...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> ECIS Zθ </td><td> Biofisica Applicata </td><td></td><td> <a href="http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php">http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php</a> </td></tr><tr><td> ECIS Electrode Array </td><td> Biofisica Applicata </td><td> 8W chemiotassi </td><td> <a href="http://www.biophysics.com/cultureware.php">http://www.biophysics.com/cultureware.php</a> </td></tr><tr><td> Seakem GTG agarosio </td><td> Applicazioni BioWhittaker molecolari </td><td> 50070 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone siero fetale bovino </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH300703 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / streptomicina </td><td> MP Biomedicals </td><td> 1670049 </td><td> Penicillina 5000 UI / ml, streptomicina 5 mg / ml </td></tr><tr><td> Tampone Hepes </td><td> MP Biomedicals </td><td> 1688449 </td><td> Soluzione 1M, cellule di grado coltura </td></tr><tr><td> 14 Gauge Cannula in acciaio inox (2) 4 pollici </td><td> Laboratori di alimentazione </td><td> 5-8365-1 </td><td> Punto di Blunt </td></tr></tbody></table>

misura della chemiotassi cellulari con ecis / taxi

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Movimento cellulare in risposta a stimoli esterni è fondamentale per molti processi cellulari compresa la guarigione della ferita, infiammazione e la risposta alle infezioni. Un metodo comune per misurare chemiotassi è il dosaggio camera di Boyden, in cui vengono separate le cellule e chemioattrattore da una membrana porosa. Come cellule migrano attraverso la membrana verso il chemioattraente, aderiscono alla parte inferiore della membrana, o rientrano nei mezzi sottostanti, e vengono successivamente colorate e visivamente contato 1. In questo metodo, le cellule sono esposte a un gradiente ripido e transitoria chemiotattico, che si ritiene essere una rappresentazione povera di gradienti trovano nei tessuti 2. Un altro sistema di dosaggio, il sotto-agarosio chemiotassi saggio, 3, 4 misure cella movimento su un substrato solido in un film sottile che forma acquosa sotto lo strato di agarosio. Il gradiente che si sviluppa in agarosio è bassa e si ritiene sia un appropriate rappresentazione della natura gradienti. Chemiotassi può essere valutata mediante imaging microscopico della distanza percorsa. Sia il test camera di Boyden e il sotto-agarosio test di solito sono configurati come i saggi degli endpoint. Il automatizzato ECIS / Taxi sistema combina la sotto-agarosio approccio con impedenza di rilevamento elettrico Cell-substrato (ECIS) 5, 6. In questo saggio, elettrodi bersaglio si trovano in ciascuna delle camere 8. Una grande contro-elettrodo attraversa ciascuna delle camere 8 (Figura 2). Ciascuna camera è piena di agarosio e due pozzetti sono il taglio in agarosio su entrambi i lati dell&#39;elettrodo bersaglio. Un pozzetto viene riempito con la popolazione cellulare di test, mentre l&#39;altra contiene le fonti di chemioattraente diffusione (Figura 3). Corrente passata attraverso il sistema può essere usato per determinare la variazione di resistenza che si verifica come cellule passare l&#39;elettrodo bersaglio. Celle sul bersaglio elettrodoe aumentare la resistenza del sistema 6. Inoltre, rapide fluttuazioni della resistenza rappresentano cambiamenti nelle interazioni delle cellule con la superficie dell&#39;elettrodo e sono indicative di variazioni di forma in corso cellulari. Il ECIS / taxi sistema può misurare il movimento della popolazione cellulare in tempo reale per lunghi periodi di tempo, ma è anche abbastanza sensibile da rilevare l&#39;arrivo di una singola cellula all&#39;elettrodo bersaglio. Dictyostelium discoidium è noto di migrare in presenza di un gradiente di folato 7, 8 e la sua risposta chemiotattica può essere misurato da ECIS / Taxis 9. Chemiotassi dei leucociti, in risposta a SDF1α e antagonisti di chemiotassi è stata misurata con ECIS / Taxi 10, 11. Un esempio della risposta di leucociti SDF1α è mostrato in Figura 1.

L&#39;ECIS / Taxi sistema è un sistema automatico, in tempo reale test che misura chemiotassi cellulari. In questo saggio, cellule si muovono sotto uno strato di agarosio per arrivare ad un elettrodo bersaglio. Movimento cellulare è misurata dalla comparsa di resistenza a 0 corrente alternata.

Misura della chemiotassi cellulari con ECIS / Taxi

Il movimento cellulare in risposta a stimoli esterni è fondamentale per molti processi cellulari, tra cui la guarigione delle ferite, l'infiammazione e la risposta a...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la chemotassi in un saggio automatizzato in tempo reale, che utilizza il rilevamento dell'impedenza elettrica tra cellule e substrato, o EISs. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto gli elettrodi axxis riempiendo ogni camera con agarosio al 0,5% in mezzo RPMI completo. Il passaggio successivo consiste nel tagliare contemporaneamente due pozzetti nell'agarosio di ogni camera mediante un dispositivo guida con cannula calibro 14 e nell'aspirare i due tappi di agarosio da ogni camera.Un pozzetto viene riempito con una sospensione di singole cellule, mentre l'altro viene riempito con un chemiotattico. Successivamente, l'elettrodo viene collegato al sistema ISIS theta attraverso il portapiastra, che viene posizionato in un incubatore impostato su parametri atmosferici appropriati per il tipo cellulare in esame. Infine, la chemotassi cellulare può essere osservata misurando in tempo reale la variazione di resistenza man mano che le cellule raggiungono l'elettrodo bersaglio posto tra i due pozzetti.Il principale vantaggio del saggio axxis rispetto ai metodi esistenti, come il saggio della camera di Boyden o i saggi convenzionali al microscopio basati su agros, è che consente misurazioni automatizzate in tempo reale della chemotassi senza la necessità di manipolazioni continue del sistema. Per iniziare la preparazione degli elettrodi, stabilizzare la superficie d'oro dell'array di elettrodi ISIS Texas mediante un pretrattamento con 10 millimoli di cisteina sterile in acqua deionizzata per 15 minuti a temperatura ambiente in condizioni sterili. Al termine del pretrattamento, aspirare la soluzione di cisteina da ogni camera degli elettrodi.Sciacquare tre volte con acqua deionizzata sterile e sostituire con 250 microlitri di mezzo completo. Successivamente, collegare l'array di elettrodi ai perni di contatto sul supporto dell'array dello strumento per eseguire un controllo degli elettrodi. Le camere correttamente collegate verranno evidenziate in verde sullo schermo del computer.Se le camere sono evidenziate in rosso, non sono collegate e l'elettrodo deve essere riposizionato nel supporto dell'array per stabilire i contatti per tutte le camere. Una volta che tutte le camere sono collegate, fare clic sul pulsante di verifica nel controller del software ISYS Theta per determinare i valori iniziali di resistenza e capacità per ciascuna camera; i valori di resistenza devono essere compresi tra 1600 e 2000 ohm e i valori di capacità tra cinque e sei nanofarad per un array a otto camere. Se una singola camera non rientra in questi parametri accettabili, non deve essere utilizzata per raccogliere dati.Successivamente, scollegare l'elettrodo dal supporto dell'array per preparare le singole camere aros. Aspirare il mezzo dalle camere e lavare ogni camera tre volte con acqua deionizzata sterile. Per iniziare l'allestimento delle camere aros, preparare una soluzione aros contenente mezzo RPMI come descritto nel protocollo scritto.Aspirare 300 microlitri di mezzo aros fuso in ogni camera, quindi aspirare l'agros rimanente nel tappo di un tubo da 15 millilitri. Per valutare la solidificazione dell'agros, sostituire il coperchio dell'array ISIS axxis e lasciare solidificare a temperatura ambiente per costruire la cannula riutilizzabile. Affilare con l'apposito strumento da taglio due cannule da 14 gauge con estremità ottusata.Utilizzando una punta da cinque sessantaquattresimi di pollice, ruotare la punta del trapano all'interno di ogni apertura della cannula con un trapano a bassa velocità, assicurandosi che la punta tagli l'intero bordo interno di ciascuna apertura della cannula. Per creare un bordo tagliente, praticare due fori attraverso il plexiglass con una punta da cinque sessantaquattresimi di pollice. Utilizzando un trapano a colonna, inserire ciascuna cannula da 14 gauge affilata in uno dei fori in modo che ciascuna sporga alla stessa distanza dal plexiglass.Sterilizzare lo strumento con cannula da 14 gauge leggermente flameggiando le punte della cannula prima di tagliare i pozzetti nella camera EIS. Raffreddare la cannula toccando l'agarosio nel tappo del tubo da 15 millilitri. Se la temperatura della cannula non viene abbassata, l'agarosio si scioglierà durante il taglio dei pozzetti nella camera, causando pozzetti deformati e difettosi.Tagliare i pozzetti senza compromettere l'integrità degli agros è l'aspetto più difficile di questa procedura. Ciò richiede un accurato allineamento della cannula e una pressione di vuoto molto bassa. Allineare la coppia di cannule sopra i due punti dorati che circondano l'elettrodo bersaglio in ogni camera.Inserire la cannula verticalmente senza alcun movimento orizzontale, fermandosi al contatto delicato tra la cannula e la superficie dell'elettrodo. Rimuovere con attenzione la cannula nuovamente senza alcun movimento orizzontale, utilizzando una pipetta Pasteur sterile da cinque pollici collegata a una pressione di vuoto bassa con un trappola per vuoto. Per raccogliere i residui di agarosio, aspirare delicatamente i tappi di agarosio lasciati dallo strumento della cannula.Quindi aggiungere 300 microlitri di mezzo RPMI completo sulla superficie di ogni camera a 37 gradi Celsius per due minuti, per saturare gli aros. Dopo due minuti, aspirare delicatamente il mezzo dalla superficie e dalle pozzette senza disturbare gli aros. Ogni pozzetta è in grado di contenere un volume di sette microlitri per una singola pozzetta in ogni camera e sette microlitri di sospensione cellulare.In questa dimostrazione, le cellule T jca vengono utilizzate a una concentrazione di due volte 10 alla sette cellule per millilitro. Successivamente, aggiungere sette microlitri di chemoattrattante nel secondo pozzetto delle camere. Per le cellule T JCA, 200 nanogrammi per millilitro di sdf uno alfa diluito in mezzo incompleto.RPMI viene utilizzato come chemiotattante per un controllo negativo del carico. Sette microlitri di solo mezzo completo nel secondo pozzetto. Dopo il caricamento dei pozzetti, esaminare ogni camera dell'array con un microscopio invertito per assicurarsi che tutti i pozzetti siano stati tagliati e riempiti correttamente.Le cellule devono trovarsi entro i limiti del bordo dei pozzetti. Se si osservano cellule in entrambi i pozzetti o se si espandono oltre il bordo del pozzetto, si forma un'apertura sotto gli aros. Si noti che i pozzetti impostati in modo non corretto non consentono un'interpretazione affidabile dei dati provenienti da quelle camere.Per iniziare la raccolta dei dati, posizionare l'elettrodo nel supporto dell'array. Ricollegare i pad d'oro dell'array elettrodico ai perni a molla del set di aggancio del supporto configurato nel software ISIS theta. I pozzetti correttamente connessi verranno evidenziati in verde.Se i pozzetti sono rossi, non sono collegati e l'elettrodo deve essere riposizionato nel supporto dell'array tramite il menu a tendina. Nel pannello del software, selezionare otto W uno punto e virgola. Questo indica la configurazione dell'array. Otto.Per ogni pozzetto, nel pannello di controllo del software selezionare la casella per determinare i valori iniziali di resistenza e capacità. Per ciascun pozzetto, selezionare più frequenze per misurare la resistenza a diverse frequenze. La raccolta di dati a più frequenze consente l'analisi della capacità, dell'impedenza e della resistenza.È possibile scegliere tra la personalizzazione delle frequenze o l'utilizzo di un insieme di frequenze raccomandate. Le impostazioni standard di acquisizione multifrequenza registreranno i dati a 11 frequenze preimpostate con una velocità di otto pozzetti al minuto. L'intervallo di tempo tra le misurazioni può essere personalizzato anche.La durata totale dell'esperimento può essere impostata nel pannello a destra. In alternativa, l'esperimento può essere interrotto manualmente facendo clic su fine. Una volta che le cellule hanno prodotto una resistenza indicativa dell'arrivo all'elettrodo, fare clic su avvio per iniziare la raccolta dei dati.Sebbene i dati possano essere esportati in Excel, il software EISs 1600 R fornito con il sistema EISs theta rappresenta il metodo più efficiente per analizzare i dati delle tasse EISs. La barra degli strumenti di analisi dati del software contiene i pulsanti radio Z, R e C, che determinano rispettivamente se impedenza, resistenza o capacità vengono tracciate sull'asse verticale rispetto all'asse X, che rappresenta il tempo trascorso. I dati delle tasse EISs sono visualizzati in modo più efficiente come resistenza nel tempo a 4.000 hertz.Le fluttuazioni rapide della resistenza o i micro transitori sono indicativi di movimenti cellulari sopra l'elettrodo; comporre o interpolare i punti dati in modo che non tutti i punti vengano riportati non è consigliato per l'asse esys, poiché ciò medierebbe i micro transitori, rimuovendoli dai dati. Una volta creato il grafico, con il software ISIS 1600 R è possibile esportarlo selezionando "esporta grafico" dal menu file e salvarlo come file A o JPEG.I linfociti T JERK CAT umani sono stati esposti a un gradiente di SDF-1α per stimolare il movimento o a RPMI 1640 come controllo negativo. La resistenza normalizzata a 4.000 hertz è riportata qui. La chemotassi cellulare è indicata da un aumento della resistenza a 4.000 hertz quando i linfociti T J CAT umani si muovono in risposta all'SDF-1α.L'arrivo delle cellule sull'elettrodo bersaglio è indicato dalla comparsa di rapide fluttuazioni della resistenza chiamate microtransienti. L'aumento della resistenza è direttamente proporzionale al numero di cellule che attraversano l'elettrodo. Un risultato negativo è indicato da una resistenza stabile o da una leggera diminuzione della resistenza a 4.000 hertz.Questo si osserva quando le cellule sono state esposte a RPMI 1640. L'assenza di micro transitori è anche un segno dell'assenza di movimento cellulare all'elettrodo. Oltre a questa procedura di base, possono essere apportate altre modifiche per utilizzare Esys, Texas al fine di monitorare il movimento cellulare in presenza di anticorpi monoclonali specifici per un chemiotattrante, modificatori farmaceutici o tossine.

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