Rapid Point-of-Care test di efficacia anticoagulante Enoxaparina nel sangue intero

Dimostrazione di un saggio rapido quantitativo di inibizione della coagulazione del sangue dal basso peso molecolare eparina, enoxaparina. Il contributo di enoxaparina è valutata rimuovendo la sua influenza attraverso la digestione con eparinasi. Una descrizione più completa del saggio è presentato in dettaglio nel nostro documento pubblicato.

A titolo di introduzione, ci riferiamo qui a lavori pubblicati sull'andamento temporale dei livelli plasmatici dell'eparina a basso peso molecolare Enoxaparin in soggetti umani. Oggi stiamo dimostrando i nostri risultati con un test rapido al punto di cura per l'eparina a basso peso molecolare. In questo caso, l'entità è l'enoxaparina.

I risultati mostrati in questa diapositiva descrivono la concentrazione plasmatica nei pazienti che hanno ricevuto il farmaco cronicamente una volta al giorno, 40 milligrammi al giorno, e il costo del tempo di quell'ultima somministrazione seguita da un'ulteriore scomparsa può vedere quindi che a circa quattro ore dopo la somministrazione, viene raggiunta una concentrazione di picco di 0,4 unità internazionali per ML, E quel livello rientra nell'intervallo terapeutico del farmaco. Un punto di particolare interesse, però, è anche quanto ne rimane 12 ore dopo la somministrazione perché esiste una linea guida clinicamente accettata secondo cui si dovrebbe attendere almeno 12 ore dopo la somministrazione di eparina a basso peso molecolare, in questo caso l'enoxaparina, prima di eseguire qualche procedura particolarmente invasiva, che potrebbe comportare un rischio di sanguinamento. È interessante per noi che ci sia ancora una quantità chiaramente rilevabile presente in quel momento, e ci siamo concentrati su questo in alcuni dei nostri studi, come dimostreremo.

In questo lavoro viene presentato anche il fatto che gli individui con insufficienza renale hanno livelli considerevolmente più elevati del farmaco nel corso del tempo, e vediamo che la linea guida di 12 ore potrebbe essere molto inadeguata nel caso di un paziente con insufficienza renale o come è noto in una donna incinta o in pazienti obesi. Vorrei presentare i ricercatori che sono stati coinvolti in questo progetto al New York Medical College. Mi chiamo Mario Osa.

Sono professore di farmacologia qui. Sono la dottoressa Surya Patula, professore associato di anestesiologia clinica, New York Medical College. Mi chiamo Keshar Kal.

Sono uno studente di medicina del terzo anno. Questo è l'apparecchio che utilizziamo per questi saggi. L'apparecchio è prodotto dalla Omicron Corporation.

Può essere utilizzato sia in linea che a batteria, e quindi è davvero un punto di cura in questo senso. L'apparecchiatura è dotata di due scomparti termostaticamente controllati e vengono utilizzati per una pre-incubazione dei campioni nella preparazione del test vero e proprio, nonché per il test di coagulazione stesso. Una delle principali caratteristiche del test è l'uso di una preparazione altamente purificata e disponibile in commercio di eparasinasi.

L'abbiamo acquistato dalla società Siemens. Viene fornito in una forma molto stabile ed è facilmente solubile in soluzione salina o in qualsiasi soluzione acquosa. L'uso dell'eparina ACE è particolarmente prezioso nel nostro approccio perché ci permette di essere in grado di ottenere il valore di coagulazione basale del paziente.

In assenza di qualsiasi influenza dell'eparina, l'eparina, l'ACE è in grado di degradare completamente l'eparina a basso peso molecolare e l'eparina non frazionata, ma il nostro particolare interesse qui è l'eparina a basso peso molecolare e la degradazione all'inattività e produrre un valore per il tempo di coagulazione in assenza di qualsiasi influenza dell'eparina. Quello che stiamo illustrando qui è il decorso temporale della degradazione dell'eparina a basso peso molecolare, in questo caso l'enoxaparina da parte dell'eparinasi. I dati sono tracciati come percentuale del tempo di taglio basale, quindi quello che vediamo qui è che l'enoxaparina ha aggiunto a un anti 10.

Un'unità internazionale per ML provoca un'estensione di circa il 50% del tempo di coagulazione del sangue. Quindi, dopo vari periodi di incubazione con eparinasi a 37 gradi centigradi, vediamo il costo in termini di tempo per il recupero dei tempi di coagulazione basali. In altre parole, la completa degradazione dell'enoxaparina fino all'inattività.

In termini di effetto anticoagulante, lo vediamo già di un minuto e mezzo. C'è essenzialmente un recupero del 100% del tempo di coagulazione basale. Dopo l'ispezione di questo decorso temporale, abbiamo scelto di utilizzare cinque minuti di incubazione come pre-incubazione standard del sangue prima della misurazione del tempo di coagulazione.

Le provette per questo test point of care sono state leggermente modificate rispetto al modo in cui le riceviamo dal produttore. Questi tubi originariamente contenevano nell'attivatore caolino, che è presente per una misurazione del tempo di coagulazione attivato. Abbiamo scoperto che quando usiamo il tubo senza l'attivatore, aumenta la sua sensibilità in modo sostanziale.

Abbiamo definito questo il nostro test minimamente attivato perché riteniamo che l'unica possibile fonte di attivazione sarebbe ora la superficie di vetro del tubo e forse il magnete. Il magnete è la parte essenziale del test automatizzato. Questi tubi ruotano nei pozzetti dei tubi e quando il magnete è intrappolato da un coagulo di densità per provocare la sua perdita di movimento, allora questo viene rilevato e segnala il completamento della coagulazione.

Abbiamo anche studiato il test utilizzando la cartuccia a tempo parziale di platino attivata da omicron. Il test viene condotto in modo identico. C'è un po' più di attivazione presente in questo sistema.

Il nostro primo passo è quello di ricostituire il giglio eparinasi così come lo riceviamo nella sua fiala. Aggiungiamo 0,25 ml di soluzione fisiologica al flaconcino e poi lasciamo circa 20 secondi per la completa dissoluzione. Successivamente aspiriamo l'intero contenuto della fiala in una siringa di tubercolina, recuperando di solito circa 0,2 ml in questa fase successiva.

Le aggiunte per la pre-incubazione vengono aggiunte ai campioni di sangue appena prelevati contenenti enoxaparina in provette vacutainer da tre ml. La prima edizione rappresenta l'eparinasi e che viene mescolata in questo momento. Punto successivo, si tratta dell'aggiunta di 0,2 ml di soluzione fisiologica alla provetta contenente enoxaparina ma non eparinasi per un volume totale VO comparabile.

Utilizziamo il timer integrato nello strumento per il conto alla rovescia dei 300 secondi. Si tratta di cinque minuti di pre-incubazione. I tubi sottovuoto vengono rimossi al termine della preincubazione.

La fase finale consiste nel trasferimento di due ml dei campioni pre-incubati nelle nostre provette minimamente attivate. Queste provette sono preriempite con un centinaio di microlitri di cloruro di calcio molare 0,25 per avviare la coagulazione. Questa prima provetta è quella preincubata con eparasinasi.

Il secondo campione è quello contenente enoxaparina ma non eparinasi. I timer esprimono il tempo trascorso dall'aggiunta di cloruro di calcio e ora possiamo vedere che il primo campione è completo. Questa è la fiala superiore a 200 secondi necessari per il completamento della coagulazione.

Il campione che non conteneva eparinasi sta procedendo più a lungo e che ora è terminato. Questa è una simulazione del nostro risultato tipico con sangue addizionato con 0,4 unità internazionali di Enoxaparina per ml. Si tratta di una riduzione di circa 45 secondi del tempo di coagulazione a questa concentrazione di enoxaparina o di una diminuzione del 18% del tempo di coagulazione.

Come si può notare, il rilevamento della coagulazione è automatizzato e i tempi vengono conservati sullo strumento fino al completamento dell'ispezione. Va detto che abbiamo testato questo test a una concentrazione inferiore a 0,1 unità internazionali di enoxaparina per ml. Come abbiamo notato nell'introduzione, questa è la concentrazione che potrebbe essere presente 12 ore dopo una dose terapeutica tipica di Enoxaparina.

Siamo stati in grado di rilevare in modo affidabile anche a questa concentrazione.