Name: Determinazione del conteggio delle cellule dei mammiferi, le dimensioni delle cellule e la salute delle cellule utilizzando il Moxi Z Mini contaglobuli automatizzato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 16 s
Description: Scopri il conteggio cellulare automatizzato con Moxi Z utilizzando il principio di Coulter e cassettes microfluidiche. Questo metodo fornisce risultati accurati in otto secondi per colture cellulari di mammiferi.

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1. Preparazione di campioni <ol><li> Diluire la sospensione cellulare con ORFLO diluente o un diluente appropriato in modo che la concentrazione cellulare è all&#39;interno del campo di funzionamento dello strumento (da 3.000 a 500.000 cellule / ml per cassette di tipo M, o 3.000 a 2.500.000 cellule / ml per cassette Type S). </li><li> Una diluizione di 1:05-01:20 (tipo cassette M) o nessuna diluizione per diluizione 1:5 (cassette Type S) è consigliata per linee cellulari la maggior parte dei mammiferi, ma la diluizione appropriata dipenderà dal tipo di cellula e densità di semina. Il volume richiesto per un conteggio preciso è di circa 75 pl. </li></ol> 2. Di utilizzare i campioni <ol><li> Girare la Z Moxi premendo il pulsante di accensione e la schermata iniziale verrà visualizzata. </li><li> Premere il vassoio e inserire una cassetta nel Z. Moxi Il campione Pipettare 75μL ... Verrà visualizzata la schermata. </li><li> Pipettare un campione di 75 microlitri nella porta di riempimento della cassetta (ovale bluetichettati 1 o 2, a seconda estremità della cassetta è stata inserita nello strumento). Queste sono le cassette monouso, che possono essere utilizzati per 2 test. Nota: Posizionare la punta della pipetta direttamente nel caricamento bene a ~ 45 ° angolo in modo che la punta e &#39;colto sotto il bordo anteriore del bene. Quando erogazione, è importante che il vuoto non &quot;andare avanti&quot; della erogazione del fluido come potrebbe causare sacche d&#39;aria di entrare la cassetta. Si raccomanda di avere un piccolo tallone (la dimensione di entrata e) di forma fluida sul pozzo durante l&#39;erogazione. </li><li> Per il conteggio delle cellule di mammifero più, toccare lo schermo per iniziare ovunque. Per il conteggio delle particelle molto piccole (da 4 a 8 micron diametro medio per Tipo M e 3-8 micron di diametro medio di Type S), la Z Moxi può essere eseguito in modalità di particelle di piccole dimensioni. Nota: il tipo di cassetta viene indicato nella barra nera nella parte superiore dello schermo. In questo modo, Moxi Z determina la scala di diametro da 2 a 10 um come predefinito ed esegue il conteggio ucantare parametri ottimizzati per il rilevamento di piccole cellule. Premere il piccolo pulsante TOUCH QUI Modalità di particelle (nero quadrato) per avviare ed eseguire il test in questa modalità. </li><li> La Z Moxi inizierà il test ed i risultati delle celle di conteggio sarà completato in circa 8 secondi (tipo cassette M) o 15 secondi (cassette Type S). </li><li> Il Curve Fitting e calcoli MVI iniziare automaticamente e richiede solo pochi secondi supplementari. Quando un accoppiamento idoneo viene trovato, i risultati vengono automaticamente visualizzato sullo schermo. </li><li> Per rendere Gating modalità di acquisizione predefinita, premere il tasto Count Curve Fit per passare in modalità Gating. </li><li> A questo punto la cassetta può essere rimosso dall&#39;unità. </li></ol> 3. Gestione dei dati <ol><li> Se il ridimensionamento AutoMode è spento, i risultati vengono visualizzati inizialmente per un conteggio curva di adattamento su una scala diametro di 2-34 micron (tipo cassette M) o 2-26 μm (cassette Type S). Se il ridimensionamento Automode è, allora il Z Moxi automaticamente scala l&#39;asse orizzontale (asse x) per l&#39;intervallo che è più vicina alla larghezza della curva-fit popolazione garantendo nel contempo tutti curva-fit dati visualizzati. </li><li> Se il ridimensionamento AutoMode è spento, per visualizzare manualmente i risultati a una risoluzione più alta, toccare l&#39;icona di 2-26 micron (Tipo M) o l&#39;icona di 2-18 micron (Type S). Nota: Il tipo di cassetta viene indicato nella casella blu in alto a sinistra dello schermo. Questa opzione è consigliata quando si contano più piccole cellule o particelle per migliorare sia le curve-fitting funzionalità nonché la capacità dell&#39;utente di discriminare visivamente sfumature dei dati. </li><li> Su aumentare la risoluzione orizzontale, il pulsante di scala regola dinamicamente per consentire il ciclismo tra i disponibili x-asse campi scala: 2-34, 2-26 e 2-18 e 2-10 micron per il cassetto di tipo M o 2 -26, 2-18 e 2-10 micron per cassette del tipo S. Questa funzione è solo dispobile immediatamente dopo un numero di celle. </li><li> Contare le informazioni (cellule / ml) per la curva-fit o regione gated viene visualizzato in una scatola nera sotto il lato sinistro dell&#39;istogramma. Informazioni media dimensione della cella viene visualizzata nella scatola nera sul lato destro dell&#39;istogramma. </li><li> Il valore MVI viene visualizzato un riquadro blu in alto a destra dell&#39;istogramma. Se il test è stato eseguito in modalità piccola particella, il MVI non si applica e verrà visualizzata come &quot;MVI = SPM&quot;. Inoltre, se la concentrazione di cellule è al di fuori del campo di funzionamento MVI, un messaggio di &quot;MVI = Out of Range&quot; sarà visualizzato. </li><li> Per salvare l&#39;istogramma corrente, toccare l&#39;icona Fatto. Ciò consente di risparmiare i dati con il nome di &quot;Test XXX&quot; dove XXX è il numero di test corrispondente. </li><li> Per cancello manualmente l&#39;istogramma, toccare per far passare la Fit Curve conteggio risultati pulsante. Ciò rende Gating modalità di acquisizione predefinita. Quindi, far scorrere ciascun indicatore blu gating per impostare le porte o toccare thle frecce destra e sinistra di e (queste appaiono dopo aver toccato l&#39;indicatore blu gating) per le regolazioni fini del cancello solo le celle comprese tra i marcatori sono contati. La scala istogramma verticale viene automaticamente ridotta basa sulla curva-fit ampiezza popolazione. Per regolare questa scala verticale, scorrere lo schermo verso l&#39;alto o verso il basso nella regione istogramma. </li><li> Toccare il tasto Gated Count risultati per riportare il display in modalità curva in forma e fare modalità curva di adattamento la modalità di acquisizione predefinita. </li><li> Quindi premere l&#39;icona Fine per salvare i risultati e tornare alla schermata Home. Per eliminare i risultati, premere sul pulsante Elimina in qualsiasi momento per eliminare definitivamente i risultati del test. </li></ol> 4. Analisi dei dati precedentemente acquisiti <ol><li> Per aprire un test salvato, premere l&#39;icona Istogramma sulla schermata Home. </li><li> Icone per un massimo di nove istogrammi salvate verranno visualizzate sullo schermo.Premere l&#39;icona appropriata per il test di interesse o premere il pulsante Pagina su o Pagina giù icone per visualizzare i risultati dei test più. </li><li> Ogni istogramma sarà aperto in entrambe le modalità di Conte Adattamento curva o in modalità Count Gated, a seconda di come è stato salvato. In modalità Count Gated, marcatori gating può essere posizionato a piacimento facendo scorrere ciascun indicatore blu gating in modo indipendente. Porta Auto toccando il picco desiderato. Toccare per passare tra il Conte e la Curva Gated modalità Count Fit. </li><li> Premere le icone Zoom e Unzoom per regolare la scala verticale dell&#39;istogramma. La scala verticale può essere modificato anche in senso verticale strisciando il dito sul up display (per aumentare) o verso il basso (per diminuire). </li><li> Premere l&#39;icona Delete per eliminare definitivamente i risultati del test. </li><li> Premere l&#39;icona Fine perchiudere i risultati del test e tornare alla schermata Home. (Nota: vista ingrandita non verranno salvate.) </li></ol> 5. Trasferimento dati su un PC <ol><li> I dati possono essere trasferiti a un PC utilizzando l&#39;applicazione Moxichart Orflo o tramite bonifico USB collegando il Moxi Z cavo USB a un PC o Mac. Per il trasferimento Bluetooth (MoxiChart), in primo luogo determinare ID Bluetooth dell&#39;unità premendo l&#39;icona Bluetooth nella schermata iniziale del gruppo Moxi Z. </li><li> Sul computer, aprire l&#39;applicazione MoxiChart e fare clic sull&#39;icona Bluetooth in alto a destra. Quindi, scegliere il dispositivo che corrisponde alla ID Bluetooth del Z Moxi e selezionare una cartella di destinazione per i file caricati. </li><li> Moxichart trasferirà automaticamente tutti i file nella directory specificata tramite la connessione Bluetooth. </li><li> I file trasferiti via Bluetooth (MoxiChart) o USB può essere aperto e analisized direttamente con l&#39;applicazione MoxiChart o, perché sono formattati. file CSV, possono essere aperti direttamente in Microsoft Excel o altri programmi di analisi dei dati per l&#39;analisi in aggiunta / custom. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Per valutare la precisione e l&#39;accuratezza della Z Moxi, conta di cellule HEK-293, le cellule HeLa e CHO-K1, lievito, Jurkat E6-1 le cellule, le cellule PC12 e precisione calibrata sospensioni tallone con concentrazioni che vanno da 0-500,000 cellule / mL (Type cassetta M) e 0-2-2.5E 6 cellule / ml (cassetta tipo S) sono state contate e confrontate con Coulter Z2 e la Z. Moxi Tutte le cellule di mammifero sono stati ottenuti dalla American Type Culture Collection (ATCC) e coltivate come precedentemente descritto 7-11. Brevemente, le cellule sono state coltivate in sospensione in 75 palloni di coltura tissutali mm 2 con mezzi principali di RPMI 1640 (Jurkat E6-1, PC12), MEM (HEK-293, HeLa) cellule, o F12K (CHO-K1) cellule. Tutti i media è stata integrata con10% di siero fetale bovino e 100 U penicillin/100 Streptomicina pg. Beute sono state mantenute in un incubatore a 37 ° C con 5% CO 2. Le cellule sono state diversi passaggi ogni 3 giorni. Cellule di lievito (X5, C. albicans, Vin 13) sono stati donati e utilizzato immediatamente, come previsto. Concentrazioni di campione iniziale di ~ 500.000 cellule / ml per i dati di tipo M cassette e ~ 2-2.5E 6 cellule / ml per le cassette del tipo S sono stati stabiliti utilizzando il Coulter Z2. Successivi livelli di concentrazione teoriche sono state preparate mediante diluizioni seriali con buffer fisiologici (ISOTON II o soluzione salina bilanciata di Hank). A ciascuna concentrazione, campioni identici sono stati misurati da entrambi i sistemi e tracciati contro l&#39;altro. Come si vede nella figura 2, vi era una forte correlazione lineare (Tipo M r 2&gt; 0,9886, di tipo S r 2&gt; 0,9781) tra i conteggi per tutti i campioni. Le concentrazioni sono state anche rispetto alle attese / teorica concentrazione cellulare sia con il Moxi Z e Z2 ( <strong&gt; Figura 3) e ancora una volta hanno dimostrato forti correlazioni lineari (tipo M r 2&gt; 0,9758, Type S r 2&gt; 0,9774). Per valutare la precisione, HEK-293 e conta di cellule HeLa sono state eseguite usando la Z2 Coulter, Moxi Z, e un emocitometro. Il coefficiente medio di variazione (CV, n = 19) della conta di cellule utilizzando la Z Moxi (tipo cassette M), Coulter Z2 e un emocitometro sono stati calcolati con CV è misurata dal 5 punti distinti negli 200.000-300.000 cellule / ml gamma. Il piccolo medio CV (Figura 4) del Z Moxi è paragonabile a quella del Z2 ed è rappresentativo del livello di precisione ottenibile solo con tecnologie basate conteggio Coulter. Dimensionamento di precisione dello strumento Moxi Z è stata valutata il prossimo attraverso la misurazione del acquistati, perle di polistirene di precisione calibrati. Misurazioni medie dimensione delle particelle (n = 5) da Moxi Z sono state rilevate in dimensioni produttore segnalati. Come si può vedere in figura 5, le misurazioni Z Moxi matching i valori produttore con un&#39;alta correlazione lineare (r 2 = 0,9989). Oltre a informazioni su dimensioni e numero, Moxi Z fornisce un reagente-free, la valutazione generale di salute dei mammiferi coltura cellulare con un indice di vitalità riportato Moxi (MVI) valore. Questo indice è generato da un rapporto tra il numero di cellule nella popolazione di interesse rispetto ai conteggi totali di particolato. Per dimostrare le capacità di misurazione MVI, letture MVI (tipo cassette M) sono stati confrontati al manuale standard e flussocitometrici Live / Dead tecniche di misurazione. Popolazioni di morti (&lt;10% vitali) HEK-293 e cellule HeLa sono state create per mezzo di incubazione overnight delle cellule vive in un nutriente-free, fluoruro di sodio contenente diluente (ISOTON II, Beckman Coulter) a 37 ° C. Controllati i livelli di vitalità teorici sono stati preparati da ratiometrically concentrazioni mescolando note di cellule vive e morte. Resulting soluzioni sono state analizzate per i livelli di redditività in duplicato con entrambi i conteggi e le misurazioni emocitometro citometro a flusso. Misurazioni emocitometro state effettuate utilizzando un tradizionale miscela 50/50 del 0,1% soluzione Trypan Blue e cellule. Misurazioni di citometria a flusso sono state effettuate utilizzando un citometro Guava PCA (Merck) usando il reagente Viacount e il fabbricante-specificato protocollo (Merck). Come mostrato in figura 6, i valori di correlazione di Pearson (r 2) &quot;del fit lineare dei dati MVI a percentuali analoghe vitalità emocitometro per&quot; cellule HEK e cellule HeLa sono state r 2 = 0,9937 e R 2 = 0,9728, rispettivamente. Questi risultati dimostrano che questo approccio fornisce informazioni sulla salute della cultura in una vasta gamma di cellulari Viabilità che confrontano favorevolmente le misure Live / Dead ottenuti utilizzando un citometro a flusso o emocitometro. Tabelle e figure (Da Dittami et al, 2011.) 15: Figura 1. A film sottile Conteggio Coulter: La corrente elettrica viene fatta passare attraverso la zona di rilevamento della cella a film sottile cassetta. Mentre le cellule fluire unico file attraverso il CSZ, gli aumenti momentanei di tensione sono misurati dalla Z. Moxi <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3842/3842fig2.jpg" /> Figura 2. Moxi conteggi Z sono paragonabili a Coulter Z2 conteggi. Conteggi identici di sospensioni cellulari e tallone sono stati contati utilizzando sia un Coulter Z2 e la Z. Moxi valori medi di conteggio (n = 3-4) dei conteggi Z Moxi sono stati tracciati rispetto al Coulter Z2 corrispondenti conti e 2 r valori del fit lineare sono stati determinati. A) cassette di tipo M - intervallo di concentrazione 0 - 500.000 cellule / ml. B) cassette di tipo S - intervallo di concentrazione di 0 - 2-2.5E 6 / Bar ml.Error indicano ± 1 deviazione standard. Figura 3. Moxi misure di concentrazione Z vs concentrazioni cellulari teorici. A) cassette di tipo M - I valori di concentrazione teorici sono stati preparati da diluizioni seriali di un primo campione di 500.000 cellule / ml B) cassette di tipo S -. Valori di concentrazione teorici sono stati preparati da diluizioni seriali di un iniziale 2 - 2.5E 6 cellule / ml di campione. Barre di errore indicano ± 1 deviazione standard. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3842/3842fig4.jpg" /> Figura 4. Coefficiente di variazione per la Z2 Coulter, Moxi Z (tipo cassette M), e emocitometro. Il coefficiente medio di variazione (CV, n = 19) di HEK-293 e conta delle cellule HeLa per ciascun approccio sono stati calcolati con i CV misurati da separato da 5 conti di HEK-293 e cellule HeLa in 200.000 - 300.000 cellule / ml gamma. Barre di errore indicano ± 1 deviazione standard. Figura 5. Precisione di misurazione delle dimensioni delle particelle che utilizzano Moxi Moxi Z-Z misurata dimensione tallone (tipo cassette M) vs produttore riportato dimensioni tallone. Barre di errore indicano ± 1 deviazione standard. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3842/3842fig6.jpg" /> Figura 6. Cultura della valutazione della sanità con MVI - Confronto di misure di MVI (tipo cassette M) e Guava PCA vitalità Viacount rispetto visive, trypan-blu conta vitalità colorarle con un emocitometro.

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Gregory M. Dittami e HE Ayliffe sono dipendenti di Orflo Technologies, la società che ha progettato, produce e vende il Moxi Z. Richard D. Rabbitt offre part-time, esperienza di consulenza pagato per Orflo Technologies. Produzione e l&#39;accesso gratuito a questo articolo è sponsorizzato da Technologies Orflo.

L&#39;implementazione sottostante l&#39;approccio Coulter possono essere altamente deterministica della precisione complessiva delle misurazioni. Un&#39;area critica è la correzione dei conti delle cellule prime per &quot;coincidenza&quot; eventi in cui due o più celle contemporaneamente passare attraverso l&#39;apertura e sono misurati come un singolo evento elettrica. &quot;Eventi coincidenza&quot; contribuire errore che varia a seconda di diversi fattori tra cui le dimensioni delle cellule e del grado di raggruppamento (Davis et al 1967) 6. Come risultato, la correzione coincidenza necessario per qualsiasi dato campione non può essere prevista, varia ampiamente tra cellule / particella tipi e anche tra le culture di tipi cellulari identici. Stabilito teoria, radicata in pubblicazioni iniziali da Coulter, consiste nell&#39;applicare una regolazione logaritmica dei conteggi in base al numero di eventi osservati e uno empiricamente-determinato, particelle specifico fattore di correzione, z. Mentre conteggi accurati possono essere adeguatamente raggiunti con til suo algoritmo di correzione, è limitata nella sua applicazione pratica a causa delle forti variazioni tra i valori di z tipi di cellule e la difficoltà corrispondente prevedere con precisione il suo valore. Qui, con il conteggio &quot;vero&quot; cella identificata dalla curva di raccordo Moxi Z insieme con l&#39;algoritmo di correzione coincidenza, la Z Moxi corregge dinamicamente per coincidenza per ottenere le concentrazioni reali. Rispetto ai risultati ottenuti con high-end Coulter Z2, la Z Moxi prodotto conta comparabili tra un intervallo di concentrazione di 0 - 500.000 cellule / ml (tipo cassette M) e 3000 - 2-2.5E 6 cellule / ml (cassette Type S) . Inoltre, la Z Moxi raggiunge questa precisione conteggio con un basso coefficiente di variazione simile in conteggi e una precisione nel dimensionamento delle particelle che è caratteristica del sistema aureo, Coulter-tecnica conteggio delle cellule. Inoltre, i dati qui presentati indicano che la Z Moxi fornisce utiliper quanto riguarda la salute generale di colture cellulari. La Z Moxi sfrutta l&#39;approccio raccordo curva con un algoritmo software proprietario per determinare questa valutazione della salute della cultura. Cambiamenti morfologici associati con la morte delle cellule, come ad esempio blebbing, rompendo uno dall&#39;altro, e le distorsioni volumetriche (Kataoka e Tsuruo 1996, Liegler et al 1995, Sheridan et al 1981) 12-14, rendono possibile per il Moxi-Z di distinguere le differenze tra impedimetric vivono popolazioni e morti cellulari / detriti popolazioni. Il MVI è generata analizzando la cultura / distribuzione delle dimensioni delle particelle di identificare i contributi relativi di detriti, rattrappito cellule necrotiche, e la curva-misura popolazione di cellule di interesse. Il valore MVI riflette quindi un indice di popolazione o misura raziometrica dei conteggi popolazione monodisperse rispetto al profilo complessivo popolazione di particelle. Questo valore viene quindi regolata algoritmicamente-statistiche basati sulla popolazione e le osservazioni empiriche. Because la MVI guarda altri parametri rispetto agli approcci tradizionali colorazione, non si prevede il mirroring queste tecniche ma fornisce invece una vista valida alternativa nella salute di una coltura cellulare, in particolare per quanto riguarda i detriti e contaminanti microbici. In sintesi, il Moxi-Z contatore di cellule è uno strumento ultra da banco di piccole dimensioni che fornisce precise e riproducibili saggi di conta delle cellule, le dimensioni delle cellule, e la salute delle cellule che utilizzano il principio Coulter e la curva-montaggio algoritmi software in combinazione con un sistema brevettato a film sottile tecnologia dei sensori . Con la cassetta M tipo è in grado di contare particelle da 4 a 25 micron di diametro (gamma dinamica di 2 - 34 micron), in 8 secondi. Con il cassetto Type S è in grado di contare particelle che varia da 3 - 20 micron di diametro (gamma dinamica di 2 - 26 micron), in 15 secondi. Inoltre, il Moxi-Z effettua gli accertamenti sanitari senza l&#39;uso di reagenti. E &#39;inte lavoro molto menodispendiose e soggettiva del conteggio manuale. In confronto al conteggio standard Coulter, la Moxi è più veloce, significativamente più piccolo, fornisce ulteriori informazioni, richiede una manutenzione molto meno, è più facile da usare, ed è una frazione del costo.

<table border="1" ><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> ORFLO Diluente </td><td> ORFLO </td><td> MXA006 </td><td></td></tr><tr><td> Cassette Dispenser </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Memorizza fino a 25 cassette per comodo di erogazione </td></tr><tr><td> Cavo USB </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Collega strumento per PC / Mac o adattatore di alimentazione </td></tr><tr><td> Power Adapter (modelli USA e UE) </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Si collega il cavo USB ad una presa CA </td></tr><tr><td> USB Flash Drive </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Negozi MoxZ i software e manuale utente </td></tr><tr><td> Controllo della calibrazione Beads </td><td> ORFLO </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Calibrazione cassetta elettronica </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Cassetta elettronica per verificare il buon funzionamento del sistema e taratura </td></tr></tbody></table>

determinazione del conteggio delle cellule dei mammiferi, le dimensioni delle cellule e la salute delle cellule utilizzando il moxi z mini contaglobuli automatizzato

Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Il conteggio di particelle e cellule è utilizzato per diverse applicazioni, tra cui la coltura cellulare di routine, l'analisi ematologica e i controlli industriali1-5. Una svolta fondamentale nelle tecnologie di conteggio di cellule/particelle fu lo sviluppo della tecnica Coulter da parte di Wallace Coulter oltre 50 anni fa. La tecnica prevede l'applicazione di un campo elettrico attraverso un'apertura di dimensioni micrometriche e il focalizzazione idrodinamica di singole particelle attraverso l'apertura. L'occlusione risultante dell'apertura da parte delle particelle produce una variazione misurabile dell'impedenza elettrica che può essere direttamente e precisamente correlata alla dimensione/volume della cellula. Il riconoscimento di questo approccio come standard di riferimento nel conteggio di cellule/particelle deriva dalla straordinaria precisione e accuratezza nella determinazione delle dimensioni e del numero delle particelle, in particolare rispetto alle tecnologie manuali e basate su immagini (accuratezze dell'ordine del 98% per i contatori Coulter rispetto al 75-80% per i sistemi manuali e basati su visione). Ciò è attribuibile al fatto che, a differenza degli approcci basati su immagini per il conteggio cellulare, la tecnica Coulter effettua una vera misurazione tridimensionale (3D) di cellule/particelle, riducendo drasticamente le interferenze nel conteggio dovute a detriti e aggregazioni, grazie al calcolo di informazioni volumetriche precise sulle cellule/particelle. Nel complesso, ciò fornisce un metodo per enumerare e dimensionare le cellule in modo più accurato, meno noioso, meno dispendioso in termini di tempo e meno soggettivo rispetto ad altre tecniche di conteggio6.
Nonostante il ruolo di primo piano della tecnica di Coulter nel conteggio cellulare, il suo utilizzo diffuso negli studi biologici di routine è stato limitato a causa del costo e delle dimensioni degli strumenti tradizionali. Sebbene sia stato prodotto uno strumento basato su Coulter meno costoso, esso presenta limitazioni rispetto ai modelli più costosi nella correzione degli "eventi di coincidenza", nei quali due o più cellule attraversano simultaneamente l'apertura e vengono misurate insieme. Un'altra limitazione delle attuali tecnologie di Coulter è l'assenza di parametri relativi allo stato generale di salute dei campioni cellulari. Di conseguenza, spesso è necessario utilizzare tecniche aggiuntive insieme al conteggio di Coulter per valutare la vitalità cellulare. Ciò aumenta il tempo e il costo della configurazione sperimentale, poiché i metodi tradizionali di valutazione della vitalità richiedono la colorazione delle cellule e/o l'uso di apparecchiature costose e ingombranti, come il citometro a flusso.
Il contatore cellulare automatico Moxi Z mini, descritto in questo articolo, è uno strumento da banco estremamente compatto che combina la precisione del principio di Coulter con una tecnologia di sensori a film sottile, consentendo la misurazione precisa e il conteggio di particelle comprese tra 3 e 25 micron, a seconda della cassetta per il conteggio cellulare utilizzata. La cassetta di tipo M può essere impiegata per contare particelle con diametro medio compreso tra 4 e 25 micron (intervallo dinamico da 2 a 34 micron), mentre la cassetta di tipo S è adatta per particelle con diametro medio compreso tra 3 e 20 micron (intervallo dinamico da 2 a 26 micron). Poiché il sistema utilizza un metodo di misurazione volumetrica, l'intervallo di 4-25 micron corrisponde a un volume cellulare compreso tra 34 e 8.180 fL, mentre l'intervallo di 3-20 micron corrisponde a un volume cellulare compreso tra 14 e 4.200 fL, informazione rilevante quando si misurano particelle non sferiche. Per effettuare il conteggio di cellule di mammifero con il Moxi Z, le cellule da contare vengono dapprima diluite con ORFLO o un diluente simile. Una cassetta per il conteggio cellulare viene inserita nello strumento e il campione viene caricato nell'apposito ingresso della cassetta. Nel giro di 8-15 secondi, migliaia di cellule vengono aspirate in fila singola attraverso una "Zona di Rilevamento Cellulare" (CSZ) presente nella membrana a film sottile. Al termine dell'analisi, lo strumento utilizza un algoritmo software proprietario insieme a un metodo di interpolazione curvilinea proprietario per correggere gli eventi di coincidenza e valutare lo stato generale della coltura, determinando il rapporto tra il numero di cellule nella popolazione di interesse e il numero totale di particelle. Il conteggio totale delle particelle include cellule morte raggrinzite e disgregate, nonché altri detriti e contaminanti. I risultati vengono presentati in formato istogramma con un adattamento automatico della curva e con soglie regolabili manualmente secondo necessità.
In definitiva, il Moxi Z consente un conteggio con una precisione e un'accuratezza paragonabili a quelle del Coulter Z2, attualmente considerato lo standard di riferimento, fornendo al contempo ulteriori informazioni sullo stato di salute della coltura. Inoltre, questo strumento raggiunge tali risultati in meno tempo, occupando uno spazio ridotto, con un funzionamento e una manutenzione notevolmente più semplici e a una frazione del costo delle tecnologie comparabili.

Il Moxi Z contatore di cellule in miniatura automatizzato è un nuovo strumento che combina il Principio Coulter con brevettata tecnologia a film sottile sensore e un algoritmo software proprietario per eseguire il dimensionamento e il conteggio di una vasta gamma di dimensioni delle particelle, nonché per determinare la salute generale del monodisperse colture cellulari di mammifero. Questo protocollo descrive l&#39;uso di tale strumento per il conteggio e valutare la salute delle colture cellulari.

Determinazione del conteggio delle cellule dei mammiferi, le dimensioni delle cellule e la salute delle cellule utilizzando il Moxi Z Mini contaglobuli automatizzato

Il conteggio di particelle e cellule è utilizzato per diverse applicazioni, tra cui la coltura cellulare di routine, l'analisi ematologica e i controlli industriali1-5. Un ...

Il contatore cellulare automatico Mxi Z Mini è uno strumento da banco estremamente compatto che esegue conteggi altamente precisi di cellule e particelle. Combinando il principio TER, considerato il gold standard, con una tecnologia brevettata di sensori a film sottile. Le cassette utilizzate con il Mxi Z sono sensori microfluidici di precisione per ottenere il conteggio delle cellule.Una cassetta viene inserita nella parte anteriore dell'unità e 75 microlitri di campione vengono caricati nel porto del campione. Quando l'analisi inizia, le cellule vengono aspirate in fila singola attraverso una zona di rilevamento cellulare nella membrana a film sottile della cassetta, con migliaia di cellule per campione contate mentre attraversano la zona di rilevamento. Il volume preciso di ciascuna cellula viene determinato mediante una misurazione di impedenza.Dopo otto secondi, vengono visualizzati la concentrazione cellulare media, la dimensione media delle cellule e l'indice di vitalità cellulare, insieme a un istogramma ad alta risoluzione completo dell'intera popolazione di particelle. I dati del campione possono quindi essere analizzati e archiviati direttamente sullo strumento oppure trasferiti su un Mac o un PC tramite Bluetooth o USB. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri sistemi come emocitometri o contatori cellulari automatici basati su immagini è che essa risulta molto più affidabile, con un'accuratezza e una precisione superiori al 95%, a confronto con il 75-80% dei sistemi basati su immagini.Inoltre misura la dimensione delle cellule ed è molto più rapida e non è soggettiva. Sebbene questo metodo sia ideale per conteggiare un milione di cellule, può essere applicato a una vasta gamma di applicazioni di conteggio cellulare grazie al suo ampio intervallo dinamico.Queste applicazioni includono il conteggio dei globuli bianchi, dei globuli rossi, protozoi, alghe e lieviti. Iniziare questo esperimento diluendo una sospensione appena prelevata di cellule HEK 2 93 in un mezzo con conducibilità fisiologica, come diluente per flusso o PBS, fino alla concentrazione appropriata. Eseguire una triturazione delicata per minimizzare l'aggregazione cellulare e assicurarsi che l'unità sia scollegata dall'alimentazione elettrica.Quindi accendere l'mxi Z premendo il pulsante di alimentazione; verrà visualizzata la schermata iniziale. L'mxi Z utilizza cassette monouso di tipo M o S, che sono sensori microfluidici di precisione. Ogni cassetta presenta due porte di caricamento indicate da un'ovale blu e contrassegnate con uno o due.Ogni cassetta può essere utilizzata per due test. Le cassette di tipo M hanno un intervallo operativo compreso tra 3000 e 500.000 cellule per millilitro. L'intervallo per le cassette di tipo S è compreso tra 3000 e 2,5 milioni di cellule per millilitro.Premere verso il basso il vassoio e inserire una cassetta per garantire l'omogeneità del campione, invertendolo lentamente diverse volte. Quindi pipettare 75 microlitri di campione. Inserire fermamente la punta della pipetta nel porto del campione, tenendo la pipetta ad un angolo di 45 gradi, quindi rilasciare il campione nel porto con un unico movimento fluido, assicurandosi che tutto il campione sia stato dispensato.Toccare lo schermo nel cerchio designato o in qualsiasi punto al di fuori del riquadro della modalità particelle piccole per iniziare il conteggio. Il mxi Z avvierà il test e i risultati del conteggio cellulare saranno disponibili in otto secondi. Con la cassetta di tipo M, i risultati vengono visualizzati automaticamente mediante un algoritmo proprietario di interpolazione curva che seleziona la popolazione cellulare singola di interesse e corregge contemporaneamente il conteggio totale per la coincidenza.Eventi in cui più particelle o aggregati passano contemporaneamente attraverso la zona di rilevamento della cellula. Si noti che, sebbene questi eventi di coincidenza si trovino al di fuori dell'area di adattamento della curva a destra, essi sono comunque inclusi nel conteggio totale. Una volta trovato un adattamento adeguato, viene visualizzato un istogramma ad alta risoluzione dell'intera popolazione del campione, insieme ai valori numerici relativi alla concentrazione cellulare, al diametro medio e al volume medio.Inoltre, viene fornito un indice della popolazione di moxie o valore MPI come indicatore della salute generale della coltura. I conteggi più a sinistra dell'istogramma sono normali e rappresentano la soglia del rumore di fondo del sistema, regolata per ottimizzare la sensibilità dello strumento e i possibili conteggi di detriti nel campione. Al termine dell'analisi del campione, rimuovere la cassetta dall'unità, selezionare "fatto" per salvare e tornare alla schermata iniziale.Un indicatore visivo conferma che il campione &egrave; stato analizzato. Se si desidera analizzare un secondo campione, ruotare la cassetta e inserirla nell'apparecchio. Nuovamente, al termine di un'analisi in modalit&agrave; normale, i risultati vengono visualizzati con un adattamento della curva in base alla dimensione su una scala da quattro a 34 micron per la cassetta di tipo M oppure da tre a 26 micron per la cassetta di tipo S; per ridefinire l'asse x da quattro a 26 micron, toccare l'icona di ridefinizione della scala.Premere una volta l'icona di ridimensionamento per modificare la scala dell'asse x passando attraverso le seguenti scale: da quattro a 18 micron, da quattro a 10 micron e nuovamente da quattro a 34 micron. Se desiderato, tornare alla modalità di adattamento della curva. Il numero del test per l'analisi corrente viene visualizzato nella parte superiore dell'istogramma all'interno di un riquadro verde.I dati verranno salvati con il numero del test. Toccare l'icona di selezione per attivare la modalità di selezione, che consente la selezione manuale dell'istogramma. In questo modo la selezione diventa la modalità di acquisizione predefinita. Le finestre di selezione possono essere modificate spostando i marcatori blu destro e sinistro oppure toccando uno dei due marcatori e quindi spostandoli in modo incrementale mediante i tasti freccia che appaiono.I conteggi visualizzati e le informazioni medie relative alle dimensioni sono calcolati esclusivamente a partire dalle particelle all'interno dell'intervallo di selezione. Premere l'icona di completamento per salvare i risultati e tornare alla schermata iniziale. Per aprire un test salvato, premere l'icona dell'istogramma nella schermata iniziale.Verranno visualizzati contemporaneamente gli icone di fino a nove istogrammi salvati; premere pagina giù o pagina su oppure scorrere verso l'alto o verso il basso per visualizzare ulteriori risultati dei test, se necessario, e selezionare l'icona del test di interesse. Ogni istogramma verrà aperto in modalità adattamento della curva o in modalità con finestra.A seconda del modo in cui è stato salvato, il tipo di cassetta utilizzato per il test, M oppure S, verrà indicato in alto a sinistra dello schermo. Salvato. Gli istogrammi possono anche essere commutati tra modalità di gating e modalità di adattamento della curva; per eseguire automaticamente il gating, toccare il picco desiderato. Questa operazione imposta le posizioni ottimali di gating per il picco selezionato.Questo è particolarmente utile in situazioni con più picchi. Per indicare un picco di interesse, premere le icone delle frecce per lo zoom e l'annullamento dello zoom per regolare la scala dei conteggi sull'asse Y dell'istogramma. La scala verticale può essere modificata anche scorrendo un dito sul picco verso l'alto per ridurre o verso il basso per aumentare; premere l'icona indietro per chiudere questo test e tornare alla schermata principale.I dati possono essere trasferiti su un Mac o un PC utilizzando l'applicazione moxie chart. Per fare ciò, premere innanzitutto l'icona Bluetooth nella schermata principale dell'unità Moxie Z. L'unità riporterà il proprio ID Bluetooth sul computer; aprire l'applicazione moxie chart e fare clic sull'icona Bluetooth nell'angolo in alto a destra.Quindi selezionare il dispositivo corrispondente all'ID Bluetooth della Z e la cartella di destinazione per i file caricati, oltre al Bluetooth. Un altro modo per trasferire i dati dalla Mxi Z a un computer è utilizzare un cavo USB e trattarla come un normale dispositivo USB. Con i file di dati, i file provenienti da un'unità Mxi Z connessa tramite USB possono essere copiati in qualsiasi directory del computer.I file possono essere aperti e analizzati direttamente con l'applicazione Mxi Charles oppure, poiché sono formattati come file CSV, possono essere aperti direttamente in Microsoft Excel o in altri programmi di analisi dati per un'analisi personalizzata al fine di confrontare i risultati del conteggio ottenuti con l'Mxi Z con quelli ottenuti. Utilizzando uno strumento di conteggio identico, sospensioni controllate di microsfere calibrate con precisione e cellule di mammifero sono state contate con entrambi i metodi. Sono state testate quattro diverse dimensioni di microsfere, con diametri compresi tra 6 e 15,6 micron, oltre a diverse linee cellulari.La media di tre o quattro conteggi è stata riportata in grafico, come mostrato qui. I conteggi ottenuti erano quasi identici, indicando che il Moxie Z è in grado di ottenere conteggi accurati su un'ampia gamma di dimensioni, dimostrando l'intervallo di concentrazioni che possono essere valutate con precisione utilizzando il Mxi Z. Le stesse perle e cellule sono state diluite in serie partendo da un valore iniziale di 500.000 cellule per millilitro per la cassetta di tipo M o circa 2,5 milioni di cellule per millilitro per la cassetta di tipo S. Le concentrazioni cellulari teoriche sono state quindi confrontate con i conteggi ottenuti, come illustrato qui. Le concentrazioni misurate corrispondevano alle concentrazioni cellulari teoriche, dimostrando un conteggio accurato nell'intero intervallo dinamico di ciascuna cassetta: da 3000 a 500.000 cellule per millilitro per le cassette di tipo M e da 3000 a 2,5 milioni di cellule per millilitro per le cassette di tipo S. Per esaminare la variabilità dei risultati, sono stati effettuati cinque conteggi separati di cellule HEK 293 e HELOC nell'intervallo compreso tra 200.000 e 300.000 cellule per millilitro, utilizzando un Call to Z, un Moxi Z e un emocitometro.Come si può osservare in questo grafico, il coefficiente medio di variazione era comparabile tra lo Z two e lo mxi Z e molto inferiore rispetto a quello dell'emocitometro, indicando che la riproducibilità dello mxi Z è paragonabile a quella dello Z two e superiore a quella di un emocitometro. Per dimostrare la precisione dello mxi Z nella determinazione della dimensione delle particelle, sono stati misurati dei microsfera prodotti industrialmente utilizzando lo mxi Z. Sono state effettuate cinque misurazioni per ciascuna dimensione di microsfera, i cui valori sono stati mediati e riportati in grafico rispetto alla dimensione delle microsfere dichiarata dal produttore. Lo mxi Z ha misurato le microsfere con dimensioni corrispondenti a quelle riportate dal produttore.Il valore di R quadro era 0,9989, a dimostrazione della capacità dell'Mxi Z di valutare la coltura. Le misurazioni dell'indice di vitalità cellulare sono state registrate utilizzando l'Mxi Z per preparazioni identiche di cellule morte aggiunte come controllo, cellule HEK e cellule HeLa, e confrontate con i risultati visivi dell'esclusione del trian blu, della percentuale di viabilità ematomica del campione o del citofluorimetro Guava PCA, a scopo comparativo. Le misurazioni di viabilità per i campioni sono state inoltre riportate sul grafico, come si può vedere qui.La vitalità calcolata per le cellule HGK e LAR ottenuta utilizzando il Mxi Z era paragonabile alle misurazioni di vitalità ottenute con il metodo di esclusione del blu di trian, con valori di r quadrato rispettivamente di 0,9937 e 0,9728. I dati ottenuti sono inoltre comparabili a quelli ottenuti mediante guava PCA con il citometro a flusso, con valori di r quadrato di 0,9724 per le cellule EK e di 0,9585 per le cellule hela. Sebbene in alcuni casi l'indice di salute cellulare possa concordare con i metodi standard di valutazione della vitalità, si tratta di una tecnica del tutto nuova e differente per la valutazione della salute, e di conseguenza potrebbe non essere sempre identica alle tecniche precedenti.Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere facilmente informazioni sullo stato di salute delle cellule, sulla dimensione cellulare e sul numero di cellule durante il tentativo di questa procedura. È importante assicurarsi che la densità cellulare rientri nell'intervallo corretto.

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