Name: Caratterizzazione fenotipica e funzionale delle cellule endoteliali Colony Forming derivato dal sangue del cordone ombelicale umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 46 s
Description: Scopri come derivare e caratterizzare cellule endoteliali Colony Forming dal sangue del cordone ombelicale umano. Questo metodo consente di valutare il potenziale proliferativo clonale e la capacità di formare vasi sanguigni in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Yoder è consulente di EndGenitor Technologies, Inc. e membro del consiglio di Rimedion Technologies, Inc.

<ol><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473, 298-307 (2011).</li>
<li>Asahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+putative+progenitor+endothelial+cells+for+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.</a> Science. 275, 964-967 (1997).</li>
<li>Urbich, C., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitor+cells%3A+characterization+and+role+in+vascular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology.</a> Circ. Res. 95, 343-353 (2004).</li>
<li>Critser, P. J., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+and+defining+cells+to+engineer+human+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Prolif%22%5BJournal%5D)">Isolating and defining cells to engineer human blood vessels.</a> Cell. Prolif. 44, 15-21 (2011).</li>
<li>Matthias, M., David, N., Josef, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+bench+to+bedside%3A+what+physicians+need+to+know+about+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">From bench to bedside: what physicians need to know about endothelial progenitor cells.</a> Am. J. Med. 124, 489-4897 (2011).</li>
<li>Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel+wall-derived+endothelial+cells+rapidly+proliferate+because+they+contain+a+complete+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells.</a> Blood. 105, 2783-276 (2005).</li>
<li>Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104, 2752-2760 (2004).</li>
<li>Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+principals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li>
<li>Reinisch, A., Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Animal+Serum+Free+Expansion+of+Human+Umbilical+Cord+Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+%28MSCs%29+and+Endothelial+Colony+Forming+Progenitor+Cells+%28ECFCs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs.</a> J. Vis. Exp. (32), e1525(2009).</li>
<li>Au, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+in+vivo+potential+of+endothelial+progenitor+cells+from+human+umbilical+cord+blood+and+adult+peripheral+blood+to+form+functional+long-lasting+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels.</a> Blood. 111, 1302-135 (2008).</li>
<li>Critser, P. J., Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+matrix+physical+properties+modulate+endothelial+colony+forming+cell-derived+vessels+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Collagen matrix physical properties modulate endothelial colony forming cell-derived vessels in vivo.</a> Microvasc. Res. 80, 23-30 (2010).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+robust+and+functional+vascular+networks+in+vivo+with+human+adult+and+cord+blood-derived+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells.</a> Circ. Res. 103, 194-202 (2008).</li>
<li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+vasculogenic+potential+of+human+blood-derived+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Blood. 109, 4761-4768 (2007).</li>
<li>Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Large+Scale+Expansion+of+Adult+Human+Endothelial+Colony+Forming+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells.</a> J. Vis. Exp. (32), e1524(2009).</li>
<li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> J. Clin. Invest. 105, 71-77 (2000).</li>
<li>Witting, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Large+Volume+Lentiviral+Vector+Production+Using+Flow+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient Large Volume Lentiviral Vector Production Using Flow Electroporation.</a> Hum. Gene. Ther. , (2011).</li>
<li>Yoon, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+neovascularization+by+mixed+transplantation+of+early+endothelial+progenitor+cells+and+late+outgrowth+endothelial+cells%3A+the+role+of+angiogenic+cytokines+and+matrix+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Synergistic neovascularization by mixed transplantation of early endothelial progenitor cells and late outgrowth endothelial cells: the role of angiogenic cytokines and matrix metalloproteinases.</a> Circulation. , 112-1618 (2005).</li>
<li>Dubois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+progenitor+cell+populations+on+left+ventricular+remodeling+and+myocardial+neovascularization+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential effects of progenitor cell populations on left ventricular remodeling and myocardial neovascularization after myocardial infarction.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 55, 2232-2243 (2010).</li>
<li>Medina, R. J., O'Neill, C. L., Humphreys, M. W., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outgrowth+endothelial+cells%3A+characterization+and+their+potential+for+reversing+ischemic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Outgrowth endothelial cells: characterization and their potential for reversing ischemic retinopathy.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5906-5913 (2010).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Caratterizzazione fenotipica e funzionale delle cellule progenitrici endoteliali putativi è importante identificare le ECFCs buona fede che sono in grado di clonale serialmente re-placcatura in coltura e dare origine a durevoli e funzionali vasi sanguigni impiantabili in vivo. Sangue del cordone ombelicale umano si arricchisce di ECFCs e la concentrazione di queste cellule circolanti diminuisce con l&#39;invecchiamento o malattia 10. Recenti studi suggeriscono che ECFC può giocare un ruolo i...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Iniezione di sodio eparina, USP </td><td> APP Pharmaceuticals </td><td> 504031 </td></tr><tr><td> Ficoll-Pague </td><td> Amersham Biosciences </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> Cannula di miscelazione </td><td> Maersk Medical </td><td> 500.11.012 </td></tr><tr><td> EGM-2 </td><td> Lonza </td><td> CC-3162 </td></tr><tr><td> Definito FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td></tr><tr><td> Triplo express </td><td> Gibco </td><td> 12605 </td></tr><tr><td> Rat collagene di tipo I </td><td> BD Biosciences </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 356234 </td></tr><tr><td> FcR Block </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-059-901 </td></tr><tr><td> hCD31, FITC coniugazioneTed </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555445 </td></tr><tr><td> hCD45, coniugato FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555482 </td></tr><tr><td> hCD14, coniugato FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555397 </td></tr><tr><td> hCD144, PE coniugato </td><td> eBioscience </td><td> 12-1449-80 </td></tr><tr><td> hCD146, PE coniugato </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550315 </td></tr><tr><td> hCD105, PE coniugato </td><td> Invitrogen </td><td> MHCD10504 </td></tr><tr><td> Ms 1 IgG, anticorpi k, coniugato FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555748 </td></tr><tr><td> Ms 1 IgG, anticorpi k, coniugato con PE </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559320 </td></tr><tr><td> Ms IgG 2a, anticorpi k, coniugato FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555573 </td></tr><tr><td> Anti-CD31 umano </td><td> Dako </td><td> clone JC70 / A </td></tr><tr><td> Anti-mouse CD31 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553370 </td></tr><tr><td> 0,22-um vuoto sistema di filtrazione </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td></tr><tr><td> Acido acetico glaciale, 17.4N </td><td> Pescatore </td><td> A38-500 </td></tr><tr><td> Antibiotico-antimicotica </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td></tr><tr><td> Siero bovino fetale (FBS) </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td></tr><tr><td> IHC zinco Fixative </td><td> BD Biosciences </td><td> 550523 </td></tr><tr><td> Sytox verde reagente </td><td> Invitrogen </td><td> S33025 </td></tr><tr><td> Cilindri clonazione, sterili </td><td> Fisher Scientific </td><td> 07-907-10 </td></tr></tbody></table>

caratterizzazione fenotipica e funzionale delle cellule endoteliali colony forming derivato dal sangue del cordone ombelicale umano

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Viste di vecchia data della formazione di nuovi vasi sanguigni attraverso l&#39;angiogenesi, vasculogenesi e arteriogenesi sono stati recentemente rivisti 1. La presenza in circolo di cellule progenitrici endoteliali (EPC) sono stati identificati nel sangue periferico umano adulto da Asahara et al. Nel 1997 2 portando un&#39;infusione di nuove ipotesi e strategie per la rigenerazione e la riparazione vascolare. EPC sono componenti rari, ma di normale circolazione del sangue, che ospita i siti di formazione dei vasi sanguigni o di rimodellamento vascolare, e facilitare sia vasculogenesi post-natale, l&#39;angiogenesi, o arteriogenesi in gran parte attraverso la stimolazione paracrina della parete del vaso esistente derivato cellule 3. Nessun marcatore specifico per identificare un EPC è stato identificato, e al momento lo stato del campo è quello di capire che tipi di cellule tra cui numerosi proangiogenica staminali e cellule progenitrici ematopoietiche, cellule circolanti angiogenici, Tie2 + monociti, cel progenitore mieloidels, tumore macrofagi associati, e M2 macrofagi attivati ​​partecipare stimolare il processo angiogenico in una varietà di sistemi preclinici modelli animali e in soggetti umani in numerosi stati di malattia 4, 5. Le cellule endoteliali che formano colonie (ECFCs) sono rare cellule vitali endoteliali circolanti caratterizzate da una forte potenziale proliferativo clonale, colonia secondaria e terziaria capacità di formazione su replating, e la capacità di formare intrinseca in vasi vivo dopo il trapianto in topi immunodeficienti 6-8. Mentre ECFCs sono state isolate con successo dal sangue periferico di soggetti adulti sani, sangue del cordone ombelicale (CB) di neonati sani e parete del serbatoio di numerosi vasi arteriosi e venosi umane 6-9, CB possiede la più alta frequenza di ECFCs 7 che mostra il più robusto potenziale proliferativo clonale e la forma dei vasi sanguigni durevoli e funzionali in vivo 8, 10-13. Sebbene la derivazione diECFC adulto da sangue periferico è stato presentato 14, 15, qui si descrivono le metodologie per la derivazione, clonazione, l&#39;espansione, e in vitro e in vivo caratterizzazione del ECFCs dal ombelicale umano CB.

Le cellule endoteliali che formano colonie (ECFCs) sono cellule endoteliali circolanti con una robusta potenziale proliferativo clonale che mostrano intrinseca<em&gt; In vivo</emNave&gt; capacità di formazione. Caratterizzazione fenotipica e funzionale delle cellule endoteliali escrescenza derivate da CB sono importanti per identificare ed isolare<em&gt; Bona fide</em&gt; ECFCs per il potenziale applicazione clinica nella riparazione di tessuti danneggiati.

Caratterizzazione fenotipica e funzionale delle cellule endoteliali Colony Forming derivato dal sangue del cordone ombelicale umano

Le visioni consolidate sulla formazione di nuovi vasi sanguigni attraverso l'angiogenesi, la vasculogenesi e l'arteriogenesi sono state recentemente riviste1. La presenza di ...

L'obiettivo generale di questa procedura è spiegare come ottenere cellule formanti colonie endoteliali, o eCFC, dal sangue del cordone ombelicale umano. Questo risultato si ottiene innanzitutto seminando cellule mononucleate provenienti dal sangue del cordone ombelicale e successivamente clonando ed espandendo le colonie derivanti da eCFC. Il secondo passaggio consiste nel caratterizzare le cellule in vitro utilizzando una nuova tecnica di saggio monocellulare per valutare il potenziale proliferativo clonale.Infine, le cellule vengono caratterizzate mediante un saggio di formazione di vasi in vivo attraverso la produzione e l'impianto di idrogeli contenenti E CFC in topi nod skid. In definitiva, la formazione in vivo di nuovi vasi sanguigni riempiti da sangue dell'ospite può essere valutata mediante colorazione ematossilina ed eosina (h e) degli impianti cellulari contenenti ECFC. Il vantaggio principale di queste tecniche rispetto ai metodi esistenti è che consentono l'esame del potenziale proliferativo delle cellule endoteliali a livello di singola cellula.Le implicazioni di questa tecnica potrebbero estendersi alla ricerca di strumenti diagnostici e terapeutici per malattie come la malattia arteriosa periferica o PAD, poiché questa tecnica ci consente di esaminare il potenziale proliferativo e la capacità genica delle cellule endoteliali di un paziente. Prima di iniziare la procedura, aggiungere un millilitro di collagene di coda di ratto, di tipo uno, in ciascun pozzetto di una piastra per colture cellulari a sei pozzetti e quindi incubare la piastra tutta la notte. Nel giorno della procedura, aliquotare il sangue del cordone in unità da 15 millilitri in provette coniche da centrifuga da 50 millilitri. Successivamente, aggiungere 20 millilitri di PBS a ciascuna provetta e aspirare e rilasciare la miscela su e giù per diverse volte mediante pipetta.Successivamente, aspirare 15 millilitri di fial PA in una pipetta, posizionare la punta della pipetta sul fondo del tubo contenente il sangue diluito e stratificare delicatamente sotto il fial PA. Centrifugare i tubi per 30 minuti a 740 × g a temperatura ambiente senza impostare la frenata in decelerazione. Dopo la separazione cellulare, utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere lo strato torbido di cellule mononucleate a bassa densità localizzato all'interfaccia tra il fial PA e il plasma diluito. Distribuire le cellule raccolte in un tubo conico da 50 millilitri contenente 10 millilitri di mezzo E GM due e centrifugare le cellule mononucleate per 10 minuti a 515 × g a temperatura ambiente con l'impostazione di frenata in decelerazione alta; aspirare e scartare con attenzione il sopranatante.Successivamente, dopo aver lavato due volte le cellule pellettizzate con EGM2, sospendere le cellule mononucleate in EGM2 a una concentrazione di 1,25 × 10⁷ cellule per millilitro. Ora pipettare quattro millilitri della sospensione di cellule mononucleate in ogni pozzetto della piastra rivestita con collagene e incubare le cellule fino alla formazione di colonie nel primo giorno. Dopo l'incubazione, rimuovere lentamente il mezzo usato dai pozzetti mediante pipetta, senza disturbare le cellule debolmente aderenti.Quindi aggiungere con attenzione quattro millilitri di E GM due alle pozzette e reinserire la piastra nell'incubatore. Le colonie compaiono tipicamente tra il quinto e il quattordicesimo giorno, il giorno precedente la procedura. A 50 microlitri di collagene di coda di ratto.Aggiungere un tipo per ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti come in precedenza e incubare la piastra tutta la notte nel giorno della procedura. Iniziare lavando le cellule, che sono state passaggiate solo due o tre volte, due volte con PBS. Dopo aver aspirato l'ultimo lavaggio con PBS, posizionare un cilindro di clonaggio sterile rivestito di gel attorno a ciascuna colonia, premendo saldamente ogni cilindro contro la piastra mediante pinze sterili.Aggiungere due o tre gocce di triple E express caldo in ogni cilindro di clonaggio e incubare i cilindri per tre-cinque minuti fino a quando le cellule iniziano a staccarsi. Dopo che le cellule hanno iniziato a staccarsi, aggiungere circa 250 microlitri di mezzo EGM due al centro del cilindro ed eseguire pipettaggi ripetuti verso l'alto e verso il basso per ottenere una sospensione di cellule singole. Trasferire ora separatamente la sospensione di cellule singole da ciascun cilindro di clonaggio in una provetta microcentrifuga individuale.Infettare le cellule in una piastra a sei pozzetti con lentivirus esprimenti EGFP e raccogliere le cellule che esprimono EGFP mediante citometria a fluorescenza. Successivamente, incubare le cellule positive per EGFP ed EGM due in piastre rivestite con collagene. Quando le E CFC sono pronte, raccoglierle utilizzando tripE express come appena dimostrato e risospendere le cellule nel mezzo e GM due a una concentrazione finale di circa 10 alla sesta cellule per millilitro.Quindi, utilizzando un citofluorimetro con un flusso ridotto di 20 cellule al secondo, separare una singola ECFC positiva per EGP per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti rivestita con collagene preparata in precedenza; regolare il volume finale di ciascun pozzetto con EGM-2 fino a circa 200 microlitri per pozzetto. Successivamente, utilizzare un microscopio a fluorescenza invertito per verificare che ogni pozzetto contenga una sola cellula. Incubare la piastra per un periodo di due settimane, con due cambi di mezzo al giorno 14 della coltura.Lavare ogni pozzetto con 100 microlitri di PBS prima di fissare le cellule con 100 microlitri di paraformaldeide al 4% per 30 minuti. Per le CFC che non esprimono EGFP, aggiungere il reagente cit, un colorante nucleare fluorescente verde, dopo la fissazione con paraformaldeide e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte. Utilizzare un microscopio a fluorescenza per quantificare visivamente il numero di cellule endoteliali espanse come dimostrato qui: pozzi con un numero di cellule endoteliali compreso tra due e 50 sono considerati aggregati di cellule endoteliali.I pozzetti con 51-2000 cellule sono eCFC a basso potenziale proliferativo e quelli con 2001 o più cellule sono considerati eCFC ad alto potenziale proliferativo. Dopo il distacco delle cellule con triplo E come in precedenza, ottenere un conteggio di cellule vitali della coltura cellulare mediante emo, citometro e blu di trian. Trasferire 2,4 milioni di cellule vitali in un tubo conico da 50 millilitri, quindi formare il pellet delle cellule mediante centrifugazione mentre le cellule vengono sedimentate.Mescolare accuratamente i componenti della matrice gelatinosa, quindi regolare il pH a 7,4 con idrossido di sodio mantenendo la soluzione sul ghiaccio. Dopo aver eliminato il soprannatante, risospendere il pellet in 360 microlitri di e GM due caldo. Aggiungere quindi 840 microlitri della soluzione di matrice gelatinosa alle cellule e mescolare delicatamente la soluzione finché le cellule non risultano completamente sospese nel gel. Trasferire questa sospensione gelatinosa cellulare di un millilitro in una pozzetta di una piastra per colture cellulari a 12 pozzette e incubare la piastra fino al polimerizzazione del gel.Quindi, prima di incubare durante la notte, coprire delicatamente il gel con due millilitri di EGM-2 tiepido il giorno successivo e immediatamente prima dell'innesto. Utilizzare forbici da iridectomia per dissezionare il gel in due parti uguali e reinserire i pezzi di gel nel medesimo pozzetto di coltura contenente mezzo EGM-2. Dopo aver confermato la sedazione mediante pinzatura del dito del piede, rasare l'addome inferiore di un topo nod, skid anestetizzato di cinque-sei settimane e pulire accuratamente il sito chirurgico alternando dischetti di alcol e betadina.Successivamente, utilizzare forbici iridectomia sterili e affilate per praticare un'incisione di circa cinque millimetri nel quadrante inferiore dell'addome, esponendo lo spazio sottocutaneo tra la pelle e il muscolo addominale. Dissezionare in modo ottuso lo strato dermico dal muscolo addominale in due diverse aree dell'addome per creare tasche larghe da 15 a 20 millimetri, una diretta superiormente verso il quadrante addominale superiore e un'altra in un’altra zona dell'addome. Quindi sollevare il foglio dermico appena adiacente all'incisione.Inserire una metà del gel in una tasca addominale e l'altra metà del gel nell'altra tasca addominale. Dopo aver inserito i gel, chiudere ciascuna incisione con due o tre punti usando suture di polipropilene 5-0 su ago tagliente. Etichettare le schede della gabbia ed eseguire il monitoraggio post-chirurgico e l'analgesia secondo i requisiti istituzionali e del protocollo.Dopo aver sacrificato l'animale al giorno 14 dall'impianto, tamponare l'addome del topo con dischetti alcolici e tagliare la pelle seguendo la linea dell'incisione originale. Successivamente, escindere lembi di pelle nella zona in cui si presume si trovino i gel. Effettuare tagli circolari intorno ai gel per rimuovere ciascun impianto, quindi posizionare gli impianti escissi nel fissativo al zinco.Utilizzando questa tecnica di derivazione delle ECFC, abbiamo osservato la formazione di colonie primarie già dal quinto giorno. Si noti la morfologia a selciato delle colture di ECFC di questo quinto giorno, indicata dalle frecce. Le colonie espanse esprimono antigeni endoteliali, ma non esprimono antigeni ematopoietici.Come mostrato in questa valutazione fenotipica rappresentativa in vitro di cellule endoteliali ed ematopoietiche, l'immunofenotipizzazione ha rivelato che le CFC di origine endoteliale esprimono antigeni endoteliali come CD31, CD34, CD144, CD146, FL1, Flk1, Flt4 e NRP2, ma non esprimono antigeni ematopoietici, come CD45, CD14, CD11b, c-Kit, CXCR4 o CD133. In modo importante, come rappresentato in questo grafico a barre, le colonie espanse mostrano una gerarchia completa di potenziale proliferativo clonale a livello di singola cellula, che va da aggregati di due a 50 cellule fino a colonie di oltre 2001 cellule. Queste microfotografie di colonie colorate con Cyt, un colorante nucleare fluorescente verde, sono state ottenute dopo che le CFC endoteliali derivate da sangue del cordone ombelicale erano state coltivate a livello di singola cellula per 14 giorni.Inoltre, le ECFC formano vasi sanguigni umanizzati che vengono perfusi con globuli rossi dell'ospite quando impiantati in topi immunodeficienti. In questa colorazione ematossilina-eosina di impianti di gel CELLULARIZE contenenti ECFC derivate dal sangue del cordone ombelicale, è possibile osservare microvasi riempiti con globuli rossi dell'ospite formati nel gel di collagene e fibronectina dopo 14 giorni di impianto. Qui, la colorazione in marrone con anticorpo anti-CD31 umano conferma ulteriormente l'origine umana di questi vasi.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare le CFC endoteliali (ECFC) dal sangue del cordone ombelicale umano e di come clonare, espandere e caratterizzare la funzionalità delle colonie di ECFC dopo il loro sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nell'ambito dell'endotelio vascolare per esplorare il potenziale proliferativo clonale e la capacità genica delle cellule endoteliali ottenute da diverse fonti.

phenotypic-functional-characterization-endothelial-colony-forming

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Cellule progenitrici endoteliali formanti colonia (ECFCs) sono uno strumento promettente per studiare l'omeostasi vascolare e la riparazione.

Isolamento e di espansione su vasta scala di umano adulto cellule progenitrici endoteliali che formano colonie

Questo protocollo descrive l'isolamento e la successiva espansione delle cellule stromali mesenchimali e le cellule endoteliali che formano colonie senza l'uso di siero animale per generare le coppie a fini di trapianto autologo sperimentali.

Isolamento e di espansione degli animali siero gratuito di cordone ombelicale umano derivato cellule stromali mesenchimali (MSC) e cellule endoteliali progenitrici formanti colonia (ECFCs)

La colonia di cellule che formano (CFC) test è un test in vitro in cui progenitori emopoietici formare colonie in terreno semisolido. Una combinazione di morfologia delle colonie, la morfologia delle cellule, e citometria a flusso sono utilizzati per valutare la capacità dei progenitori di proliferare e differenziarsi lungo le varie linee ematopoietiche.

Formanti colonia cellulare (CFC) Analisi per cellule emopoietiche

Questo protocollo consente la generazione e la caratterizzazione affidabile di cellule endoteliali di crescita del sangue (BOEC) da un piccolo volume di sangue periferico adulto. Le BOEC possono essere utilizzate come surrogato per le cellule endoteliali di pazienti con disturbi vascolari e come substrato per la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte.

Generazione e Cultura Sangue escrescenza endoteliali cellule da sangue periferico umano

Le cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) derivano da (hemogenic) cellule endoteliali specializzate durante lo sviluppo, ma poco si sa circa il processo attraverso il quale alcune cellule endoteliali specificano a diventare la formazione del sangue. Dimostriamo un metodo basato citometria a flusso che permette l'isolamento simultaneo di cellule endoteliali hemogenic e HSPC da tessuti embrionali murine.

Isolamento di cellule murine embrionali Hemogenic endoteliali

L'obiettivo del presente protocollo è quello di isolare le cellule progenitrici endoteliali da sangue del cordone ombelicale. Alcune delle applicazioni includono l'utilizzo di queste cellule come biomarcatore per identificare i pazienti con rischio cardiovascolare, trattamento delle malattie ischemiche, e costrutti di creazione valvola vascolare e cuore tessutale.

Isolamento di cellule endoteliali progenitrici dal sangue del cordone ombelicale umano

Qui, presentiamo un protocollo per formare con precisione l'endotelio emogenico dalle cellule staminali pluripotenti umane in una condizione senza alimentatore e xeno. Questo metodo avrà ampie applicazioni nella modellazione della malattia e nello screening per i composti terapeutici.

Differenziazione dell'endotelio endogenico dalle cellule staminali pluripotenti umane in una condizione definita senza alimentatore e Xeno

Qui, presentiamo un protocollo per la caratterizzazione immunofenotipica e la differenziazione citochina indotta del sangue cordonale derivato CD34- cellule staminali ematopoietiche e progenitrici ai quattro lignaggi mieloidi. Le applicazioni di questo protocollo includono indagini sull'effetto delle mutazioni della malattia mieloide o di piccole molecole sulla differenziazione mieloide del CD34- cellule.

Differenziazione pan-mieloide del sangue di cordone umano Derivato CD34- Cellule staminali eseminazioni e progenitrici

Il sistema di analisi dell'angiogenesi sferoide di co-cultura tridimensionale è progettato per imitare l'angiogenesi fisiologica. Gli sferoidi della co-coltura sono formati da due precursori di cellule vascolari umane, ECFC e MSC, e incorporati nel gel di collagene. Il nuovo sistema è efficace per valutare i modulatori angiogenici e fornisce informazioni più rilevanti allo studio in vivo.

Sistema di analisi dell'angiogenesi tridimensionale utilizzando Gli spheroidi co-culturali formati da cellule formanti colonia endoteliale e cellule staminali mesenchiche

Presentato qui è un semplice protocollo per la differenziazione diretta delle cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane in circa 1 settimana.

Differenziazione diretta di cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, ...

Caratterizzazione delle cellule endoteliali di escrescenza del sangue (BOEC) dal sangue periferico suino

Scopri come derivare e caratterizzare cellule endoteliali Colony Forming dal sangue del cordone ombelicale umano. Questo metodo consente di valutare il potenziale proliferativo clonale e la capacità di formare vasi sanguigni in vivo.

Caratterizzazione fenotipica e funzionale delle cellule endoteliali Colony Forming derivato dal sangue del cordone ombelicale umano (Video) | JoVE Journal

Caratterizzazione fenotipica e funzionale delle cellule endoteliali Colony Forming derivato dal sangue del cordone ombelicale umano

Esplora altri video