Un test di screening a fluorescenza per l'identificazione di modulatori Canali GIRK
24 aprile 2012
A real-time procedura di screening per identificare i farmaci che interagiscono con la proteina G-gated verso l'interno raddrizzatore K + (GIRK) canali viene descritto. Il test utilizza coloranti fluorescenti potenziale di membrana sensibili per misurare l'attività dei canali GIRK. Questa tecnica è adattabile per l'uso su un certo numero di linee cellulari.
L'obiettivo generale di questa procedura è identificare nuovi farmaci che modulano i canali grk. Ciò si ottiene placcando prima le celle A TT 20 nella piastra a 96 pozzetti. Il secondo passaggio consiste nel diluire i composti in esame utilizzando il sistema di gestione delle piastre per liquidi Verset.
Successivamente, i composti di prova diluiti vengono applicati alle cellule utilizzando il verset. Il passaggio finale consiste nell'inserire la piastra a 96 pozzetti nel lettore di piastre fluorescenti Synergy two e iniettare le soluzioni di controllo e somatostatina nei pozzetti. In definitiva, il lettore di piastre fluorescenti viene utilizzato per mostrare i composti che alterano il segnale fluorescente indotto dalla somatostatina e quindi modulano i canali Grk.
Il vantaggio di questa procedura rispetto ai metodi esistenti, come la registrazione patch clamp, è che un gran numero di composti può essere rapidamente sottoposto a screening per determinare se modulano i canali gerk. Le implicazioni di questa tecnica si estendono al trattamento del dolore perché i composti che attivano il canale Gerk, che portano all'inibizione della trasmissione nocicettiva FI, possono essere identificati dimostrando la procedura per il rivestimento. Le piastre a 96 pozzetti e la placcatura delle celle è Maribel Vasquez.
Uno studente nel mio laboratorio Iniziare questa procedura coltivando le cellule ipofisarie A TT 20 in DMEM integrato con il 10% di siero di cavallo a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata con il 5% di CO2. Mantenere la coltura sub-coltura delle cellule ogni cinque o sette giorni utilizzando una procedura standardizzata. Quindi rivestire i pozzetti del nero trasparente.
Piastra inferiore a 96 pozzetti con 50 microlitri di poli L lisina. Lasciare asciugare i pozzetti per 30 minuti nell'incubatrice. Quindi rimuovere la piastra di poli-L lisina in eccesso dalle cellule nella piastra a 96 pozzetti contenente 200 microlitri di terreno alla densità di 30.000 cellule per pozzetto.
Dopodiché, conservare le cellule nell'incubatore per tre o quattro giorni. Utilizzare una configurazione di aspirazione per aspirare lentamente il terreno di coltura dal monostrato cellulare, quindi lavare le cellule con 200 microlitri di soluzione tampone normale. Successivamente, aggiungere a ciascuno 200 microlitri di soluzione tampone contenente il colorante sensibile al potenziale di membrana.
Incubare bene le cellule per 40 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo 40 minuti, rimuovere le celle A TT 20 dall'incubatore e lasciarle tornare a temperatura ambiente, aspirare il vecchio tampone. Quindi applicare una soluzione tampone fresca contenente l'MPD sulle cellule.
Successivamente, utilizzare il sistema di manipolazione dei liquidi per applicare varie concentrazioni dei composti in esame e delle soluzioni di controllo alle celle. Nella piastra a 96 pozzetti, incubare le cellule per cinque minuti con i composti di prova per le misurazioni fluorescenti. In questa procedura, inserire la piastra a 96 pozzetti in un lettore di piastre fluorescenti biotech synergy two.
Ottenere il segnale di fondo fluorescente a una lunghezza d'onda di essudazione di 520 nanometri e una lunghezza d'onda di missione di 560 nanometri. Successivamente, applicare i ligandi G PCR R o la soluzione di controllo ai pozzetti per attivare i canali GIR utilizzando il sistema a due iniettori Synergy. Quindi raccogliere i punti dati a intervalli di dieci secondi in un periodo di campionamento 302.
Alle lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione. Calcolare il fattore Z per determinare l'affidabilità del test. Z.I fattori compresi tra 0,5 e 1,0 indicano che la qualità del test è eccellente.
Sono escluse le piastre con fattori Z inferiori a 0,5. Dall'analisi i composti che modulano il segnale fluorescente vengono ritestati in presenza di due millimolari di cloruro di bario o 500 nanomolari di terapina Q per confermare la specificità del canale del potassio raddrizzatore verso l'interno mostrata qui è un segnale fluorescente rappresentativo HLB 0 2 1 1 15 2 misurato nel tempo nelle cellule A TT 20 con l'aggiunta di somatostatina o soluzione di controllo. Il rapporto tra l'intensità della fluorescenza sull'asse Y è stato calcolato dividendo il segnale in presenza di somatostatina o la soluzione di controllo per il segnale basale misurato prima dell'aggiunta di somatostatina o della soluzione di controllo.
Qui è mostrato il trattamento delle cellule A TT 20 con 500 nano molari. La terapina Q inibisce la diminuzione mediata dalla somatostatina del segnale fluorescente legandone due e bloccando i canali G. E qui è mostrato il trattamento delle cellule A TT 20 con 20 propafenone micromolare, che inibisce anche la diminuzione mediata dalla somatostatina del segnale fluorescente Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore se eseguita correttamente.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identificare i farmaci che modulano i canali grk utilizzando un lettore di piastre fluorescenti.
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Panoramica
Questo articolo descrive una procedura di screening in tempo reale per identificare farmaci che interagiscono con i canali GIRK (GIRK = G protein-gated inward rectifier K +). Il saggio utilizza coloranti fluorescenti sensibili al potenziale di membrana per misurare l'attività del canale GIRK, rendendolo adattabile per varie linee cellulari.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Farmacologia
- Neuroscienza
- Elettrofisiologia
Conoscenze di base
- I canali GIRK svolgono un ruolo cruciale nella segnalazione neuronale.
- L'identificazione di modulatori dei canali GIRK può portare a nuove strategie terapeutiche.
- I saggi in tempo reale migliorano l'efficienza dello screening dei farmaci.
- I coloranti fluorescenti forniscono una misura sensibile dell'attività del canale.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare una procedura per lo screening di farmaci che modulano i canali GIRK.
- Utilizzare un formato ad alto rendimento per testare molteplici composti.
- Migliorare la comprensione della farmacologia dei canali GIRK.
Metodi utilizzati
- Piantare cellule A TT 20 in una piastra a 96 pozzetti.
- Utilizzare il sistema di gestione liquidi Verset per diluire i composti di test.
- Applicare i composti diluiti alle cellule con il Verset.
- Utilizzare un lettore di piastre fluorescenti Synergy two per misurare le risposte.
Principali risultati
- Identificazione di composti che alterano i segnali indotti dalla somatostatina.
- Dimostrazione dell'adattabilità del saggio a varie linee cellulari.
- Modulazione di successo dell'attività del canale GIRK da parte dei composti testati.
- Validazione dell'efficacia del lettore di piastre fluorescenti nello screening.
Conclusioni
- Il saggio sviluppato è uno strumento prezioso per la scoperta di farmaci che prendono di mira i canali GIRK.
- Lo screening in tempo reale può accelerare l'identificazione di potenziali terapeutici.
- Sono necessari ulteriori studi per esplorare le implicazioni cliniche dei composti identificati.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This assay enables high-throughput identification of GIRK channel modulators, supporting target validation in neuroscience and cardiovascular drug discovery. By providing real-time, quantitative fluorescence readouts, it reduces reliance on low-throughput electrophysiology and accelerates hit-to-lead progression. The method enhances predictive confidence in early discovery by linking compound effects to functional channel activity in a physiologically relevant cellular context.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring functional GIRK channel modulation in response to GPCR ligands.
- Operational Value: Enables rapid screening of compound libraries to identify activators or inhibitors with mechanistic specificity.
- Predictive Value: Supports target de-risking by confirming on-target activity through fluorescence signal changes correlated with K+ efflux.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Uses membrane potential-sensitive dyes (DiBAC4(3) or HLB 021-152) to generate quantifiable, real-time signals upon GIRK activation.
- Reproducibility: Z-factor calculation (excellent range: 0.5–1.0) ensures assay robustness for hit selection and campaign reproducibility.
- Scalability: Compatible with 96-well format and liquid handling systems (e.g., Verset) for automated compound dispensing and screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Modulators identified may inform therapeutic strategies for neuropathic pain, addiction, and cardiac arrhythmias via GIRK-mediated neuronal inhibition.
- Translational Continuity: Fluorescent readouts provide a bridge from target engagement to functional output, supporting preclinical phenotype anchoring.
- Mechanistic De-risking: Specificity confirmed using inhibitors like barium chloride or Terapin Q to distinguish GIRK-mediated effects from off-target activity.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, enabling functional screening of GIRK modulators prior to downstream optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking GPCR activation to GIRK-dependent fluorescence changes, clarifying pathway modulation.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized dye loading, compound application, and kinetic fluorescence measurement over 300 seconds.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (fluorescence intensity ratios) enabling comparison of compound potency and efficacy.
- Translational Research: Connects to preclinical work by identifying compounds that alter neuronal excitability via GIRK, relevant to pain and addiction models.
- Enterprise Reuse: Platform-adaptable across cell lines and GPCR ligands, promoting reuse across multiple target validation campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target modulation by reducing mechanistic ambiguity in ion channel drug screening.
- Operational Value: Offers standardization, reproducibility, and real-time kinetic data unattainable with endpoint assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early functional validation, reducing late-stage failure risk due to lack of target engagement.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of compounds with confirmed GIRK activity for advancement to lead optimization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture (AT T20 cells), fluorescent dye handling, and kinetic plate reader operation.
- Dependent on fluorescence plate reader with injection capability (e.g., Synergy 2) and compatible excitation/emission settings (520 nm/560 nm).
- Necessitates standardization of dye loading, incubation times, and buffer conditions across wells and plates.
- Adaptation to other cell lines requires validation of GIRK expression and dye loading efficiency.
- Practical limitation: Assay specificity must be confirmed using orthogonal inhibitors (e.g., Ba2+, Terapin Q) to exclude non-GIRK-mediated fluorescence changes.
