Preparazione di cellule di fibroblasti embrionali di topo adatto per colture di cellule pluripotenti umane embrionali e staminali indotta

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare fibroblasti embrionali murini adatti alla coltura di cellule staminali embrionali umane e di cellule staminali pluripotenti indotte. Questo viene ottenuto innanzitutto separando ciascun embrione e rimuovendo la testa e gli organi rossi. Successivamente, il tessuto viene finemente tritato e digerito.

Quindi le cellule vengono seminate, da tre a quattro embrioni per fiala, e amplificate. Infine, i miti inattivati vengono utilizzati per preparare il mezzo condizionato. In ultima analisi, l'LSA viene utilizzato per determinare la concentrazione ottimale di attivo all'interno del mezzo condizionato che sostiene la crescita indifferenziata delle cellule staminali pluripotenti.

Generalmente, chi si approccia per la prima volta a questo metodo incontrerà difficoltà poiché la procedura deve essere standardizzata per produrre fibroblasti embrionali murini di alta qualità, necessari per la crescita indifferenziata sia delle cellule staminali embrionali umane che delle cellule staminali pluripotenti indotte. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché l'isolamento e la dissezione degli embrioni risultano difficili da apprendere, in quanto la manipolazione dell'embrione murino richiede specifiche abilità manuali. A illustrare la procedura sarà la dott.ssa Justina Suk, ricercatrice postdottorato nel mio laboratorio, e la studentessa laureanda Caterina Dres.

Dopo aver sacrificato un topo gravido al 13° o 14° giorno post-coito ed essersi isolati i corni uterini, sciacquarli brevemente in etanolo al 70% e posizionarli in un tubo Falcon contenente PBS, in condizioni asettiche all'interno di una cappa per colture cellulari. Posizionare i corni uterini in una piastra di Petri ed estrarre ciascun embrione dalla placenta e dalla sacca embrionale. Rimuovere la testa e gli organi rossi, lavare i restanti frammenti dell'embrione in PBS e trasferirli in una piastra di Petri pulita utilizzando una lametta sterile.

Infine, tritare il tessuto fino a quando non diventa possibile prelevarlo con una pipetta. Successivamente, aggiungere un millilitro di trips 0,05% in EDTA e 100 K unità per embrione di DNAsi I. Quindi trasferire il tessuto in un tubo Falcon da 50 millilitri e incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius.

Dopo ogni cinque minuti di incubazione, dissociare le cellule aspirando e dispensando accuratamente con una pipetta. Inattivare la tripsina aggiungendo circa un volume di mezzo meth. appena preparato. Centrifugare le cellule per cinque minuti a bassa velocità.

Rimuovere con attenzione il soprannatante e risospendere il pellet in mezzo metilcellulosio tiepido. Preparare flaconi rivestiti con gelatina al 0,2% e incubare per almeno due ore. A temperatura ambiente, seminare le cellule provenienti da circa tre o quattro embrioni in ciascun flacone rivestito con gelatina al 0,2%. I fibroblasti sono le uniche cellule in grado di aderire ai flaconi rivestiti con gelatina.

Dopo circa 24 ore, quando le cellule raggiungono una confluenza dell'80-90%, congelarne alcune a meno 80 gradi Celsius. Per un uso futuro, espandere le cellule rimanenti fino a P tre o P quattro. Per preparare le cellule feeder utilizzando le piastre P tre o P quattro, iniziare rivestendo le fiasche T uno 50 con gelatina allo 0,2% e incubandole a temperatura ambiente per almeno due ore.

Diluire la mitomicina C in PBS e filtrare attraverso un filtro per siringa. Aspirare il mezzo dal meth e lavarlo con PBS privo di calcio o magnesio. Aggiungere 20 millilitri di mezzo contenente 10 microgrammi per millilitro di mitomicina C sui maths e incubare per due ore a 37 gradi Celsius.

Successivamente, lavare le cellule due volte con PBS e trattarle con tripsina. Dopo l'incubazione, sospendere le cellule in mezzo metilico, quindi centrifugare le cellule e risospendere in metilico caldo. Piastrare le cellule a una densità di 56.000 cellule per centimetro quadrato in fiaschi T150 e incubare durante la notte il giorno successivo al piastramento delle cellule metiliche.

Sostituire il mezzo di coltura con mezzo non condizionato per HESC, integrato con quattro nanogrammi per millilitro di FGF2, e incubare a 37 gradi Celsius. Dopo 24 ore, raccogliere il mezzo condizionato dai flaconi e sostituirlo con mezzo fresco per HESC. Conservare il mezzo raccolto a meno 20 gradi Celsius.

Ripetere il prelievo per un totale di sei giorni dopo il sesto prelievo. Combinare tutto il mezzo e filtrarlo. Successivamente, conservarlo in aliquote da 50 millilitri a meno 80 gradi Celsius.

Per misurare l'active in a nel mezzo condizionato, portare tutti i campioni e i reagenti a temperatura ambiente. Diluire l'antibody active in a in PBS con il 1% di BSA e aggiungere 100 microlitri nei pozzetti di una piastra microtitolazione. Incubare per tutta la notte a temperatura ambiente dopo 24 ore.

Lavare i pozzetti tre volte con PBST. Quindi bloccare i pozzetti per un'ora a temperatura ambiente. Nel frattempo, preparare una curva standard attiva, comprensiva di sette diluizioni e un campione bianco, utilizzando un intervallo di lavoro da 0,25 a 32 nanogrammi per millilitro.

Aggiungere duplicati degli standard e dei campioni nelle pozzette e incubare per due ore a temperatura ambiente. Lavare le pozzette tre volte con PBST. Successivamente, aggiungere un anticorpo secondario biotinilato e incubare per due ore a temperatura ambiente.

Quindi lavare i pozzetti tre volte con PBST e aggiungere streptavidina HRP. Dopo aver mescolato e aggiunto il substrato, coprire la piastra per proteggerla dalla luce e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di arresto in ogni pozzetto e mescolare delicatamente.

Infine, impostare il lettore di micropiastre su quattro 50 nanometri con correzione di lunghezza d'onda a cinque 40 o cinque 70 nanometri e determinare la densità ottica per ciascuna pozzetta mostrata. Di seguito è riportata la morfologia tipica delle hESC non differenziate, coltivate in presenza di cellule feeder, in mezzo condizionato e in mezzo definito. In questi esempi, le iPSC umane sono coltivate in presenza di cellule feeder.

Queste immagini mostrano la morfologia dei miti e delle cellule feeder inattivate utilizzate per preparare il mezzo condizionato. In generale, le cellule dovrebbero essere confluenti 24 ore dopo l'isolamento ed essere pronte per essere congelate o espanse. Tuttavia, a volte potrebbero essere necessari due o tre giorni per ottenere colture confluenti.

Il mezzo condizionato deve essere preparato a partire da cellule alla quarta passaggio e non oltre. Questo è cruciale perché le cellule primarie possono essere espanse solo per quattro-cinque passaggi prima dell'insorgenza della senescenza. La citochina attiva in a è considerata uno dei fattori più importanti secreti dalle cellule feeder per il sostegno della crescita indifferenziata delle cellule pluripotenti.

La misurazione del livello di attivo in un mezzo condizionato, come mostrato qui, è un saggio quantitativo conveniente per monitorare la qualità dei mets. Una volta acquisita padronanza, l'isolamento di fibroblasti embrionali di topo può essere eseguito in uno o due ore se effettuato correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di accoppiare gli animali in anticipo e di preparare e autoclavare tutti gli strumenti in anticipo.