Caratterizzazione fenotipica e funzionale delle cellule endoteliali Colony Forming derivato dal sangue del cordone ombelicale umano

L'obiettivo generale di questa procedura è spiegare come ottenere cellule formanti colonie endoteliali, o eCFC, dal sangue del cordone ombelicale umano. Questo risultato si ottiene innanzitutto seminando cellule mononucleate provenienti dal sangue del cordone ombelicale e successivamente clonando ed espandendo le colonie derivanti da eCFC. Il secondo passaggio consiste nel caratterizzare le cellule in vitro utilizzando una nuova tecnica di saggio monocellulare per valutare il potenziale proliferativo clonale.

Infine, le cellule vengono caratterizzate mediante un saggio di formazione di vasi in vivo attraverso la produzione e l'impianto di idrogeli contenenti E CFC in topi nod skid. In definitiva, la formazione in vivo di nuovi vasi sanguigni riempiti da sangue dell'ospite può essere valutata mediante colorazione ematossilina ed eosina (h e) degli impianti cellulari contenenti ECFC. Il vantaggio principale di queste tecniche rispetto ai metodi esistenti è che consentono l'esame del potenziale proliferativo delle cellule endoteliali a livello di singola cellula.

Le implicazioni di questa tecnica potrebbero estendersi alla ricerca di strumenti diagnostici e terapeutici per malattie come la malattia arteriosa periferica o PAD, poiché questa tecnica ci consente di esaminare il potenziale proliferativo e la capacità genica delle cellule endoteliali di un paziente. Prima di iniziare la procedura, aggiungere un millilitro di collagene di coda di ratto, di tipo uno, in ciascun pozzetto di una piastra per colture cellulari a sei pozzetti e quindi incubare la piastra tutta la notte. Nel giorno della procedura, aliquotare il sangue del cordone in unità da 15 millilitri in provette coniche da centrifuga da 50 millilitri. Successivamente, aggiungere 20 millilitri di PBS a ciascuna provetta e aspirare e rilasciare la miscela su e giù per diverse volte mediante pipetta.

Successivamente, aspirare 15 millilitri di fial PA in una pipetta, posizionare la punta della pipetta sul fondo del tubo contenente il sangue diluito e stratificare delicatamente sotto il fial PA. Centrifugare i tubi per 30 minuti a 740 × g a temperatura ambiente senza impostare la frenata in decelerazione. Dopo la separazione cellulare, utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere lo strato torbido di cellule mononucleate a bassa densità localizzato all'interfaccia tra il fial PA e il plasma diluito. Distribuire le cellule raccolte in un tubo conico da 50 millilitri contenente 10 millilitri di mezzo E GM due e centrifugare le cellule mononucleate per 10 minuti a 515 × g a temperatura ambiente con l'impostazione di frenata in decelerazione alta; aspirare e scartare con attenzione il sopranatante.

Successivamente, dopo aver lavato due volte le cellule pellettizzate con EGM2, sospendere le cellule mononucleate in EGM2 a una concentrazione di 1,25 × 10⁷ cellule per millilitro. Ora pipettare quattro millilitri della sospensione di cellule mononucleate in ogni pozzetto della piastra rivestita con collagene e incubare le cellule fino alla formazione di colonie nel primo giorno. Dopo l'incubazione, rimuovere lentamente il mezzo usato dai pozzetti mediante pipetta, senza disturbare le cellule debolmente aderenti.

Quindi aggiungere con attenzione quattro millilitri di E GM due alle pozzette e reinserire la piastra nell'incubatore. Le colonie compaiono tipicamente tra il quinto e il quattordicesimo giorno, il giorno precedente la procedura. A 50 microlitri di collagene di coda di ratto.

Aggiungere un tipo per ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti come in precedenza e incubare la piastra tutta la notte nel giorno della procedura. Iniziare lavando le cellule, che sono state passaggiate solo due o tre volte, due volte con PBS. Dopo aver aspirato l'ultimo lavaggio con PBS, posizionare un cilindro di clonaggio sterile rivestito di gel attorno a ciascuna colonia, premendo saldamente ogni cilindro contro la piastra mediante pinze sterili.

Aggiungere due o tre gocce di triple E express caldo in ogni cilindro di clonaggio e incubare i cilindri per tre-cinque minuti fino a quando le cellule iniziano a staccarsi. Dopo che le cellule hanno iniziato a staccarsi, aggiungere circa 250 microlitri di mezzo EGM due al centro del cilindro ed eseguire pipettaggi ripetuti verso l'alto e verso il basso per ottenere una sospensione di cellule singole. Trasferire ora separatamente la sospensione di cellule singole da ciascun cilindro di clonaggio in una provetta microcentrifuga individuale.

Infettare le cellule in una piastra a sei pozzetti con lentivirus esprimenti EGFP e raccogliere le cellule che esprimono EGFP mediante citometria a fluorescenza. Successivamente, incubare le cellule positive per EGFP ed EGM due in piastre rivestite con collagene. Quando le E CFC sono pronte, raccoglierle utilizzando tripE express come appena dimostrato e risospendere le cellule nel mezzo e GM due a una concentrazione finale di circa 10 alla sesta cellule per millilitro.

Quindi, utilizzando un citofluorimetro con un flusso ridotto di 20 cellule al secondo, separare una singola ECFC positiva per EGP per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti rivestita con collagene preparata in precedenza; regolare il volume finale di ciascun pozzetto con EGM-2 fino a circa 200 microlitri per pozzetto. Successivamente, utilizzare un microscopio a fluorescenza invertito per verificare che ogni pozzetto contenga una sola cellula. Incubare la piastra per un periodo di due settimane, con due cambi di mezzo al giorno 14 della coltura.

Lavare ogni pozzetto con 100 microlitri di PBS prima di fissare le cellule con 100 microlitri di paraformaldeide al 4% per 30 minuti. Per le CFC che non esprimono EGFP, aggiungere il reagente cit, un colorante nucleare fluorescente verde, dopo la fissazione con paraformaldeide e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte. Utilizzare un microscopio a fluorescenza per quantificare visivamente il numero di cellule endoteliali espanse come dimostrato qui: pozzi con un numero di cellule endoteliali compreso tra due e 50 sono considerati aggregati di cellule endoteliali.

I pozzetti con 51-2000 cellule sono eCFC a basso potenziale proliferativo e quelli con 2001 o più cellule sono considerati eCFC ad alto potenziale proliferativo. Dopo il distacco delle cellule con triplo E come in precedenza, ottenere un conteggio di cellule vitali della coltura cellulare mediante emo, citometro e blu di trian. Trasferire 2,4 milioni di cellule vitali in un tubo conico da 50 millilitri, quindi formare il pellet delle cellule mediante centrifugazione mentre le cellule vengono sedimentate.

Mescolare accuratamente i componenti della matrice gelatinosa, quindi regolare il pH a 7,4 con idrossido di sodio mantenendo la soluzione sul ghiaccio. Dopo aver eliminato il soprannatante, risospendere il pellet in 360 microlitri di e GM due caldo. Aggiungere quindi 840 microlitri della soluzione di matrice gelatinosa alle cellule e mescolare delicatamente la soluzione finché le cellule non risultano completamente sospese nel gel. Trasferire questa sospensione gelatinosa cellulare di un millilitro in una pozzetta di una piastra per colture cellulari a 12 pozzette e incubare la piastra fino al polimerizzazione del gel.

Quindi, prima di incubare durante la notte, coprire delicatamente il gel con due millilitri di EGM-2 tiepido il giorno successivo e immediatamente prima dell'innesto. Utilizzare forbici da iridectomia per dissezionare il gel in due parti uguali e reinserire i pezzi di gel nel medesimo pozzetto di coltura contenente mezzo EGM-2. Dopo aver confermato la sedazione mediante pinzatura del dito del piede, rasare l'addome inferiore di un topo nod, skid anestetizzato di cinque-sei settimane e pulire accuratamente il sito chirurgico alternando dischetti di alcol e betadina.

Successivamente, utilizzare forbici iridectomia sterili e affilate per praticare un'incisione di circa cinque millimetri nel quadrante inferiore dell'addome, esponendo lo spazio sottocutaneo tra la pelle e il muscolo addominale. Dissezionare in modo ottuso lo strato dermico dal muscolo addominale in due diverse aree dell'addome per creare tasche larghe da 15 a 20 millimetri, una diretta superiormente verso il quadrante addominale superiore e un'altra in un’altra zona dell'addome. Quindi sollevare il foglio dermico appena adiacente all'incisione.

Inserire una metà del gel in una tasca addominale e l'altra metà del gel nell'altra tasca addominale. Dopo aver inserito i gel, chiudere ciascuna incisione con due o tre punti usando suture di polipropilene 5-0 su ago tagliente. Etichettare le schede della gabbia ed eseguire il monitoraggio post-chirurgico e l'analgesia secondo i requisiti istituzionali e del protocollo.

Dopo aver sacrificato l'animale al giorno 14 dall'impianto, tamponare l'addome del topo con dischetti alcolici e tagliare la pelle seguendo la linea dell'incisione originale. Successivamente, escindere lembi di pelle nella zona in cui si presume si trovino i gel. Effettuare tagli circolari intorno ai gel per rimuovere ciascun impianto, quindi posizionare gli impianti escissi nel fissativo al zinco.

Utilizzando questa tecnica di derivazione delle ECFC, abbiamo osservato la formazione di colonie primarie già dal quinto giorno. Si noti la morfologia a selciato delle colture di ECFC di questo quinto giorno, indicata dalle frecce. Le colonie espanse esprimono antigeni endoteliali, ma non esprimono antigeni ematopoietici.

Come mostrato in questa valutazione fenotipica rappresentativa in vitro di cellule endoteliali ed ematopoietiche, l'immunofenotipizzazione ha rivelato che le CFC di origine endoteliale esprimono antigeni endoteliali come CD31, CD34, CD144, CD146, FL1, Flk1, Flt4 e NRP2, ma non esprimono antigeni ematopoietici, come CD45, CD14, CD11b, c-Kit, CXCR4 o CD133. In modo importante, come rappresentato in questo grafico a barre, le colonie espanse mostrano una gerarchia completa di potenziale proliferativo clonale a livello di singola cellula, che va da aggregati di due a 50 cellule fino a colonie di oltre 2001 cellule. Queste microfotografie di colonie colorate con Cyt, un colorante nucleare fluorescente verde, sono state ottenute dopo che le CFC endoteliali derivate da sangue del cordone ombelicale erano state coltivate a livello di singola cellula per 14 giorni.

Inoltre, le ECFC formano vasi sanguigni umanizzati che vengono perfusi con globuli rossi dell'ospite quando impiantati in topi immunodeficienti. In questa colorazione ematossilina-eosina di impianti di gel CELLULARIZE contenenti ECFC derivate dal sangue del cordone ombelicale, è possibile osservare microvasi riempiti con globuli rossi dell'ospite formati nel gel di collagene e fibronectina dopo 14 giorni di impianto. Qui, la colorazione in marrone con anticorpo anti-CD31 umano conferma ulteriormente l'origine umana di questi vasi.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare le CFC endoteliali (ECFC) dal sangue del cordone ombelicale umano e di come clonare, espandere e caratterizzare la funzionalità delle colonie di ECFC dopo il loro sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nell'ambito dell'endotelio vascolare per esplorare il potenziale proliferativo clonale e la capacità genica delle cellule endoteliali ottenute da diverse fonti.