Espressione e purificazione della proteina transmembrana cistica regolatore fibrosi conduttanza in Saccharomyces cerevisiae

L'obiettivo generale di questa procedura è esprimere quantità in milligrammi della proteina CFTR in Charmy Visier. Questo viene ottenuto innanzitutto selezionando colonie TRANSFORMANT per prove di crescita ed espressione in colture cellulari da 50 millilitri. Successivamente, le cellule lisate e le colonie che esprimono CFTR vengono identificate.

Successivamente, le colonie con la più alta espressione di CFTR vengono coltivate in un fermentatore da 15 litri. Infine, le cellule vengono lisate e vengono preparati microsomi contenenti CFTR. In definitiva, i risultati mostrano l'espressione e l'estrazione di CFTR fuso a GFP mediante fluorescenza in gel e microscopia a fluorescenza.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti per l'espressione di CFTR è che utilizza un ospite eucariotico semplice, economico, rapido e facile da coltivare. È dotata di un marcatore con proteina fluorescente verde che consente un rapido monitoraggio dei livelli di espressione. Infine, i passaggi di biologia molecolare sono ridotti al minimo in questa procedura.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della fibrosi cistica, come ad esempio le proprietà biofisiche della proteina CFTR. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia della fibrosi cistica, poiché potrebbero portare a nuovi test farmacologici basati sulla proteina purificata. Nuove categorie di farmaci potrebbero derivare da sostanze che interagiscono direttamente con la proteina.

Il difetto principale nella fibrosi cistica dovrebbe essere più specifico e potenzialmente avere minori effetti pleiotropici. Inoltre, la purificazione di grandi quantità della proteina è importante per ottenere una struttura ad alta risoluzione del CFTR. La progettazione di farmaci basata sulla struttura proteica dovrebbe migliorare i farmaci esistenti e potenzialmente portare alla scoperta di nuovi farmaci.

La pubblicazione di questo articolo e del video allegato è collegata alla distribuzione di DNA o cellule trasformate tramite la Cystic Fibrosis Foundation. Se desiderate ottenere questi materiali, rivolgetevi a Elizabeth Joof presso la Cystic Fibrosis Foundation. Dovrete compilare un accordo per il trasferimento di materiali.

Questo metodo può fornire informazioni sull'uso di un marcatore GFP per l'espressione di proteine di membrana, come introdotto da David Drew e dai suoi collaboratori all'Imperial College di Londra. Le persone alle prime armi con questo metodo potrebbero incontrare difficoltà nella trasformazione. Le efficienze possono essere basse e il momento del recupero delle cellule è critico per ottenere livelli di espressione elevati.

L'idea iniziale per questo metodo è nata durante una visita di David Drew e del suo gruppo al nostro laboratorio. Stavano conducendo studi strutturali su proteine di membrana che avevano espresso e purificato da lievito utilizzando questo sistema. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la trasformazione cellulare, la crescita cellulare dopo induzione e l'isolamento di microsomi risultano difficili, soprattutto quando la pubblicazione è legata al rilascio di un reagente.

Il video contribuirà anche a standardizzare il protocollo in modo che laboratori diversi possano confrontare i propri risultati. A dimostrare questa procedura saranno Tracy Remington e Natasha Kant, entrambe studentesse laureate nel nostro laboratorio. Liam o Ryan, l'altro coautore dell'articolo, si trova attualmente in Nuova Zelanda ed è stato impossibilitato a partecipare alla dimostrazione. Dopo aver trasformato il ceppo di s. visi FGY 2 1 7 con un plasmide di lievito che codifica per il gene C-F-T-R-G-F-P otto hiss, selezionare da cinque a dieci colonie ben separate da una piastra di trasformazione.

Trasferire ciascuna colonia in un tubo sterile da 50 millilitri di tipo Falcon contenente nove millilitri di mezzo base azotato per lieviti o mezzo YNB e un millilitro di glucosio. Colture. Far crescere le colture per 16 ore durante la notte a 250 giri al minuto e a 30 gradi Celsius in un incubatore con agitazione orbitale per preparare stock glicerolati per ciascuna delle colonie analizzate. Aggiungere in modo asettico 0,8 millilitri delle colture notturne a 0,2 millilitri di glicerolo sterile in vial con tappo a vite opportunamente etichettati.

Vortexare brevemente e conservare a meno 80 gradi Celsius. Diluire le colture rimanenti fino a un volume finale di 50 millilitri in YMB con 250 microlitri di mezzo glucosio. Far crescere le colture in flaconi Erlenmeyer bafllati da 250 millilitri, etichettati, fino a un OD 600 compreso tra 0,7 e 0,8 a 250 giri al minuto e 30 gradi Celsius in un incubatore con agitazione orbitale. Indurre le colture aggiungendo cinque millilitri di mezzo galattosio a ciascun flacone. Ridurre la temperatura dell'incubatore a 25 gradi Celsius e far crescere per tutta la notte per 16 ore.

Trasferire le colture in provette Falcon da 50 millilitri. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 3.500 ×g a quattro gradi Celsius per 10 minuti in una centrifuga da banco mentre la centrifuga è in funzione. Preparare provette microfuge con tappo a vite da due millilitri contenenti circa 300 microlitri di perle di vetro lavate con acido e porle sul ghiaccio.

Eliminare i soprannatanti e risospendere ogni pellet in 800 microlitri di tampone freddo per la risospensione delle cellule (Resus) o CRB con inibitori della proteasi. Trasferire le sospensioni nei tubi microrefuso e mantenerli sul ghiaccio. Caricare le cellule in un minifrullatore a perline e farlo funzionare per tre minuti.

Posizionare le provette in una microcentrifuga da banco e centrifugare a 3.500 ×g a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Trasferire i soprannatanti contenenti le membrane in provette pulite per microcentrifuga e porre sul ghiaccio. Raccogliere le membrane grezze centrifugando alla velocità massima a quattro gradi Celsius in una microcentrifuga da banco per due ore.

Eliminare il soprannatante e risospendere ogni pellet in 50 microlitri di ghiaccio. Chiamare CFTR buffer in provette microcentrifuga pulite. Mescolare 15 microlitri di ciascuna sospensione con 15 microlitri di colorante di caricamento doppia concentrazione mediante pipetta.

Non far bollire i campioni poiché ciò causerebbe la formazione di aggregati insolubili in SDS da parte della CFTR e di altre proteine di membrana, oltre a denaturare il marcatore GFP. Caricare i campioni insieme a un marcatore proteico precolorato su un gel gradientizzato di glicina al 4-20% e farlo correre a 150 volt per 40 minuti. Dopo aver eseguito la fluorescenza in gel per identificare le cellule con espressione più elevata e aver verificato l'espressione mediante colorazione di Kumasi, isolare su una piastra YNBA fresca la linea cellulare con espressione più alta dal suo stock in glicerolo e incubare a 30 gradi Celsius per due o tre giorni.

Conservare la piastra fino a due settimane a quattro gradi Celsius per preparare colture precoci per il fermentatore. Utilizzare un’ansa sterile per raschiare un’area quadrata di un centimetro di cellule dalla piastra A-Y-N-B-A e aggiungerla a 45 millilitri di terreno YMB e cinque millilitri di terreno al glucosio per ottenere un OD 600 di circa 0,1. Far crescere le colture a 250 RPM e 30 gradi Celsius in un incubatore con agitazione orbitale fino a quando l’OD 600 raggiunge il valore di 1.

Dividere la coltura tra due fiaschi Erlenmeyer da due litri con piastre deflettenti, ciascuno contenente 450 millilitri di mezzo YMB e 25 millilitri di glucosio. Far crescere il mezzo per tutta la notte a 250 giri al minuto a 30 gradi Celsius in un incubatore agitatore orbitale fino a quando l'OD 600 raggiunge 1,2. Per preparare il fermentatore, preparare 11,2 litri di YNB e aggiungere ulteriori 8,28 grammi di YNB e 0,95 grammi di integrazione dropout per compensare l'aggiunta di glicerolo durante l'induzione.

Successivamente, in condizioni asettiche, aggiungere i 11,2 litri di YNB e 75 millilitri di mezzo glucosato a un biorreattore sterile da 20 litri e regolare la temperatura di funzionamento a 30 gradi Celsius. Quindi, in condizioni asettiche, aggiungere i precolture al biorreattore. Impostare la velocità di agitazione a circa 800 giri al minuto e regolare il flusso d'aria compressa a circa 15 decimetri cubi al minuto.

Quando la coltura raggiunge un OD 600 di 1,2, indurre aggiungendo asetticamente 1,5 litri di mezzo con galattosio e 1,2 litri di glicerolo. Ridurre la temperatura a 25 gradi Celsius e lasciare crescere la coltura per 16 ore utilizzando una pompa peristaltica. Trasferire la coltura in provette da centrifuga da un litro raffreddate, ponendole sul ghiaccio.

Centrifugare le cellule per 30 minuti a 3.500 ×g a quattro gradi Celsius. Sospendere le cellule in 150 millilitri di buffer di sospensione freddo ghiaccio micro zone Resus o MRB con inibitori della proteasi e 1 millimolare DTT. Da questo momento eseguire tutte le operazioni a quattro gradi Celsius. Utilizzare un disgregatore cellulare per lisare le cellule.

Quindi trasferire i lisati in provette falcon da 50 millilitri e pellettare i detriti cellulari mediante centrifugazione a 3.500 ×g e 4 gradi Celsius per 15 minuti. Per rimuovere i mitocondri, trasferire il sopranatante in provette da centrifuga refrigerate e centrifugare a 14.000 ×g a 4 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, per raccogliere i microsomi, trasferire il sopranatante in provette da ultracentrifuga refrigerate e centrifugare a 200.000 ×g a 4 gradi Celsius per 90 minuti.

Versare con attenzione e scartare il surnatante e aggiungere due millilitri di tampone CFTR freddo con inibitori delle proteasi e DTT uno millimolare a ogni provetta. Utilizzando un pennello, risospendere delicatamente i pellet. Successivamente, portare a volume ogni provetta con tampone CFTL e vorticare. Centrifugare la sospensione a 100.000 ×g a quattro gradi Celsius per 60 minuti.

Scartare l'agente sopranominato e utilizzare un pennello per ripetere il processo di sospensione del Resus in due millilitri di tampone CFTR freddo con inibitori della proteasi e DTT uno millimolare. Raccogliere i microsomi risospesi, quindi regolare il volume finale a 50 millilitri con tampone CFTR e mescolare accuratamente. Conservare un'aliquote di un millilitro per l'elettroforesi SDS-PAGE e conservare i microsomi a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso per l'estrazione del CFTR dai microsomi.

Consultare il protocollo scritto. La trasformazione di lievito con il plasmide contenente CFTR non è efficiente al 100%. Uno screening su piccola scala rappresentativo dell'espressione di CFTR in colonie selezionate da un esperimento di trasformazione produrrà circa una colonia su quattro che esprime la proteina mostrata.

Di seguito sono riportati i risultati di un'analisi di cinque colonie prelevate da una piastra. Una colonia mostra un elevato livello di espressione della proteina di fusione C-F-T-R-G-F-P. I livelli di fluorescenza della C-F-T-R-G-F-P varieranno notevolmente tra esperimenti diversi, con la colonia quattro che presenta una fluorescenza almeno 10 volte maggiore rispetto alla banda fluorescente intrinseca a circa 70 chilodalton.

Anche con un elevato livello di espressione di C-F-T-R-G-F-P come mostrato a sinistra, è improbabile che la banda di C-F-T-R-G-F-P sia distinguibile nell'estratto cellulare mediante colorazione con kumasi, come si osserva a destra. Questa figura mostra la presenza di C-F-T-R-G-F-P all'interno dei microsomi. I risultati di questo esperimento sono importanti non solo per valutare l'efficienza dell'induzione dell'espressione, ma anche per verificare che i microsomi siano stati preparati con attenzione e che la proteolisi sia stata ridotta al minimo.

Come mostrato qui, la crescita delle cellule oltre le 16 ore porterà a una riduzione dell'espressione di CFTR. Ciò è probabilmente dovuto al turnover della proteina, forse a causa dell'upregolazione del sistema di controllo della qualità proteica del lievito.

È quindi consigliabile monitorare i livelli di espressione di CFTR dopo l'induzione, utilizzando la fluorescenza in gel e l'analisi mediante imaging fluorescente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante monitorare la crescita cellulare mediante misurazioni dell'OD 600. Provare innanzitutto tutto in piccola scala prima di passare a una scala maggiore e verificare l'espressione proteica in funzione del tempo. Dopo l'induzione, il momento ottimale per raccogliere le cellule può variare da laboratorio a laboratorio.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come esprimere quantità in milligrammi della proteina CFTR nel lievito Scro Visier. Seguendo questa procedura, la proteina CFTR può essere purificata dai microsomi del lievito per ulteriori caratterizzazioni biochimiche e biofisiche. Dopo il suo sviluppo da parte di David Drew e dei suoi collaboratori, questa tecnica ha aperto la strada a un'espressione migliore delle proteine di membrana eucariotiche.

Speriamo che questo lavoro abbia un impatto sulla ricerca sulla fibrosi cistica, consentendo ai laboratori di tutto il mondo di produrre CFTR utilizzando un sistema di espressione economico e semplice. Questo lavoro non sarebbe stato possibile senza il sostegno della Cystic Fibrosis Foundation e, ovviamente, dei nostri colleghi del CFTR Three Dimensional Structure Consortium. Non dimenticare che il lavoro con qualsiasi organismo ricombinante è strettamente regolamentato e che le procedure di manipolazione e smaltimento devono essere approvate dall'apposita autorità di controllo prima di iniziare qualsiasi attività.