Name: Preparazione di cellule di fibroblasti embrionali di topo adatto per colture di cellule pluripotenti umane embrionali e staminali indotta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Impara a preparare fibroblasti embrionali di topo per colture di cellule staminali pluripotenti umane. Questo metodo standardizzato garantisce elevata qualità cellulare e supporta la crescita indifferenziata.

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Un ringraziamento particolare al Dr. Boris Greber per impostare il Activin Un protocollo ELISA pubblicato in Greber et al. 2007. Siamo particolarmente grati alla signora Monica Shevack per preparare la panoramica grafica. Siamo molto grati al dottor Fuchs Heiko per tutto l&#39;aiuto e preziosi consigli prima e durante le riprese. Vorremmo ringraziare tutti i membri del laboratorio Adjaye, soprattutto Elisabeth Socha per mantenere un costante rifornimento di MEF e CM. Riconosciamo anche i nostri colleghi presso l&#39;impianto di animale della MPIMG per il loro sostegno permanente. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dalla Max Planck Society e il [BMBF; numero di concessione 0315717A], partner del ERASysBio + iniziativa finanziata nell&#39;ambito del EU ERA-NET Plus nel 7 ° PQ.

1. Isolamento dei fibroblasti embrionali del mouse (MEF) Le seguenti due fasi vengono eseguite sotto condizioni non asettiche. <ol><li> Sacrifica un topo in stato di gravidanza (CF1, Harlan, USA) a 13 o 14 DPC (giorni post-coitum) per dislocazione cervicale. </li><li> Dissect le corna uterini, sciacquare brevemente nel 70% (v / v) etanolo e posto in una provetta Falcon contenente PBS senza Ca 2 + Mg 2 + (Gibco, Invitrogen). </li></ol> Le seguenti operazioni sono eseguite in una cappa coltura tissutale in condizioni asettiche e utilizzando strumenti sterili. <ol start="3"><li> Mettere le corna uterine in una capsula Petri e separare ogni embrione dalla sua placenta e il sacco embrionale. </li><li> Staccare testa e gli organi rosse, lavare in PBS e mettere tutti gli embrioni in un piatto pulito Petri. Tritare finemente il tessuto usando una lama di rasoio sterile fino diventa possibile pipettare. </li><li> Aggiungere 1 ml di 0,05% tripsina / EDTA (Gibco, Invitrogen), including 100 unità Kunitz di DNasi I (USB), per embrione. </li><li> Trasferire il tessuto in una provetta Falcon da 50 ml e incubare per 15 min a 37 ° C. Dopo ogni 5 minuti di incubazione, le cellule dissociare pipettando su e giù accuratamente. </li><li> Inattivare la tripsina aggiungendo circa 1 volume di terreno MEF appena preparato. MEF terreno di coltura (componenti per fare 500 ml di media, mescolare tutti i componenti e filtro): 450 ml di DMEM, 50 ml di FBS (10% (v / v)), 5 ml di 200 mM L-glutammina (1/100 (v / v)), 5 ml di penicillina-streptomicina (1/100 (v / v)). </li><li> Centrifugare le cellule con bassa velocità (300 xg), 5 min, rimuovere con cautela il surnatante e risospendere il pellet cellulare in media MEF caldo. </li><li> Tavola circa un numero di celle che è equivalente a 3-4 embrioni in ciascun (TPP) pallone T150 rivestiti con 0,2% di gelatina (gelatina di pelle bovina, tipo B, Sigma) per 2 h. I fibroblasti (P0, il passaggio 0) sono le uniche cellule che hanno la possibilità di allegare alla gelatina rivestite fiaschi. </li&gt; <li> Idealmente, le cellule sono confluenti 80-90% dopo 24 ore e in questa fase una parte importante del P0 cellule viene congelato per uso futuro. </li><li> Espandere il restante T150 pallone (s) di P0 cellule fino P3 o P4, e quindi inattivare usare come alimentatori per replate hESC o per produrre mezzo condizionato (CM). </li></ol> 2. Inattivazione e placcatura MEF (Feeder Preparazione Cells) Tutte le fasi sono eseguite in una cappa coltura tissutale in condizioni asettiche. <ol><li> Cappotto T150 palloni con il 0,2% di gelatina ed incubare a temperatura ambiente per almeno 2 ore. </li><li> Diluire mitomicina C in PBS (1 mg / ml) e filtrare. </li><li> Aspirare media da MEF e lavare con PBS senza Ca 2 + Mg 2 +. </li><li> Trasferire 20 ml di mezzo contenente 10 ug / ml di mitomicina C il MEF. </li><li> Incubare per 2 ore a 37 ° C con mitomicina C contenente il mezzo poi lavate due volte con PBS, Tripsinizzare, centrifuga (per 5 minuti a 300 xg) e risospendere le cellule in mezzo caldo. </li><li>Contare le cellule e la piastra ad una densità di 56.000 cellule / cm 2 in fiasche T150 e di utilizzare per la produzione CM per i successivi 6 giorni. </li></ol> 3. Condizionata Medium (CM) Preparazione Tutte le fasi sono eseguite in una cappa coltura tissutale in condizioni asettiche. <ol><li> Il giorno dopo la piastratura inattivato MEF ad una densità di 56.000 cellule / cm 2 sostituire il mezzo MEF con il mezzo hESC (UM, media incondizionata) (0,5 ml / cm 2) appena completato con 4 ng / ml di FGF2. </li><li> Raccogliere CM da beute alimentazione dopo 24 h di incubazione e aggiungere mezzo fresco contenente hESC 4 ng / ml di FGF2 agli alimentatori. </li><li> Ripetere questa procedura per i prossimi 6 giorni. Ogni negozio raccolti CM giorni a -20 ° C. </li><li> Dopo 6 giorni mescolare tutte le aliquote di medio e filtro (Corning, 0,22 micron, PAS). Effettuare aliquote di 50 ml e conservare a -80 ° C. </li><li> Supplemento CM con ulteriori 4 ng / ml di FGF2 prima di aggiungere al hESC coltivate Matrigel. &lt;/ Li&gt; </ol> 4. Misura di Activin A in Media condizionata (ELISA) 15 <ol><li> Portare tutti i campioni e reagenti a temperatura ambiente. </li><li> Diluire la cattura anticorpale (Human \ Mouse \ Rat activina A MAB, R &amp; D Systems) in PBS con 1% BSA, aggiungere alla micropiastra (100 pl / pozzetto) ed incubare una notte a temperatura ambiente. </li><li> Dopo 24 ore lavare i pozzetti tre volte con PBST (PBS con 0,05% Tween 20) (300 pl / pozzetto), allora blocco (1% BSA / PBS, 300 pl / pozzetto) per 1 ora a RT. </li><li> In questo tempo preparare una Activin A (R &amp; D Systems) curva standard, tra cui 7 diluizioni (concentrazione inferiore a 30 ng / ml) e il campione in bianco. Il campo lineare di lavoro del Activin A è tra 0,25 e 32 ng / ml. </li><li> Aggiungi duplicati degli standard e dei campioni ai pozzetti (100 pl / pozzetto) e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Lavare tre volte (300 ml di PBST) pozzi. </li><li> Aggiungere il secondario (biotinilato) anticorpi (Human / Mouse / Rat Biotinylated Activin A MAb, R &amp; D Systems) (0.25 ug / ml in 1% BSA / PBS) e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Lavare tre volte (300 ml di PBST) pozzi, aggiungere streptavidina-HRP (diluita in 1% BSA / PBS, R &amp; D Systems) e incubare per 20 minuti a RT. </li><li> Lavare tre volte (300 ml di PBST) pozzetti, aggiungere 100 microlitri di soluzione di substrato (Quantikine, R &amp; D Systems) e incubare per 30 min a RT al buio. </li><li> Aggiungere 100 ml di soluzione di arresto (Quantikine, R &amp; D Systems) in ciascun pozzetto e mescolare delicatamente. </li><li> Set Lettore di micropiastre (Molecular Devices Spectra Max 250, Global Medical Instrumentation, Inc., Minnesota) a 450 nm, con correzione lunghezza d&#39;onda a 540 o 570 nm, per determinare la densità ottica di ciascun pozzetto. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Lo schema generale della procedura di isolamento è presentato in Figura 1. La morfologia tipica delle hESC hiPSCs e coltivate in condizioni differenti è presentata in Figura 2. La morfologia dei<html> MEF e cellule feeder inattivate usati per preparare CM è presentato nella Figura 3. In generale, le celle devono essere confluenti 24 ore dopo l&#39;isolamento e pronti per essere congelati o espanso. Tuttavia, a volte potrebbe richiedere 2-3 giorni prima di ottenere colture confluenti. Il CM deve essere preparato dalle cellule al passaggio 4 e non dopo. Questo è fondamentale perché le cellule primarie può essere ampliato per 4-5 passaggi prima dell&#39;inizio della senescenza. La citochina, Activin A, è considerato il principale fattore critico secreto dalle cellule di alimentazione per il sostegno di crescita indifferenziata di cellule pluripotenti 14. La misurazione del livello di Activin A in CM (figura 4) è un saggio quantitativo molto conveniente per monitorare la qualità di MEF. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig1.jpg" /> Figura 1. Una rappresentazione schematica della procedura di isolamento MEF. ONTENUTO &quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig2.jpg" /> Figura 2. La morfologia tipica delle hESC indifferenziati coltivate in presenza di (A), le cellule di alimentazione (B) mezzo condizionato e media (C) definita. La morfologia tipica di hiPSCs coltivate in presenza di (D, E) cellule di alimentazione. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig3.jpg" /> Figura 3. La morfologia tipica di fibroblasti embrionali di topo (MEF). (A) Passaggio 0 (P0) due giorni dopo placcatura / isolamento, (B) inattivato strato alimentatore ad una densità di 56.000 cellule / cm 2. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3854/3854fig4.jpg" /> Figura 4. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) a base di misurazioni della concentrazione di Activin A in mezzo condizionato (CM) prepared con fibroblasti embrionali di topo derivate dal ceppo di topi CF1. CM è stato raccolto per 6 giorni e poi sommati. CM &quot;1&quot; e CM &quot;2&quot; si riferiscono a diversi lotti di media e di messaggistica unificata ai media incondizionati. Poiché la funzione del processo di condizionamento viene Activin A secrezione nel mezzo di MEF, Activin Un quasi impercettibile a UM.

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</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

La procedura di isolamento MEF qui presentata consente la creazione di una condizione di cultura standardizzata per le hESC e hiPSCs. Inoltre il sistema ELISA basato utilizzato per valutare la produzione di citochine da cellule di alimentazione è un utile indicatore della qualità dei mezzi condizionati MEF-derivati. La manutenzione ordinaria del ceppo di topo (CF1) fornendo fibroblasti supporto è necessaria per evitare lotto a lotto variazione di terreni di coltura. Inoltre, si raccomanda di isolare embrioni di topo contemporaneamente per ottenere una qualità costante di cellule. Certo, appena isolato MEF può essere mantenuto congelato a P0 e P1. Inoltre inattivati ​​MEF può essere conservato congelato in aliquote di quantità appropriate a seconda delle esigenze per colture cellulari. Di solito circa 250.000 cellule devono essere seminati in un singolo pozzo di una piastra da 6 pozzetti di hESC cultura e le cellule iPS. Il metodo consolidato e ottimizzato può essere utilizzato di routine per ridurre la variabilità tra diffeaffitto esperimenti.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> DMEM (glucosio) </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 41966-052 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Biochrom </td><td> S0115 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 25030-024 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina-streptomicina </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Sistema di aspirazione del filtro </td><td> Corning </td><td> 431097 </td><td> 500 ml, 0,22 micron, PAS </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Knockout DMEM </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 10829-018 </td><td></td></tr><tr><td> Knockout Serum sostituzione </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td></td></tr><tr><td> Aminoacidi non essenziali </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 11140-035 </td><td></td></tr><tr><td> beta-mercaptoetanolo </td><td> Sigma </td><td> M7522 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 14190-169 </td><td></td></tr><tr><td> DNasi I </td><td> Sigma </td><td> D4527 </td><td></td></tr><tr><td> Mitomicina C </td><td> Roche </td><td> 10107409001 </td><td></td></tr><tr><td> Base Fibroblast Growth Factor </td><td> Peprotech </td><td> 100-18B </td><td></td></tr><tr><td> Biotinilato Anti-human/mouse/rat Activin Un anticorpo </td><td> R &amp; D Systems </td><td> BAM3381 </td><td></td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Sigma </td><td> G9391 </td><td></td></tr><tr><td> Umano / Mouse /Rat Activin A MAb </td><td> R &amp; D Systems </td><td> MAB3381 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% tripsina-EDTA </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Extra Scissors Iris sottili </td><td> FST </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Extra Pinza Graefe Belle </td><td> FST </td><td> 11150-10 </td><td></td></tr><tr><td> Pinza di fissaggio Pierse </td><td> FST </td><td> 18155-13 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione di cellule di fibroblasti embrionali di topo adatto per colture di cellule pluripotenti umane embrionali e staminali indotta

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In generale, le cellule staminali embrionali umane (hESC) e umani cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs) 1 può essere coltivato in condizioni variabili. Tuttavia, non è facile stabilire un sistema efficace per la coltura di tali cellule. Poiché le condizioni di coltura può influenzare l&#39;espressione del gene che conferisce la pluripotenza in hESC e hiPSCs, l&#39;ottimizzazione e la standardizzazione del metodo di cultura è fondamentale. La creazione di linee di hESC è stato descritto utilizzando MEF come cellule di alimentazione e siero bovino fetale (FBS)-2 contenente terreno di coltura. Successivamente, FBS è stato sostituito con la sostituzione knockout siero (KSR) e FGF2, che aumenta la proliferazione delle hESC 3. Infine, l&#39;alimentatore senza sistemi di coltura permettono alle cellule in coltura Matrigel rivestite con lastre in KSR contenente mezzo condizionato (medium condizionato dal MEF) 4. Successivamente, condizioni di coltura hESC si sono spostati verso alimentatore privo di cultura nel definire chimicamenteEd condizioni 5-7. Inoltre, per evitare il potenziale contaminazione da agenti patogeni e proteine ​​animali metodi di coltura utilizzando xeno-free componenti sono state stabilite 8. Per ottenere migliori condizioni cellule di alimentazione di topo sono stati sostituiti con linee cellulari umane (ad esempio muscolari fetale e 9 cellule della pelle, cellule adulte 10, fibroblasti prepuzio 11-12, amniotico cellule mesenchimali 13). Tuttavia, l&#39;efficienza di mantenere hESC indifferenziate utilizzando prepuzio fibroblasti umani di derivazione strati di alimentazione non è così elevata come quella di cellule feeder topo a causa del basso livello di secrezione di Activin A 14. Ovviamente, vi è una differenza evidente nella produzione di fattore di crescita di topo e cellule feeder umane. L&#39;analisi dei trascrittomi di topo e cellule di alimentazione umana ha rivelato differenze significative tra le cellule di sostegno e non di sostegno. Esogena FGF2 è fondamentale per eseguire manutenzioneNing auto-rinnovamento delle hESC e hiPSCs, ed è stato identificato come un fattore chiave regolando l&#39;espressione di Tgfβ1, Activin A e Gremlin (un antagonista BMP) nelle cellule di alimentazione. Activin A ha mostrato di indurre l&#39;espressione di OCT4, SOX2, e Nanog in hESC 15-16. Per lungo termine cultura, hESC e hiPSCs possono essere coltivate su mitoticamente inattivato MEF o sotto alimentatore senza condizioni MEF-CM (MEF condizionata Medium) su Matrigel rivestite con lastre di mantenere il loro stato indifferenziato. Il successo di entrambe le condizioni di coltura dipende completamente la qualità delle cellule di alimentazione, poiché influenza direttamente la crescita delle hESC. Qui, presentiamo un metodo ottimizzato per l&#39;isolamento e la coltura di fibroblasti embrionali di topo (MEF), preparazione del terreno condizionato (CM) e enzyme-linked test immunoenzimatico (ELISA) per valutare i livelli di Activin A all&#39;interno dei media.

La qualità di fibroblasti embrionali di topo (MEF) è dettata dal ceppo destro del mouse, ad esempio CF-1. Pluripotenza-solidale MEF e mezzi condizionati (CM) ottenuti da questi dovrebbe contenere le concentrazioni ottimali di Activin A, Gremlin e Tgfβ1 necessari per la Activin / Nodale FGF e percorsi di co-operativamente mantenere il self-renewal e la pluripotenza.

Preparazione di cellule di fibroblasti embrionali di topo adatto per colture di cellule pluripotenti umane embrionali e staminali indotta

In generale, le cellule staminali embrionali umane (hESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) possono essere coltivate in condizioni variabili. Tuttavia, esso...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare fibroblasti embrionali murini adatti alla coltura di cellule staminali embrionali umane e di cellule staminali pluripotenti indotte. Questo viene ottenuto innanzitutto separando ciascun embrione e rimuovendo la testa e gli organi rossi. Successivamente, il tessuto viene finemente tritato e digerito.Quindi le cellule vengono seminate, da tre a quattro embrioni per fiala, e amplificate. Infine, i miti inattivati vengono utilizzati per preparare il mezzo condizionato. In ultima analisi, l'LSA viene utilizzato per determinare la concentrazione ottimale di attivo all'interno del mezzo condizionato che sostiene la crescita indifferenziata delle cellule staminali pluripotenti.Generalmente, chi si approccia per la prima volta a questo metodo incontrerà difficoltà poiché la procedura deve essere standardizzata per produrre fibroblasti embrionali murini di alta qualità, necessari per la crescita indifferenziata sia delle cellule staminali embrionali umane che delle cellule staminali pluripotenti indotte. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché l'isolamento e la dissezione degli embrioni risultano difficili da apprendere, in quanto la manipolazione dell'embrione murino richiede specifiche abilità manuali. A illustrare la procedura sarà la dott.ssa Justina Suk, ricercatrice postdottorato nel mio laboratorio, e la studentessa laureanda Caterina Dres.Dopo aver sacrificato un topo gravido al 13° o 14° giorno post-coito ed essersi isolati i corni uterini, sciacquarli brevemente in etanolo al 70% e posizionarli in un tubo Falcon contenente PBS, in condizioni asettiche all'interno di una cappa per colture cellulari. Posizionare i corni uterini in una piastra di Petri ed estrarre ciascun embrione dalla placenta e dalla sacca embrionale. Rimuovere la testa e gli organi rossi, lavare i restanti frammenti dell'embrione in PBS e trasferirli in una piastra di Petri pulita utilizzando una lametta sterile.Infine, tritare il tessuto fino a quando non diventa possibile prelevarlo con una pipetta. Successivamente, aggiungere un millilitro di trips 0,05% in EDTA e 100 K unità per embrione di DNAsi I. Quindi trasferire il tessuto in un tubo Falcon da 50 millilitri e incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius.Dopo ogni cinque minuti di incubazione, dissociare le cellule aspirando e dispensando accuratamente con una pipetta. Inattivare la tripsina aggiungendo circa un volume di mezzo meth. appena preparato. Centrifugare le cellule per cinque minuti a bassa velocità.Rimuovere con attenzione il soprannatante e risospendere il pellet in mezzo metilcellulosio tiepido. Preparare flaconi rivestiti con gelatina al 0,2% e incubare per almeno due ore. A temperatura ambiente, seminare le cellule provenienti da circa tre o quattro embrioni in ciascun flacone rivestito con gelatina al 0,2%. I fibroblasti sono le uniche cellule in grado di aderire ai flaconi rivestiti con gelatina.Dopo circa 24 ore, quando le cellule raggiungono una confluenza dell'80-90%, congelarne alcune a meno 80 gradi Celsius. Per un uso futuro, espandere le cellule rimanenti fino a P tre o P quattro. Per preparare le cellule feeder utilizzando le piastre P tre o P quattro, iniziare rivestendo le fiasche T uno 50 con gelatina allo 0,2% e incubandole a temperatura ambiente per almeno due ore.Diluire la mitomicina C in PBS e filtrare attraverso un filtro per siringa. Aspirare il mezzo dal meth e lavarlo con PBS privo di calcio o magnesio. Aggiungere 20 millilitri di mezzo contenente 10 microgrammi per millilitro di mitomicina C sui maths e incubare per due ore a 37 gradi Celsius.Successivamente, lavare le cellule due volte con PBS e trattarle con tripsina. Dopo l'incubazione, sospendere le cellule in mezzo metilico, quindi centrifugare le cellule e risospendere in metilico caldo. Piastrare le cellule a una densità di 56.000 cellule per centimetro quadrato in fiaschi T150 e incubare durante la notte il giorno successivo al piastramento delle cellule metiliche.Sostituire il mezzo di coltura con mezzo non condizionato per HESC, integrato con quattro nanogrammi per millilitro di FGF2, e incubare a 37 gradi Celsius. Dopo 24 ore, raccogliere il mezzo condizionato dai flaconi e sostituirlo con mezzo fresco per HESC. Conservare il mezzo raccolto a meno 20 gradi Celsius.Ripetere il prelievo per un totale di sei giorni dopo il sesto prelievo. Combinare tutto il mezzo e filtrarlo. Successivamente, conservarlo in aliquote da 50 millilitri a meno 80 gradi Celsius.Per misurare l'active in a nel mezzo condizionato, portare tutti i campioni e i reagenti a temperatura ambiente. Diluire l'antibody active in a in PBS con il 1% di BSA e aggiungere 100 microlitri nei pozzetti di una piastra microtitolazione. Incubare per tutta la notte a temperatura ambiente dopo 24 ore.Lavare i pozzetti tre volte con PBST. Quindi bloccare i pozzetti per un'ora a temperatura ambiente. Nel frattempo, preparare una curva standard attiva, comprensiva di sette diluizioni e un campione bianco, utilizzando un intervallo di lavoro da 0,25 a 32 nanogrammi per millilitro.Aggiungere duplicati degli standard e dei campioni nelle pozzette e incubare per due ore a temperatura ambiente. Lavare le pozzette tre volte con PBST. Successivamente, aggiungere un anticorpo secondario biotinilato e incubare per due ore a temperatura ambiente.Quindi lavare i pozzetti tre volte con PBST e aggiungere streptavidina HRP. Dopo aver mescolato e aggiunto il substrato, coprire la piastra per proteggerla dalla luce e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di arresto in ogni pozzetto e mescolare delicatamente.Infine, impostare il lettore di micropiastre su quattro 50 nanometri con correzione di lunghezza d'onda a cinque 40 o cinque 70 nanometri e determinare la densità ottica per ciascuna pozzetta mostrata. Di seguito è riportata la morfologia tipica delle hESC non differenziate, coltivate in presenza di cellule feeder, in mezzo condizionato e in mezzo definito. In questi esempi, le iPSC umane sono coltivate in presenza di cellule feeder.Queste immagini mostrano la morfologia dei miti e delle cellule feeder inattivate utilizzate per preparare il mezzo condizionato. In generale, le cellule dovrebbero essere confluenti 24 ore dopo l'isolamento ed essere pronte per essere congelate o espanse. Tuttavia, a volte potrebbero essere necessari due o tre giorni per ottenere colture confluenti.Il mezzo condizionato deve essere preparato a partire da cellule alla quarta passaggio e non oltre. Questo è cruciale perché le cellule primarie possono essere espanse solo per quattro-cinque passaggi prima dell'insorgenza della senescenza. La citochina attiva in a è considerata uno dei fattori più importanti secreti dalle cellule feeder per il sostegno della crescita indifferenziata delle cellule pluripotenti.La misurazione del livello di attivo in un mezzo condizionato, come mostrato qui, è un saggio quantitativo conveniente per monitorare la qualità dei mets. Una volta acquisita padronanza, l'isolamento di fibroblasti embrionali di topo può essere eseguito in uno o due ore se effettuato correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di accoppiare gli animali in anticipo e di preparare e autoclavare tutti gli strumenti in anticipo.

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