Caratterizzazione fenotipica e funzionale delle cellule endoteliali Colony Forming derivato dal sangue del cordone ombelicale umano

L'obiettivo generale di questa procedura è spiegare come derivare le cellule formanti colonie endoteliali o ed i CFC dal sangue del cordone ombelicale umano. Ciò si ottiene prima placcando le cellule mononucleate dal sangue del cordone ombelicale, e poi clonando ed espandendo le escrescenze delle colonie di E CFC. Il secondo passo consiste nel caratterizzare le cellule in vitro utilizzando una nuova tecnica di saggio a singola cellula per il potenziale proliferativo clonale.

Infine, le cellule sono caratterizzate in un saggio di formazione di vasi in vivo attraverso la produzione e l'impianto di gel contenenti E CFC in topi nod skid. In definitiva, la formazione in vivo di vasi sanguigni riempiti de novo dell'ospite può essere valutata mediante colorazione h ed e dell'ECFC contenente impianti cellulari. Il vantaggio principale di queste tecniche rispetto ai metodi esistenti è che questi metodi consentono l'esame del potenziale proliferativo delle cellule endoteliali a livello di singola cellula.

Le implicazioni di questa tecnica potrebbero essere estese alla ricerca di strumenti diagnostici e terapeutici per malattie come l'arteriopatia selvaggia o PAD, perché questa tecnica ci consente di esaminare il potenziale proliferativo e la capacità genica delle cellule endoteliali di un paziente. Prima di iniziare la procedura, aggiungere un millilitro di collagene di coda di ratto, digitarne uno in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti, quindi incubare la piastra durante la notte del giorno della procedura, aliquotare il sangue del cordone ombelicale in unità da 15 millilitri in provette da centrifuga coniche da 50 millilitri. Quindi aggiungere 20 millilitri di PBS a ciascuna provetta e pipettare la miscela su e giù più volte.

Quindi, aspirare 15 millilitri di fial PA in una pipetta, posizionare la punta della pipetta sul fondo della provetta di sangue diluito e stendere accuratamente la centrifuga alpac, le provette per 30 minuti a 740 volte G a temperatura ambiente senza l'impostazione del freno di decelerazione. Dopo la separazione cellulare, utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere lo strato nebuloso di cellule mononucleate a bassa densità situato all'interfaccia tra il picco fiale e il plasma diluito. Erogare le cellule raccolte in una provetta conica da 50 millilitri contenente 10 millilitri di E GM two medium e pellettare le cellule mononucleate per 10 minuti a 515 volte G a temperatura ambiente con l'impostazione del freno ad alta decelerazione, aspirare con cura e scartare il surnatante.

Quindi, dopo aver lavato le celle pellettate con EGM due volte resus, sospenderle le cellule mononucleate in EGM due a 1,25 volte 10 alla settima cellula per millilitro. Ora pipettare quattro millilitri della sospensione di cellule mononucleate in ciascun pozzetto della piastra rivestita di collagene e incubare le cellule fino a quando non si formano colonie il primo giorno. Dopo l'incubazione, rimuovere lentamente il terreno esaurito dai pozzetti con una pipetta senza disturbare le cellule debolmente aderenti.

Quindi aggiungere con cautela quattro millilitri di E GM two ai pozzetti e rimettere la piastra nell'incubatrice. Le colonie compaiono in genere tra il quinto e il quattordicesimo giorno prima della procedura. A 50 microlitri di collagene di coda di topo.

Digitare uno per ogni pozzetto di una piastra da 96 pozzetti come prima e incubare la piastra durante la notte il giorno della procedura. Iniziare lavando le celle che sono state passate solo due o tre volte due volte con PBS. Dopo aver aspirato il lavaggio finale di PBS, posizionare un cilindro di clonazione sterile rivestito di gel attorno a ciascuna colonia, premendo saldamente ogni cilindro contro la piastra utilizzando una pinza sterile.

Aggiungere due o tre gocce di tripla E express calda in ciascun cilindro di clonazione e incubare i cilindri per tre-cinque minuti fino a quando le cellule iniziano a staccarsi. Dopo che le cellule hanno iniziato a staccarsi a circa 250 microlitri di EGM, due terreni al centro del cilindro e pipettare su e giù per generare una sospensione a singola cellula. Ora trasferisci la sospensione a cella singola da ciascun cilindro di clonazione separatamente in una singola provetta per microcentrifuga.

Infettare le cellule in una piastra a sei pozzetti con lentivirus che esprimono EGFP e raccogliere le cellule che esprimono EGFP mediante citometria fluorescente. Quindi incubare le cellule EEG FP positive e l'EGM due nelle piastre rivestite di collagene. Quando i CFC E sono pronti, raccoglierli utilizzando il trip E express come appena dimostrato e sospendere nuovamente le cellule e GM due mezzi ad una concentrazione finale di circa 10 alla sesta cellula per millilitro.

Quindi, utilizzando un selezionatore a flusso con una bassa velocità di flusso di 20 cellule al secondo, smistare un singolo ECFC positivo EGP per pozzetto nella piastra a 96 pozzetti rivestita di collagene precedentemente preparata, regolare il volume finale di ciascun pozzetto con EGM da due a circa 200 microlitri per pozzetto. Quindi utilizzare un microscopio a fluorescenza invertito per assicurarsi che ogni pozzetto contenga una sola cellula. Incubare la piastra per un periodo di due settimane con due cambi di terreno il giorno 14 di coltura.

Lavare ogni pozzetto con 100 microlitri di PBS prima di fissare le cellule con 100 microlitri di aldeide paraforme al 4% per 30 minuti. Per i CFC che non esprimono EGFP aggiungere il reagente cyt, un colorante nucleare fluorescente verde dopo la fissazione con paraformaldeide e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte. Utilizzare un microscopio a fluorescenza per quantificare visibilmente il numero di cellule endoteliali espanse, come dimostrato qui: i pozzetti con un numero di cellule endoteliali da due a 50 sono considerati cluster di cellule endoteliali.

I pozzetti con 51-2000 cellule sono CFC e a basso potenziale proliferativo e i pozzetti con 2001 o più sono considerati CFC e ad alto potenziale proliferativo. Dopo aver staccato le cellule con tripla E espressa come prima, ottenere una conta cellulare vitale della coltura cellulare mediante emo, citometro e trian blue. Trasferire 2,4 milioni di cellule vitali in una provetta conica da 50 millilitri, quindi pellettare le cellule mediante centrifugazione mentre le cellule vengono centrifugate.

Mescolare accuratamente i componenti della matrice in gel e quindi regolare il pH a 7,4 con idrossido di sodio mantenendo la soluzione in ghiaccio. Dopo aver scartato il surnatante risospendere il pellet in 360 microlitri di caldo e GM due. Quindi aggiungere 840 microlitri della soluzione di matrice in gel alle cellule e mescolare accuratamente la soluzione fino a quando le cellule non sono completamente sospese nel gel Trasferire questa sospensione di gel da un millilitro in un pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti e incubare la piastra fino a quando il gel non polimerizza.

Quindi, prima di incubare durante la notte, coprire delicatamente il gel con due millilitri di EGM caldo due il giorno successivo e immediatamente prima dell'impianto. Usa le forbici dell'iride per sezionare il gel in due pezzi uguali e rimetti i pezzi di gel nella stessa coltura contenente un terreno GM two. Dopo aver confermato la sedazione con un pizzico delle dita dei piedi, radere il basso addome di un bambino di cinque o sei settimane, annuire con un cenno del capo, scivolare sul topo e pulire accuratamente il sito chirurgico ruotando i cuscinetti di alcol e betadine.

Successivamente, utilizzare forbici dell'iride affilate sterili per praticare un'incisione di circa cinque millimetri nel quadrante inferiore dell'addome, esponendo lo spazio sottocutaneo tra la pelle e il muscolo addominale. Spuntato. Sezionare lo strato dermico dal muscolo addominale in due diverse aree dell'addome per creare tasche larghe da 15 a 20 millimetri, una che porta al di sopra del quadrante addominale superiore e una in un'altra area dell'addome. Quindi, sollevando lo strato dermico, basta coccolare l'incisione.

Inserire metà del gel in una tasca addominale nell'altro mezzo pezzo di gel nell'altra tasca addominale. Dopo che i gel sono stati inseriti, chiudere ogni incisione con due o tre punti di sutura utilizzando cinque punti di sutura in polipropilene su un ago da taglio. Etichettare le schede della gabbia ed eseguire il monitoraggio post-chirurgico e l'analgesia secondo i requisiti istituzionali e di protocollo.

Dopo aver sacrificato l'animale il giorno 14 dell'impianto, tamponare l'addome del topo con tamponi imbevuti di alcol e tagliare la pelle coccolata fino alla linea di incisione originale. Quindi asportare lembi di pelle coccolati fino alla probabile posizione dei gel. Taglia circonferenzialmente attorno ai gel per rimuovere ogni impianto, quindi posiziona gli impianti asportati nel fissativo di zinco.

Utilizzando questa tecnica di derivazione ECFC, abbiamo osservato la crescita della formazione di colonie primarie già dal quinto giorno. Si noti la morfologia dei ciottoli di queste cinque culture ECFC come indicato dalle punte di freccia. Le colonie espanse esprimono antigeni endoteliali, ma non esprimono antigeni ematopoietici.

Come mostrato in questa valutazione fenotipica rappresentativa in vitro di cellule endoteliali ed ematopoietiche, l'immunofenotipizzazione ha rivelato che i CFC esprimono antigeni endoteliali come CD 31, CD 34, CD 1 44, CD 1 46, FL one, flick one, flip four e NRP two, ma non esprimono antigeni ematopoietici, CD 45 CD 14, CD 11 BC Kit CXCR four o CD 1 33. È importante sottolineare che, come rappresentato in questo grafico a barre, le colonie espanse mostrano una gerarchia completa del potenziale proliferativo clonale a livello di singola cellula che va da cluster di due a 50 cellule fino a colonie superiori a 2001. Queste micrografie di colonie colorate con cyt, un colorante nucleare fluorescente verde, sono state ottenute dopo che i CFC E derivati dal sangue del cordone ombelicale sono stati coltivati a livello di singola cellula per 14 giorni.

Inoltre, gli e CFC formano vasi sanguigni umanizzati che vengono perfusi con i globuli rossi dell'ospite quando impiantati in topi immunodeficienti. In questa colorazione h ed e di ECFC derivato dal sangue del cordone ombelicale contenente impianti di gel CELLULARIZE, si possono osservare microvasi riempiti con globuli rossi dell'ospite che si sono formati nel gel di collagene fibronectina dopo 14 giorni dall'impianto. Qui, la colorazione anti-umana CD 31 in marrone conferma ulteriormente l'origine umana di questi vasi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come derivare i CFC dal sangue del cordone ombelicale umano e di come clonare, espandere e caratterizzare la funzionalità delle colonie di ECFC dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori dell'endotelio vascolare per esplorare il potenziale proliferativo clonale endoteliale e la capacità genica delle cellule endoteliali ottenute da più fonti.