Name: Visualizzazione dei Propriorecettori in Drosophila Larve e pupe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Scopri la visualizzazione degli organi cordotonal nei propriorecettori di Drosophila melanogaster in larve e pupe. Questo metodo di immunofluorescenza consente di studiare lo sviluppo degli organi sensoriali con microscopia confocale.

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Gli autori desiderano ringraziare la Banca Ibridoma Developmental Studies presso la University of Iowa per averci inviato anticorpi. Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio (n. 29/08) da The Israel Science Foundation. COME è anche supportato da un assegno di ricerca dal DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft).

Prima di iniziare <ol><li> Far crescere le culture mosca desiderati. Tenere i flaconcini poco affollate (circa 30 mosche per flaconcino da 50 ml). Lasciate che le mosche depongono le uova per un solo giorno in ogni fiala. Ciò garantirà l&#39;approvvigionamento alimentare sufficiente larve e permettere loro di raggiungere una dimensione massima prima di strisciare fuori dal cibo. Tenere i flaconcini di temperatura adeguata fino al terzo stadio le larve iniziano a vagare sulla parete flaconcino. </li><li> Preparare un nuovo ceppo di tampone fosfato (PBS) e PBT (0,1% Tween in PBS). Mantenere 10 ml di PBS su ghiaccio. </li><li> Preparare 1-5 ml di fissativo fresco (4% della formaldeide in PBT) e tenerlo in ghiaccio. Usiamo bottiglia di formaldeide 37-38% come soluzione stock. </li></ol> 1. Dissezione e fissazione del Terzo Larve Instar <ol><li> Scegli una larva vagante terzo stadio dalla parete del flaconcino e collocarlo in una diminuzione del 50 microlitri di PBS ghiacciato su un piatto dissezione Sylgard (in Sylgard 184 kit di silicone elastomero, Dow Corning Corporation in untessuto piatto di cultura). </li><li> Tenere il lato dorsale larva alto, vicino ai ganci della bocca, con pinza sottile (Dumont # 5 pinza), bastone e un perno insetto (minutien, 0,1 mm, in acciaio inox) attraverso il cervello della larva. </li><li> Afferra l&#39;estremità posteriore della larva con la pinza, tirare delicatamente e allungare delicatamente la larva della lunghezza. Attaccare un altro pin insetto tra i due spiracoli posteriori. </li><li> Molla con le forbici tagliare due incisioni orizzontali nella parete del corpo (perpendicolare alla asse anteriore-posteriore), vicino ai piedini anteriori e posteriori. </li><li> Utilizzando le forbici molla tagliare la parete larvale corpo lungo la linea mediana dorsale dal anteriore alla posteriore incisione. </li><li> Togliere gli organi interni (intestino, ghiandole salivari, Malpighi tubuli ecc) e la trachea utilizzando una pinza sottile. Lavare delicatamente una o due volte con PBS. </li><li> Prendete i due lembi parete del corpo con le pinze, allungare fuori e li pin alla piastra con due pin di insetti per ogni lato. </li><li> Rimuovere il PBS e aggiungere 50 ul di soluzione di fissaggio (4% formaldeide in PBT). Incubare 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il fissativo. Lavare due volte con PBS. Estrarre i perni di insetti. Molla con le forbici tagliare la testa larvale e la coda lasciando un filetto rettangolare. Trasferire il tessuto fissato ad un tubo Eppendorf refrigerati con PBS. </li><li> Una volta che un numero sufficiente di larve sono fissati, si può continuare direttamente a colorazione anticorpale. Se la colorazione immediata non è desiderato, le larve fisso deve essere lavata 3 volte, 5 minuti ciascuno, con 95% etanolo e conservato in etanolo al 95% a -20 ° C. </li></ol> 2. Dissezione e fissazione di pupe Parte I <ol><li> Partecipare alle fiale, come per la fissazione delle larve, le larve fino al terzo instar cominciano a pupariate. Esaminare i flaconi ogni ora larve e Mark che hanno pupariated. Lasciare che il pupe marcata a sviluppare 30-40 ore a 24 ° C o 24-27 ore a 29 ° C. </li><li> Utilizzando una pinza sottile raccogliere 20-30 pupe di The l&#39;età appropriata e metterli in un buio di porcellana multi-piatto e dissezione. Fare attenzione a non danneggiare i tessuti di interesse. </li><li> Estrarre il pupe dal caso pupa. Iniziate staccando l&#39;opercolo e continuare fino a quando la pupa è libero. Mettere la pupa in un pozzo pieno di PBT. Continua l&#39;estrazione di tutte le pupe. Passi 2,4-2,6 dovrebbe essere fatto in piccoli lotti di cinque pupe alla volta. </li><li> Posizionare cinque pupe su una superficie piana tra i pozzetti del piatto dissezione. Con un coltello micro dissezione tagliare la punta della testa e la punta posteriore dell&#39;addome (in alternativa, è possibile utilizzare due coppie di pinze per forato ad entrambe le estremità della pupe). </li><li> Tenere la pupa in posizione utilizzando una pinza sottile e usare una siringa da 1 ml per lavare gli organi interni della pupa, iniettando PBT attraverso l&#39;apertura anteriore. </li><li> Lavare brevemente sezionato pupa immergendolo in un pozzo riempito con PBS e spostarla nella fissativo freddo in un tubo Eppendorf mantenuto in ghiaccio. </li><li> Incubare (ON) a 4 ° C. </li></ol> Parte II <ol start="8"><li> Eliminare il fissativo e lavare le pupe per tre volte, a 5 minuti ciascuno, con PBT. Tenere il pupe lavato su ghiaccio. </li><li> Riempire due pozzi del piatto con la dissezione PBT. Utilizzo di un polietilene Pasteur pupe trasferire più pipetta ad uno dei pozzetti. </li><li> Spostare una pupa alla volta nel secondo pozzo. Utilizzando due coppie di pinze con punte affilate perfettamente allineati, staccare la cuticola trasparente pupa dell&#39;ala: fissare il pupa al fondo del pozzetto usando una coppia di pinze, e delicatamente strappare la cuticola utilizzando la seconda coppia di pinze. Una volta che la cuticola è strappata, staccatelo l&#39;ala. Fare attenzione a non staccare l&#39;ala dalla pupa. Dopo aver tolto la cuticola dalla lama ala, continuano peeling la cuticola della cerniera ala (dove i c&#39;os ala si trovano). </li><li> Dopo aver tolto la cuticola dell&#39;ala, si può tentare staccando la cuticola gamba in modo simile.Molte le gambe sono suscettibili di essere perso nel processo, ma nonostante la bassa resa, questo passaggio è altamente consigliata dato che migliora notevolmente la colorazione dei Chos gambe. I Chos del HALTERE e dell&#39;addome possono essere visualizzati senza ulteriori staccando la cuticola. </li><li> Posizionare il &#39;sfogliato&#39; pupa in una provetta Eppendorf riempito con metanolo e mantenere a temperatura ambiente. Continua staccando la cuticola di tutti i pupe, e aggiungerli al tubo stesso. Almeno 10 le pupe ben pelati devono essere raccolti per ogni colorazione. </li><li> Togliere il metanolo e lavare tre volte, a 5 minuti ciascuno, con il 95% di etanolo. Pupe fisso può essere conservati per lunghi periodi di tempo in 95% etanolo a -20 ° C. </li></ol> 3. Immunostaining di larve e pupe <ol><li> Lavare il tessuto fissato con PBT tre volte, 30 minuti ciascuna, a temperatura ambiente. Le larve possono essere lavati con agitando delicatamente su un piatto rotante. Pupe vengono lavati senza agitare. </li><li> Sostituire il PBT con il tampone di bloccaggio (PBT + 5% nsiero di capra Ormal) e incubare ON a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il tampone bloccante e incubare con anticorpi primari (diluito in tampone di bloccaggio) ON a 4 ° C. </li><li> Lavare quattro volte con PBT come descritto al punto 3.1. </li><li> Rimuovere il PBT e incubare con anticorpi secondari (diluito in tampone di bloccaggio) ON a 4 ° C. </li><li> Lavare due volte con PBT e una volta con PBS come descritto al punto 3.1. </li><li> Sostituire il PBS con il mezzo di montaggio (Dako Medio fluorescente di montaggio (Cytomation Dako, Glostrup, Danimarca) e incubare a 4 ° C ON. </li></ol> 4. Montaggio di larve <ol><li> Le larve sono montati su un vetrino da microscopio in una goccia di mezzi di montaggio con la loro cuticola rivolto verso il basso e muscoli della parete del corpo rivolta verso l&#39;alto. Metti una piccola goccia di mezzo di montaggio su un vetrino pulito e usarlo per coprire la preparazione. Non applicare alcuna pressione sulle larve montato. </li></ol> 5. Montaggio di Pupae <ol><li> Preparare due vetrini da microscopiocon una goccia di mezzo di fissaggio, uno per la dissezione e la seconda per il montaggio. </li><li> Mettere pupe più su una delle diapositive. </li><li> Molla con le forbici togliere la testa e la parte posteriore dell&#39;addome. </li><li> Separare la parte dorsale del torace dalla metà ventrale tagliando tra le ali e le gambe. </li><li> Collocare le parti del corpo sezionati del pupa sul vetrino secondo una goccia di soluzione di montaggio. Assicurarsi che le ali e le gambe sono tese e cercare di ridurre al minimo la sovrapposizione dei tessuti, per quanto possibile. </li><li> Mettere una goccia di mezzo di montaggio su un vetrino e collocarlo sul campione. Non applicare una pressione sul campione montato. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Un esempio di immuno-macchiati c&#39;os di larva terzo stadio è illustrato nella figura 1. Questo esempio mostra un segmento addominale ben tesa, in cui sette degli otto Chos sono chiaramente visibili. I neuroni sono labELED con MAb22C10 (1:20, ottenuto dalla Banca Developmental Studies Ibridoma presso la University of Iowa), il tappo, legamento, cap-attachment e le cellule di attacco dei legamenti vengono etichettati con anti-αTub85E (1:10, Klein et al,. 2010). Anticorpi secondari per la colorazione fluorescente erano Cy3 o Cy5-coniugato anti-mouse/rabbit (1:200, ImmunoResearch Jackson Laboratories). I campioni sono stati visualizzati mediante microscopia confocale (LSM 510, Zeiss). Un gruppo di Chos ala al vena ventrale radiale di 35 hr-vecchio pupa è mostrato in Figura 2. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3846/3846fig1.jpg" /> Figura 1 (A) Illustrazione schematica dei sei tipi di cellule che costituiscono un singolo organo: Ch. Attaccamento cap (CA), il tappo (C), scolopale (S), neurone (N), legamento (L) e di attaccamento legamento (LA ). Il LCh5 organo, in cui sono raggruppati cinque c&#39;os, è teso il gruppo di muscoli laterali trasversali (LT1-4). Il muscolo laterale longitudinale (LL1), ventrali muscoli longitudinali (VL1-4) e laterale muscolo obliquo (LO1) sono anche illustrati. Cellule tendinee sono illustrati come sfere marroni (Tratto da Klein et al., 2010). (B) Un segmento addominale di una larva di terzo stadio visti con un ingrandimento 10X. Sette degli otto Chos presenti in ciascun segmento addominale sono evidenti: cinque organi laterali che formano l&#39;organo pentascolopidial (LCh5), un unico organo laterale (LCh1) e uno dei due Chos ventrali (VChB). I neuroni (N) del C&#39;os sono etichettati con il marcatore neuronale MAb 22C10 (rosso). Il legamento (L), il tappo (C) e le cellule di attacco (Los Angeles, CA) vengono etichettati con anti-αTub-85E (blu). Le cellule tappo e legamenti sono inoltre etichettati con un Cho-specifica reporter GFP ospitare un elemento normativo del locus dei (Nachman et al, dati non pubblicati). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3846/3846fig2.jpg" /> Figura 2. </sTrong&gt; Gli organi ala cordotonali alla vena ventrale radiale sono visti con un ingrandimento 40X. I neuroni (N) sono contrassegnati con le 22C10 marcatori neuronali (Red, B). Il legamento (L) e il tappo (C), le cellule sono co-etichettati con anticorpi anti-αTub85E (Blu, C) e un Cho-specifica GFP giornalista transgene (Nachman et al, dati non pubblicati).

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Il protocollo descritto in questo video fornisce un modo per visualizzare Chos propriocettivi durante le fasi larvali e pupe. Gli studi sulla struttura e lo sviluppo di Chos propriocettivi sono stati finora limitati principalmente agli stadi embrionali e larvali dischi immaginali. Così, molti aspetti delle fasi successive di sviluppo, di Chos sia larvali e adulti, rimangono in gran parte sconosciuto. Il protocollo descritto, insieme con i comuni strumenti genetici in Drosophila, può essere utilizzato per identificare e studiare nuovi geni e le vie che giocano un ruolo nelle fasi successive di sviluppo Chos. Questo protocollo è stato ottimizzato per la visualizzazione di Cho, ma può essere adattato per la colorazione di tessuti, quali alette 6 pupa.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / strumento </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Dumont # 5 (o # 55) pinza, Biologie punta </td><td> FST </td><td> 11252-20 o 11252-10 (Pinza o simili) </td><td></td></tr><tr><td> Austerlitz inox perni in acciaio, insetti minutiens 0.1mm </td><td> Roboz Co strumento chirurgico </td><td> RS-6083-10 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 silicone kit elastomero </td><td> Dow Corning Corporation </td><td> 240.4019862 </td><td></td></tr><tr><td> Vännäs forbici micro (dritto, 7,5 cm, lama 3 mm) </td><td> AS Mdeizintechnik GmbH </td><td> 11-590-00 </td><td> Forbici primavera Vännäs con specifiche identiche possono essere acquistati presso Instrument Co. Roboz chirurgico </td></tr><tr><td> Agitatore orbitale - Rotamax-120 </td><td&gt; Heidolph </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Dako fluorescente Mezzo di montaggio </td><td> Cytomation Dako, Glostrup, Danimarca </td><td> DK-5302392 </td><td></td></tr><tr><td> X10 PBS formulazione </td><td colspan="2"> 2 gr / lit KCl, 2 gr / lit KH 2 PO 4, 80 gr / lit NaCl, 21,7 gr / lit Na 2 HPO4.7H 2 O </td><td> La qualità di PBS è critico per il successo di questo protocollo </td></tr><tr><td> PBT </td><td colspan="2"> X1 PBS + 0,1% Tween 20 </td><td></td></tr></tbody></table>

visualizzazione dei propriorecettori in<em&gt; drosophila</em&gt; larve e pupe

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

La propriocezione è la capacità di percepire il movimento, o la posizione, di parti del corpo, rispondendo agli stimoli derivanti all&#39;interno del corpo. In moscerini e altri insetti propriocezione è fornita da personale specializzato organi sensoriali chiamati organi cordotonali (c&#39;os) 2. Come molti altri organi in Drosophila, Chos sviluppare due volte durante il ciclo di vita della mosca. In primo luogo, il Chos larve si sviluppano durante l&#39;embriogenesi. Poi, i Chos adulti cominciare a sviluppare nei dischi immaginali larvali e continuano a differenziare durante la metamorfosi. Lo sviluppo di Chos larvali durante l&#39;embriogenesi è stata ampiamente studiata 10,11,13,15,16. Il fulcro di ogni Cho è una unità sensoriale composto da un neurone e una cellula scolopale. L&#39;unità sensoriale è teso tra due tipi di cellule accessorie che si attaccano alla cuticola tramite cellule specializzate di attacco epidermiche 1,9,14. Quando una larva di mosca si muove, lo sfollamento e della relativacellule di fissaggio pidermal porta allo stiramento dell&#39;unità sensoriale e la conseguente apertura specifici transitori recettore vanilloide potenziale (TRPV) canali al segmento esterno del dendrite 8,12. Il segnale suscitato viene poi trasferito al circuito generatore di modello di locomotore centrale nel sistema nervoso centrale. Chos multiple sono state descritte nella mosca adulta 7. Questi sono situati vicino alle articolazioni delle appendici mosca adulta (gambe, ali e cavezze) e nel torace e nell&#39;addome. Inoltre, diverse centinaia di Chos collettivamente formano l&#39;organo di Johnston nel antenna adulto che trasducono acustica in energia meccanica 3,5,17,4. In contrasto con la conoscenza approfondita sullo sviluppo di Chos in stadi embrionali, molto poco si sa circa la morfologia di questi organi durante le fasi larvali. Inoltre, ad eccezione di Chos femorale 18 e organo Johnston, il conoscenge sullo sviluppo e la struttura del Chos nella mosca adulta è molto frammentaria. Qui si descrive un metodo per la colorazione e la visualizzazione chos in terza larve instar e pupe. Questo metodo può essere applicato con strumenti genetici per caratterizzare meglio comprendere la morfologia e lo sviluppo del C&#39;os vari la mosca.

Un metodo per immunostain e visualizzare organi cordotonali in larve e delle pupe<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Descritto.

Visualizzazione dei Propriorecettori in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve e pupe

La propriocezione è la capacità di percepire il movimento o la posizione delle parti del corpo rispondendo a stimoli che originano all'interno dell'organismo. Nei moscerini della frutta e in altri...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare gli organi corticati propriocettivi nei larvi e nei pupe di Drosophila. Questo viene ottenuto innanzitutto allevando e raccogliendo larve di terzo stadio o pupe dopo la dissezione dei larvi o dei pupi. Vengono quindi fissati per la colorazione immunoistochimica.Successivamente, i larvi o pupi fissati vengono sottoposti a immunomarcatura con gli anticorpi appropriati. Il passaggio finale consiste nel montare i campioni marcati per l'analisi microscopica. Infine, si utilizza la microscopia confocale per visualizzare gli organi cortone.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali sullo sviluppo post simbiotico e sul modello dei recettori prop in oph. Sebbene questa procedura possa fornire informazioni sullo sviluppo dei recettori prop, può essere applicata anche ad altri organi come altri tipi di organi sensoriali e tendini. Prima di tutto, assemblare gli strumenti necessari, le soluzioni e un vial di wandering.Nelle larve di terza età stellata, mantenere le soluzioni di PBS e fissativo in ghiaccio. Prelevare una larva di terza età stellata vagante dalla parete del vial e posizionarla in una goccia di 50 microlitri di PBS freddo di ghiaccio su una piastra per dissezione realizzata in elastomero di sigaro all'interno di una piastra per colture cellulari. Utilizzando un microscopio stereoscopico, tenere la larva con il dorso rivolto verso l'alto vicino ai ganci boccali con pinzette fini e infilzare il cervello con un ago per insetti.Afferrare l'estremità posteriore delle larve con la pinzetta. Tirare delicatamente ed allungare le larve in senso longitudinale. Inserire un altro perno da insetto tra le due sfere posteriori utilizzando forbici a molla.Praticare due incisioni orizzontali nella parete corporea perpendicolarmente all'asse antero-posteriore, mantenendosi vicino ai perni anteriori e posteriori. Successivamente, tagliare la parete corporea larvale lungo la linea mediana dorsale dall'incisione anteriore a quella posteriore. Rimuovere gli organi interni e la trachea utilizzando pinzette fini.Quindi lavare delicatamente una o due volte con PBS. Afferrare le due lembi della parete corporea con pinze. Stirarle e fissarle alla piastra utilizzando due spilli da insetto per ciascun lato.Rimuovere il PBS e aggiungere 50 microlitri di soluzione fissativa. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso la soluzione fissativa e aver lavato due volte con PBS, estrarre i perni per insetti utilizzando forbici a molla.Tagliare la testa e la coda delle larve, lasciando un filetto rettangolare. Trasferire il tessuto fissato in un tubo Eppendorf refrigerato contenente PBS. Una volta fissato un numero sufficiente di larve, è possibile proseguire direttamente con la colorazione anticorpale.Se non si desidera una colorazione immediata, le larve fissate devono essere lavate tre volte per cinque minuti ciascuna con etanolo al 95% e quindi conservate nell'etanolo a meno 20 gradi. Sorvegliare i flaconi come per la fissazione delle larve fino a quando le larve del terzo stadio non iniziano a cibarsi. Esaminare i flaconi ogni ora e segnare le larve che si sono cibate.Lasciare sviluppare i marcatori pube per 30-40 ore a 24 gradi Celsius, oppure per 24-27 ore a 29 gradi Celsius utilizzando pinzette fini. Selezionare 20-30 pube dell'età appropriata e posizionarli in una piastra di dissezione in porcellana scura con più pozzetti. Prestare attenzione a non danneggiare i tessuti di interesse.Successivamente, estrarre le pupe dai loro involucri pupali. Iniziare rimuovendo l'operculum e procedere finché la pupa non è completamente libera. Estrarre tutte le pupe e collocarle in una pozzetta riempita con PBT.Posizionare cinque pupe su una superficie piana tra le cavità della piastra per dissezione utilizzando un coltello da microdissezione. Recidere l'apice della testa e l'estremità posteriore dell'addome. Trattenere la pupa in posizione utilizzando pinzette fini e usare una siringa da un millilitro per lavare gli organi interni della pupa, iniettando PBT attraverso l'apertura anteriore.Lavare brevemente la pupa dissezionata immergendola in una pozzetta contenente PBS e trasferirla nel fissativo freddo in un tubo Eppendorf mantenuto sul ghiaccio. Incubare la pupa tutta la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo.Scartare il fissativo e lavare la pupa con PBT tre volte per cinque minuti per ogni lavaggio. Mantenere la pupa in lavaggio sul ghiaccio. Riempire due pozzetti della piastra per dissezione con PBT.Utilizzando una pipetta Pasteur in polietilene, trasferire diverse pupe in uno dei pozzetti. Successivamente, spostare una pupa alla volta nel secondo pozzetto.Utilizzando due paia di pinzette fini con punte perfettamente allineate, fissare la pupa sul fondo della pozzetta e quindi strappare delicatamente la cuticola. La rimozione della cuticola alare rappresenta l'aspetto più difficile di questa procedura. Perdiamo sempre alcune ali durante questo passaggio, motivo per cui si inizia la procedura con un numero relativamente elevato di pupa.Una volta che la cuticola è strappata, staccarla dall'ala. Fare attenzione a non staccare l'ala dal pupa. Dopo aver rimosso la cuticola dalla lamina alare, continuare a rimuovere la cuticola dell'articolazione alare.Dopo aver rimosso la cuticola dell'ala, si può tentare di rimuovere la cuticola della zampa in modo simile. Molte zampe andranno probabilmente perse durante il processo, ma nonostante la resa bassa, questo passaggio è fortemente raccomandato poiché migliora notevolmente la colorazione degli organi corticoni delle zampe. Posizionare la pupa in un tubo einor riempito con metanolo e mantenerla a temperatura ambiente.Continuare a rimuovere la cuticola da tutti i puy e aggiungerli al medesimo tubo, per un totale di almeno 10 puy ben pelati. Per ogni colorazione, rimuovere il metanolo e lavare tre volte per cinque minuti ciascuno con etanolo al 95%. I puy fissati possono essere conservati per lunghi periodi in etanolo al 95% a meno 20 gradi prima della colorazione immunoistochimica.Per montare le larve, posizionare una goccia di mezzo di montaggio su un vetrino da microscopio quindi disporre le larve con le cuticole rivolte verso il basso e i muscoli della parete corporea rivolti verso l'alto. Mettere una piccola goccia di mezzo di montaggio su un coprioggetto pulito e utilizzarlo per coprire il preparato senza esercitare alcuna pressione sulle larve montate. Per montare la pupa.Preparare innanzitutto due vetrini con una goccia di mezzo di montaggio, uno per la dissezione e il secondo per il montaggio. Posizionare diversi pu su uno dei vetrini, quindi utilizzare le forbici a molla per rimuovere la testa e la parte posteriore dell'addome. Successivamente, separare la metà dorsale del torace dalla metà ventrale tagliando tra le ali e le zampe.Posizionare le parti corporee dissezionate della pupa sulla goccia di mezzo di montaggio. Sul secondo vetrino, assicurarsi che ali e zampe siano distese e cercare di minimizzare il sovrapporsi dei tessuti il più possibile. Infine, posizionare una goccia di mezzo di montaggio su un coprioggetto e appoggiarlo sul campione senza applicare pressione eccessiva.Questo micrografico confocale di organi cortone immuno marcata in una larva di terzo stadio mostra un segmento addominale ben disteso in cui sette degli otto organi cortone sono chiaramente visibili. I cinque organi laterali che insieme formano l'organo lipidico penasco, un singolo organo laterale e uno dei due organi cortone ventrali risultano evidenti. I neuroni dell'organo cortone sono marcati con il marcatore neuronale, l'anticorpo monoclonale 22 C 10, e mostrati in rosso.Il cappuccio legamentoso e le cellule di attacco sono marcati con Antifa tubulina 85 E e sono mostrati in blu. Le cellule del cappuccio e del legamento sono inoltre marcate con un organo tonotopico corticale. Specifico reporter GFP contenente un elemento regolatorio per il locus Delilah.Qui, gli organi tonotopici dell'ala corti a livello della vena radiale ventrale sono mostrati in questo micrografo confocale di una pupa di 35 ore. I neuroni sono marcati con il marcatore neuronale 22 C 10, mostrati in rosso e nel pannello B. Le cellule del legamento e le cellule cap sono etichettate congiuntamente con gli anticorpi Antifa tubulin 85 E, mostrati in blu e nel pannello C, nonché con un organo tonotopico corti. Un transgene reporter GFP specifico mostrato in verde.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come visualizzare gli organi corticoni propriocettivi sia nella larva che nella pupa in oph. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che essa è stata ottimizzata per l'uso degli anticorpi descritti. Anticorpi diversi potrebbero richiedere condizioni di fissazione e colorazione leggermente differenti.Pertanto, quando si utilizza questo procedimento con diversi anticorpi, si devono determinare le condizioni ottimali per gli anticorpi impiegati.

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