Name: On-Chip Isotachophoresis per separazione degli ioni e purificazione di acidi nucleici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Scopri l'isotachoforesi su chip per la separazione ionica e la purificazione di acidi nucleici. Questa tecnica elettrocinetica consente la preconcentrazione di analiti e l'estrazione selettiva di DNA e RNA.

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Riconosciamo con gratitudine finanziamenti da DARPA sponsorizzato Micro / Nano di messa a fuoco Fluidics Fundamentals (MF3) Centro con il contratto numero N66001-10-1-4003, e dal DARPA concessione N660001-09-C-2082.

1. Fisica della ITP ITP forma un confine netto in movimento tra ioni di carica simile. La tecnica può essere eseguita con campioni anionici o cationici, ma adattiamo questa introduzione alla ITP anionico e annotare gli stessi principi si applicano a ITP cationico. Abbiamo scelto buffer LE e TE LE tali che gli ioni hanno una maggiore mobilità effettiva grandezza elettroforetica. La mobilità elettroforetica efficace, μ = U / E, è la costante di proporzionalità tra campo elettrico applicato, E, e velocità di deriva ione, U. 13 Noi costituire un&#39;interfaccia diffusa tra il LE e TE e applicare un campo elettrico diretto dal alta conduttività LE zona a bassa conducibilità TE zona. Il sistema prevede rapidamente un forte gradiente di campo elettrico all&#39;interfaccia ITP, a causa della non uniforme profilo conducibilità. Come per il suo nome (dal greco &quot;isos&quot; significa &quot;uguale&quot;, &quot;takhos&quot; significa &quot;velocità&quot;), e TE LE viaggio ioni allo stesso tempo, ve uniformelocity, come conseguenza della non-uniforme campo elettrico e la conservazione di corrente (questo è il cosiddetto &quot;condizione di ITP&quot;, vedi Figura 1). L&#39;interfaccia ITP è autoaffilante: LE ioni che diffondono nell&#39;esperienza TE zona un flusso forte restauro e ritorno nella zona di attacco (e viceversa per gli ioni TE nella zona LE). Esempi di ioni a fuoco questa interfaccia se la loro mobilità efficace nella zona TE è maggiore di quelle dei TE co-ioni, e se la loro mobilità efficace nella zona LE è inferiore a quella dei co-ioni LE (vedi Figura 1). L&#39;auto-affilatura e concentrarsi proprietà di ITP contribuiscono alla robustezza di questa tecnica e rendere ITP relativamente insensibili ai disturbi di interfaccia (ad esempio a causa della pressione-driven flow o cambiamenti nella geometria, come contrazioni, espansioni, e si trasforma). In modalità di picco ITP (vedi Figura 2a e Video 1-2), concentrazioni di ioni del campione sonosempre significativamente inferiore LE e TE concentrazioni di ioni e quindi contribuire trascurabile conducibilità locale. La distribuzione di ioni del campione è determinata dalla interfaccia autoaffilante tra zone adiacenti (qui il TE e LE) e il valore della mobilità campione efficace rispetto a queste zone. 14 ioni del campione più concentrarsi nella stessa regione stretta interfaccia ITP come ampiamente sovrapposizione di picchi. Le larghezze di interfaccia e di picco, così come il fattore preconcentrazione associato, scala inversamente con la corrente applicata (vedi esperimenti in Figura 2b). 14 Per sufficientemente alte concentrazioni del campione iniziale e il tempo di accumulo sufficiente, ioni del campione raggiunge un valore di concentrazione di soglia. Per completamente ionizzati specie, tale valore è determinato dalla funzione di regolazione Kohlrausch (KRF). 15 Per elettroliti deboli, è determinata dalle funzioni Alberty e Jovin. 16,17 In plateaumodalità, come illustrato in figura 3 e Video 3, ioni del campione separare e purificare in zone di concentrazione localmente uniforme e costante in un ordine determinato dalla loro effettiva mobilità. Ioni molto diluite può concentrarsi ancora in modalità di picco tra le zone di plateau. In ITP, ioni del campione può essere introdotto in una iniezione finito tra la TE e LE (vedi figura 3) o alternativamente mescolato con il TE e / o LE (vedi Figura 2). Ci riferiamo alla miscelazione nella zona TE come iniezione &quot;semi-infinito&quot;, che può essere utilizzata per accumulare ioni analita continuo. Accumulo di campione continuo aumenta la sensibilità sia in modalità di picco e saggi di plateau. Tuttavia, le iniezioni finiti sono più comuni in modalità plateau. Ciò è probabilmente perché alte concentrazioni di analiti iniziali semi-infinito iniezione può aumentare notevolmente la conducibilità TE e minori tassi di messa a fuoco. Inoltre, la purificazione completa non è possibile in semi-infinita di iniezione (poiché non vi remains una concentrazione finito in TE). 2. Dispositivo di pulizia e preparazione Per i saggi presentati in questo protocollo usiamo isotropicamente wet-inciso (sezione trasversale approssimativamente a forma di D) chip vetro microfluidici con cross-channel disegno (vedi Figura 1). La pulizia e la seguente protocollo di preparazione è ottimizzato per i canali di silice borosilicato e fuso, ma può anche essere utilizzata con vetro / PDMS chip. Eseguire questa procedura di pulizia prima di esperimenti per garantire run-to-run ripetibilità e la corretta applicazione di rivestimenti dinamici necessari per sopprimere flusso elettroosmotico (EOF). L&#39;omissione di questo protocollo può causare una forte dispersione di interfaccia ITP 14. <ol><li> Per decontaminare il canale, riempire la Nord, Est, Sud e serbatoi con il 10-20 microlitri di candeggina al 10%, applicare il vuoto nel serbatoio Occidente per 2 min. Se si utilizza uno standard Pinza chip di caddy, il vuoto può essere efficacemente applicato semplicemente attaching l&#39;estremità larga di una microlitri 200 (filtrato) punta della pipetta al serbatoio chip e collegando la linea di vuoto ad un tubo di 2 mm di diametro interno. </li><li> Svuotare i serbatoi e risciacquare il canale (come nel passaggio 1) con idrossido di sodio 1 M per 2 min. Questo incide delicatamente le pareti del canale, ottenendo una superficie pulita borosilicato per aiutare a stabilire proprietà di superficie uniformi. </li><li> Svuotare i serbatoi e pulito con acqua deionizzata (DI), quindi sciacquare il canale con LE per ~ 2 min. Durante questo periodo le proprietà superficiali e rivestimenti dinamici equilibrate all&#39;interno del canale. </li></ol> 3. Fluoroforo messa a fuoco in modalità di picco ITP <ol><li> Preparare 1 mL LE costituito da 100 mM HCl, 200 mM tris, e 1% PVP. </li><li> Preparare 1 mL TE costituito da HEPES 100 mM e 200 mM di tris. Unire 90 microlitri di TE con 10 microlitri di 1 pM Alexa Fluor 488 (AF488). </li><li> Dopo aver sciacquato con LE come descritto nella parte 2, svuotare il serbatoio Occidente e pulire un paio di volte con DI oder per diluire qualsiasi LE rimanente nel serbatoio. Riempire questo serbatoio con 20 microlitri TE contenente AF488. </li><li> Posizionare l&#39;elettrodo positivo nel bacino orientale e la terra (negativo) elettrodo nel serbatoio Occidente e applicare 2 μA (corrente costante). Il picco campione migreranno ad una velocità costante dal serbatoio al serbatoio Ovest-Est (vedi figura 1) e la tensione tra questi serbatoi aumenterà come minore è la conducibilità TE riempie il canale. </li></ol> 4. Estrazione e purificazione di acidi nucleici da coltivate E. coli La capacità di concentrarsi selettivamente specie ioniche rende ITP una tecnica ideale per la preparazione del campione biologico. Abbiamo purificare acidi nucleici da lisato cellulare trattato selezionando un anione posteriore con una grandezza inferiore mobilità efficace l&#39;acido nucleico bersaglio, ma superiore a co-ionici inibitori della PCR (ad esempio detergenti anionici, proteine, e solventi organici, anche se presente in hiconcentrazione di gh). Cationico PCR inibitori (ad esempio metalli alcalini e proteine ​​cationiche e detergenti) migrano nella direzione opposta e così sono anche lasciato. ITP estrae e si concentra acidi nucleici bersaglio dal serbatoio del campione, lasciando più lenti PCR-inibitori specie dietro (vedi Figura 4). <ol><li> Ottenere un campione di cultura o di E. coli ad una densità superiore a 10 8 UFC / ml. </li><li> Trasferire 1 ml di coltura cellulare in una cassetta di sicurezza-lock provetta e pellet per centrifugazione a 4000g per 6 min. </li><li> Risospendere il pellet in 80 microlitri acqua priva di RNasi e aggiungere 10 ul di agente di lisi consistente di tricina 10 mM, 10 mM tris-bis, 2 mM EDTA, 0,1% Triton-X, e 5 mg / ml lisozima. Mescolare delicatamente e incubare per 5 minuti. a temperatura ambiente (protocollo adattato da lisi Bercovici et al. 11). </li><li> Aggiungere 10 pl di idrossido di sodio 1 M per portare il pH lisato di ~ 12,5. Azionare delicatamente la pipetta su e giù finola soluzione diventa limpida, in cui lisi punto è completa. </li><li> Combinare 10 pl di lisato con 90 pl di tricina 50 mM e 100 mM bis-tris. Questa soluzione può essere utilizzato come TE. </li><li> Preparare 1 mL di LE consiste di 500 mM bis-tris, HCl 250 mM, 1% di PVP, e 1X SYBR Green II. Riempire il chip microfluidica con LE come descritto nella parte 3. </li><li> Per estrarre l&#39;acido nucleico purificato per analisi off-chip dopo ITP, sostituire il contenuto del serbatoio Oriente con un PCR-compatibile LE contenente 50 mM bis-tris, HCl 25 mM, e 0,1% di PVP. Applicare 1000 V tra Oriente e Occidente pozzi per iniziare l&#39;esperimento. La corrente tra questi serbatoi diminuirà. </li><li> Al termine dell&#39;esperimento il campione eluisce nel serbatoio LE. In coincidenza con questo eluizione, il tempo contro corrente per questo sistema raggiunge tipicamente un valore di plateau (perché la resistenza è ora dominato da ioni TE uniformemente distribuiti nel canale). Mescolare delicatamente il serbatoiocontenuto di pipettaggio ripetuto ed estrarre un volume di 5 microlitri per analisi mediante RT-PCR quantitativa. </li></ol> 5. Separazione di amminoacidi con ITP cationico modalità plateau e non-focalizzazione tracciante (NFT) per la visualizzazione ITP possono essere utilizzati per separare e concentrare piccoli ioni in altipiani adiacente e rilevabile tra la TE e LE. Ciò consente la rilevazione e l&#39;identificazione sulla base delle proprietà fisico, come conducibilità locale, assorbanza UV, rilevamento della temperatura, o indice di rifrazione. Qui mostriamo un non-focalizzazione tracciante (NFT) test dove viene aggiunta una fluorescente, co-ionico specie al LE. Questa specie fluorescenti non si concentra, ma la sua concentrazione adatta ad un campo elettrico locale, rendendo così possibile la visualizzazione delle zone di plateau purificati (vedi figura 5). <ol><li> Preparare 1 mL LE costituito da etanolammina 100 mM, 200 mM tricina, e 1% di PVP, e 100 pM di 6G cationico Rodamina fluoroforo. </li> &lt;li&gt; Preparare 1 mL TE costituito da 20 mM Tris, 40 mM tricina. Preparare campioni miscelando 90 pl di TE con 10 pl ciascuno di 50 mM di arginina e lisina 50 mM. </li><li> Dispensare 20 LE ul in Occidente e serbatoi Nord e campione nel serbatoio Oriente. Applicare il vuoto al serbatoio del Sud per 1 min. </li><li> Sciacquare bene con l&#39;Oriente e sostituirlo con DI TE (TE senza campione). </li><li> Applicare 500 V tra Oriente e Occidente serbatoi. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Noi mostriamo isotachopherograms di esperimenti modalità di picco in figura 2b e esperimenti estrazione dell&#39;acido nucleico in figura 4. In esperimenti modalità di picco con un reporter fluorescente (es. AF488, SYBR Green II), l&#39;intensità globale fluorescenza possono essere integrati e confrontati con una curva di taratura per ottenere informazioni quantitative concentrazione. 12 Inoltre, in esperimenti di estrazione degli acidi nucleici, campione è consentito eluire in tegli LE serbatoio ed estratta con una pipetta per l&#39;analisi mediante RT-PCR quantitativa. 10,12 Mostriamo isotachopherograms modalità plateau di separazione amminoacido in figura 5. Intensità di fluorescenza (rispetto alla LE o TE intensità zona) può essere utilizzato per l&#39;identificazione di zona, mentre le larghezze zona di abilitazione quantificazione. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig1.jpg" /> Figura 1. Isotachophoresis (ITP) è una tecnica elettrocinetico utilizzata in applicazioni microfluidiche per una rivelazione sensibile e la separazione di ioni. ITP offre separazione, messa a fuoco selettiva, e capacità di preconcentrazione. Inoltre, è estremamente robusta e insensibile ai disturbi fisici causa della sua natura autoaffilante. Esempi di ioni selettivamente concentrarsi tra un elettrolita leader (LE) e finali (TE) e viaggiano attraverso il microcanale ad una velocità costante determinata dalla velocità degli ioni principali nella zona LE. Esempi di ioniconcentrarsi se la loro mobilità effettiva per elettroforesi è racchiuso tra l&#39;effettiva mobilità degli ioni e TE LE. Lo schema rappresenta un esperimento ITP modello in cui campione si concentra continuamente tra la LE e le zone TE. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig2.jpg" /> Figura 2. Diluire il campione in ioni di messa a fuoco &quot;picco modalità&quot; ITP. a) due distinti diluito (c campione &lt;&lt; LE c) messa a fuoco specie in modalità di picco a livello di interfaccia formata tra la LE e le zone TE. Solamente il LE e TE determinare il campo elettrico, come specie di esempio non contribuiscono in maniera significativa corrente. Ioni del campione sono mescolati con TE (in un semi-iniezione infinito) e si concentrano insieme in un picco approssimativamente gaussiana all&#39;interfaccia ITP. Messa a fuoco criterio (indicato come disuguaglianze) si applica a specie fortemente ionizzati. b) Gli esperimenti mostrano Alexa Fluor 488 (AF488) si è concentrato in modalità di picco per una serie di correnti applicate (vedi anche Video 1). Picco larghezza del campione è inversamente proporzionale alla corrente (per trascurabile dispersione advective causa flusso elettroosmotico). 14 L&#39;interfaccia autoaffilante è resistente alla dispersione a causa della pressione-driven flusso (vedere Video 2). <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig3.jpg" /> Figura 3. Ioni di campione ad una concentrazione sufficientemente elevata attenzione in modalità &quot;plateau&quot; e governare conducibilità locale. Noi di solito introdurre ioni del campione in una iniezione finita tra la TE e LE. In questa modalità, gli ioni del campione separato e ordine in base alla loro mobilità elettroforetica efficace (vedi Video 3). Per specie fortemente ionizzato, il TE e plateau concentrazioni zone sono determinate dalla funzione di regolazione Kohlrausch (KRF, un insieme invariante inizialmente dalla zona LE). Diluire ioni continuerà a concentrarsi in modo picco tra bracketing plateau zone la loro mobilità efficace. Messa a fuoco criterion (mostrato come le disuguaglianze) si applica a specie fortemente ionizzati. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig4.jpg" /> Figura 4. LISATO preparazione e estrazione degli acidi nucleici con ITP modalità di picco. L&#39;acido nucleico viene estratto da E. coli coltura cellulare utilizzando il lisozima assistita lisi alcalina e purificato da elettroforetica messa a fuoco selettiva via ITP. TE miscelato con lisato (marrone) contiene acido nucleico bersaglio (verde), proteine, e potenziali inibitori PCR-chimiche. Selezione appropriata di finale e che porta gli ioni permette di messa a fuoco selettiva di acido nucleico bersaglio, lasciando dietro di inibitori della PCR. Totale picco dell&#39;acido nucleico ITP assume spesso un non-forma ideale, come mostrato nell&#39;immagine qui incasso. Come dimostrazione di questo test, abbiamo estratto totale di acido nucleico da batteri gram-negativi, Escherichia coli (lisati con una soluzione di idrossido di sodio da solo), purificato dal lisato NA utilizzando ITP, raccoltiestratto il materiale genetico, ed eseguito RT-PCR analisi per verificare la purificazione successo di 16S rRNA (rosso) e 16S rDNA (verde) da coltura batterica. Negativi cicli di controllo soglia per 16S rRNA (blu) e 16S rDNA (giallo) sono stati sopra ogni 30 cicli. Abbiamo eseguito qRT-PCR utilizzando la tecnologia Power SYBR Green RNA-to-C T 1-Step Kit da Applied Biosystems con 150 nM in avanti (5&#39;-CGGATTGGAGTCTGCAACTCG) e inversa (5&#39;-CACAAAGTGGTAAG CGCCCTC) primer, alle condizioni raccomandate cicli termici. <img alt="Figura 5." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig5.jpg" /> Figura 5. Non-focalizzazione tracciante (NFT) saggio per la separazione e rivelazione di amminoacidi non marcati. a) Schema del saggio NFT. Una iniezione finito di ioni del campione viene introdotta nel canale Oriente. Noi mescolare il LE con un fluoroforo tracciante cationico con una mobilità effettiva inferiore a quella degli ioni TE (tracciante μ &lt;μ TE). Il fluoroforosi dice che agisce come &quot;tracer underspeeding&quot;. Come il fluoroforo electromigrates dal LE in zone oggi occupate da altipiani campione e TE, sperimenta un campo elettrico maggiore e quindi aumenta la sua concentrazione. Questo cambiamento nella concentrazione crea passi nella isotachopherogram. b) separazione di due aminoacidi, arginina e lisina, utilizzando il saggio NFT con 6G rodammina come tracciante fluorescente underspeeding. Il picco leggera tra TE e arginina è comune in ITP, non è ben compreso, e qui non interferisce con il rilevamento o quantificare gli altipiani. Movie supplementare 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie1.mpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare il filmato supplementare</a> . Movie supplementare 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie2.mpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare il filmato supplementare</a> . Movie supplementare 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie3.mpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare il filmato supplementare</a> .

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</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

I metodi di ITP qui presentati consentono la rilevazione rapida, sensibile e robusto e la manipolazione di molecole ioniche. La sfida principale con ITP è la scelta corretta di buffer LE e TE. In ITP anionico, si scelgono tipicamente cloruro come anione principale perché è un acido forte con elevata mobilità assoluto e quindi ha proprietà molto prevedibili. Pertanto, la scelta buffer in anionica ITP è tipicamente ridotto a scegliere un vero e proprio TE e controione. Per gli esperimenti di messa a fuoco selettiva, la scelta TE è fondamentale per l&#39;esclusione di contaminare ioni. Nelle applicazioni in cui i contaminanti non sono presenti, in basso la mobilità TE efficace conduce a una più rapida velocità di messa a fuoco. Si consiglia di utilizzare i seguenti, relativamente ben educati anionici ioni TE: MES, MOPS, HEPES, tricina. Scelta del controione influenza sia il pH del sistema e della mobilità TE efficace. Controioni comuni sono tris (pKa 8,1) e bis-tris (pKa 6,4). Per i test che richiedono un pH inferiore o superiore, si consiglia di piridina (pKa 5,25) eetanolammina (pKa 9,5), rispettivamente. Nelle tabelle 1 e 2, per ITP anionici e cationici, rispettivamente, riassumiamo alcuni esempi buffer utili. Prendiamo HCl come ione LE anionico e sodio come cationico LE ioni e non assumiamo 100 mM forza ionica del tampone LE. Il lettore noterà che la forza ionica tampone nei nostri protocolli (e nelle tabelle 1-2) è sempre maggiore o uguale a 10 mM. Mentre in teoria fisica di ITP vale a forza ionica inferiore a 10 mM, contaminanti naturali (ad esempio acido carbonico dalla reazione tra acqua e anidride carbonica atmosferica) vicino al livello 1 mM spesso limitano l&#39;uso pratico di buffer a bassa forza ionica. Notiamo che meccanismo di trasduzione del segnale non è limitato ai saggi presentati in questo protocollo. Come discusso brevemente nella parte 5, in modalità plateau purificato zone può essere rilevata tramite variazioni di conducibilità locale, assorbitori UVBance, temperatura, o di un indice di rifrazione. Nel nostro gruppo, abbiamo sviluppato un metodo che utilizza anfoliti portanti fluorescenti sensibili per la diagnosi e l&#39;identificazione di analiti sconosciuti. 5 In esperimenti modalità di picco, sonde specifiche possono essere usati per etichettare analiti focalizzati. In un esempio, usiamo segnali molecolari - sonde oligonucleotidiche che reagiscono al momento ibridazione per la loro sequenza bersaglio - per rilevare il DNA bersaglio o molecole di RNA con elevata specificità 11,18. Mentre ITP è relativamente robusto per dispersione causata dalla pressione-driven flusso e EOF, EOF eccessiva può portare ad una stagnazione del ITP, dove la velocità media EOF diventa uguale alla velocità ITP. 14 EOF Tale forte si verifica soprattutto in condizioni di pH elevato e bassa forza ionica. Per questo motivo, si consiglia l&#39;uso di tamponi con pH 8 o inferiore e con forza ionica dell&#39;ordine di 100 mm, se conveniente. Nella nostra esperienza, è il PVPrivestimento più efficace per la soppressione EOF in chips borosilicato. Tuttavia, a causa delle sue proprietà di setacciatura, PVP non può essere appropriato per alcune applicazioni, come focalizzazione DNA genomico. Negli esperimenti, si osserva che l&#39;aggiunta di PVP può ridurre notevolmente la mobilità DNA genomico assoluto (al punto in cui non si concentra). In questi casi, un rivestimento silanolo come Sigmacote in congiunzione con un tensioattivo (per esempio Triton X-100) può anche essere efficace nel ridurre EOF 10. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TE anione (pKa -1) </td></tr><tr><td> Controione Buffering (pKa +1) </td><td> MES (6.10) </td><td> MOPS (7,20) </td><td> HEPES (7.50) </td><td> tricina (8.15) </td></tr><tr><td> etanolammina (9,50) </td><td> 21,41 </td><td> 20,40 </td><td> 17,38 </td><td> 22,85 </td></tr><tr><td> tris (8,08) </td><td> 21,00 </td><td> 19,23 &lt;/ Td&gt; <td> 15,84 </td><td> 17,56 </td></tr><tr><td> bis-tris (6.40) </td><td> 18,22 </td><td> 10,41 </td><td> 7,30 </td><td> 5,23 </td></tr><tr><td> piridina (5.18) </td><td> 1,01 </td><td> 3,72 </td><td> 2,42 </td><td> 1,48 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Mobilità grandezza effettiva (× 10 -9 m 2 / V / s) della zona aggiustato analita puro ITP anionica in cui il LE è HCl 100 mM e 200 mM tampone controione. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TE zione (pKa +1) </td></tr><tr><td> Controione Buffering (pKa -1) </td><td> etanolammina (9,50) </td><td> tris (8,08) </td><td> bis-tris (6.40) </td><td> piridina (5.18) </td></tr><tr><td> MES (6.10) </td><td> 35,57 </td><td> 21,96 </td><td> 16,39 </td><td> 10,45 </td></tr><tr><td> MOPS (7.20) </td><td> 35,47 </td><td> 20,92 </td><td> 9,76 </td><td> 3,93 </td></tr><tr><td> HEPES (7.50) </td><td> 35,35 </td><td> 19,97 </td><td> 7,77 </td><td> 2,88 </td></tr><tr><td> Tricina (8.15) </td><td> 34,77 </td><td> 16,72 </td><td> 4,50 </td><td> 1,44 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Magnitudine mobilità effettiva (× 10 -9 m 2 / V / s) della zona aggiustato analita puro in ITP cationico dove il LE è sodio 100 mM e 200 mM tampone controione.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> REAGENTI </td></tr><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Acqua distillata </td><td> GIBCO </td><td> 10977 </td><td> RNasi / DNasi gratuito </td></tr><tr><td> Clorox Ultra </td><td> Clorox </td><td> 02489CT </td><td></td></tr><tr><td> idrossido di sodio (NaOH) </td><td> Mallinckrodt </td><td> 7708 </td><td></td></tr><tr><td> acido cloridrico (HCl) </td><td> EMD Chemicals </td><td> HX0603-4 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma base (tris) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> polivinilpirrolidone (PVP) </td><td> Polysciences Inc. </td><td> 06067 </td><td> MW 1000000 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 carbossilico </td><td> Invitrogen </td><td> A20000 </td><td></td></tr><tr><td> tricina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T-9784 </td><td></td></tr><tr><td> bis-tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4429 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> AM9260G </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> lisozima </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6876 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green II </td><td> Invitrogen </td><td> S7564 </td><td></td></tr><tr><td> etanolammina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 411000 </td><td></td></tr><tr><td> Rodamina 6G </td><td> Acros Organics (Geel, Belgio) </td><td> CAS 989-38-8 </td><td></td></tr><tr><td> L-amminoacidi </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> LAA21 </td><td></td></tr><tr><td> Potenza SYBR Green RNA-a-T C 1-Step Kit </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4389986 </td><td></td></tr><tr> &lt;td&gt; PCR primers </td><td> Integrated DNA Technologies </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> ATTREZZATURE </td></tr><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Borosilicato chip di microfluidica </td><td> Caliper Life Sciences Inc. </td><td> NS12A </td><td> Fornito con o senza plastica caddy </td></tr><tr><td> Pompa del vuoto </td><td> Gast </td><td> DOA-P104-AA </td><td></td></tr><tr><td> SourceMeter </td><td> Keithley </td><td> 2410 </td><td> Costante modalità correnti e costanti di tensione di funzionamento </td></tr><tr><td> Inverted microscopio epifluorescent </td><td> Olimpo </td><td> IX70 </td><td> Utilizzare lampada al mercurio (Olympus) o LED (Thorlabs) per l&#39;illuminazione </td></tr><tr><td> Cube Filter </td><td> Omega </td><td> XF115-2 </td><td> Eccitazione / emissione: blu / verde </td></tr><tr><td> Sicuro-Lock microprovette </td><td> Eppendorf </td><td> 022363204 </td><td> 1,5 ml di capacità </td></tr><tr><td> Centrifuga </td><td> Eppendorf </td><td> 5417C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 3. Reagenti e attrezzature specifiche.

on-chip isotachophoresis per separazione degli ioni e purificazione di acidi nucleici

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Tecniche elettrocinetici sono una graffetta di applicazioni su microscala per la loro capacità unica di eseguire una varietà di processi e fluidici elettroforetica in sistemi semplici e compatti senza parti in movimento. Isotachophoresis (ITP) è una tecnica semplice e molto robusta elettrocinetico che può raggiungere 1,2 milioni di volte preconcentrazione ed efficiente separazione ed estrazione basata sulla mobilità ionica. 3 Per esempio, abbiamo dimostrato l&#39;applicazione di ITP di separazione e rivelazione sensibile di non marcato ionici molecole (ad esempio tossine, DNA, rRNA, miRNA) con poco o nessun campione 4-8 preparazione e di estrazione e purificazione di acidi nucleici da matrici complesse compreso coltura cellulare, urina, sangue e 9-12. ITP raggiunge focalizzazione e separazione utilizzando un campo elettrico applicato e due buffer all&#39;interno di un sistema fluidico canale. Per analiti anionici, il principale elettrolita (LE) buffer viene scelto sale che i suoi anioni hanno una maggiore mobilità elettroforetica efficace rispetto agli anioni dell&#39;elettrolita finale (TE) tampone (mobilità efficace descrive la velocità di deriva osservabile di uno ione e tiene conto dello stato di ionizzazione dello ione, come descritto in dettaglio da Persat et al . 13). Dopo aver stabilito un&#39;interfaccia tra il TE e LE, un campo elettrico viene applicato in modo tale che gli ioni LE allontanarsi dalla regione occupata da ioni TE. Ioni del campione di razza intermedia mobilità efficaci prima di ioni TE, ma non può superare ioni LE, e così si concentrano presso il LE-TE interfaccia (in appresso denominata &quot;interfaccia ITP&quot;). Inoltre, la TE LE e aree del modulo di conducibilità rispettivamente a bassa ed alta, che stabiliscono una forte pendenza campo elettrico a livello di interfaccia ITP. Questo gradiente di campo preconcentrates specie campione come essi si concentrano. La corretta scelta dei risultati e di TE LE a messa a fuoco e la purificazione della specie bersaglio da altri non focalizzate specie e, infine, la separazione unod segregazione di specie campione. Noi qui rivedere la ITP principi fisici alla base e discutere due modi standard di funzionamento: &quot;picco&quot; e &quot;plateau&quot; modalità. In modalità picco, relativamente diluire ioni del campione si concentrano insieme in sovrapposizione picchi stretti a livello di interfaccia ITP. In modalità plateau, ioni del campione più abbondanti raggiungere una concentrazione nello stato stazionario e segregare in adiacenti plateau-like zone ordinate per la loro mobilità effettiva. Modalità di picco e plateau derivare da la stessa fisica di base, ma rappresentano distinti regimi differenziati dalla concentrazione dell&#39;analita iniziale e / o la quantità di tempo assegnato per l&#39;accumulo di campione. Per prima descritto in dettaglio un picco esperimento modello modalità e quindi dimostrare un saggio picco modalità per l&#39;estrazione di acidi nucleici da E. coli di coltura cellulare. Concludiamo con la presentazione di un saggio modo di plateau, dove usiamo un non-traccianti di messa a fuoco (NFT) specie per visualizzare la separazione e performare quantificazione di amminoacidi.

Isotachophoresis (ITP) è una separazione solido elettrocinetico e tecnica preconcentrazione con applicazioni che vanno dal rilevamento della tossina alla preparazione del campione. Esaminiamo i principi fisici di ITP e la metodologia di applicazione di questa tecnica per due applicazioni specifiche esempio: separazione e la rilevazione di piccole molecole e di purificazione degli acidi nucleici da lisato di coltura cellulare.

On-Chip Isotachophoresis per separazione degli ioni e purificazione di acidi nucleici

Le tecniche elettrocinetiche sono un elemento fondamentale delle applicazioni su microscala grazie alla loro capacità unica di eseguire una varietà di operazioni fluidiche ed elettroforetiche...

L'obiettivo generale di questo video è presentare una tecnica elettrocinetica chiamata isotachoforese, abbreviata ITP, e le sue applicazioni microfluidiche per la rilevazione e la separazione sensibile di ioni. In primo luogo, vengono discussi i principi fisici alla base dell'ITP, oltre alle due modalità standard di funzionamento, ovvero la modalità picco e la modalità plateau. Successivamente, l'ITP su chip viene dimostrata mediante tre esperimenti, a partire da un protocollo semplice per la preconcentrazione del campione, in cui i fluorofori vengono rilevati concentrandoli in un picco netto. In secondo luogo, viene mostrato un saggio ITP utilizzato per la preparazione del campione su chip, in cui DNA e RNA vengono estratti selettivamente dal lisato cellulare batterico.Infine, un saggio di rilevamento senza etichetta viene utilizzato per purificare e quantificare gli amminoacidi mediante ITP in modalità plateau. In definitiva, la purificazione degli amminoacidi, la preconcentrazione dell'analita e l'estrazione selettiva di acidi nucleici possono essere ottenute tramite ITP. Oggi vi illustreremo la fisica e la metodologia alla base di una versatile tecnica elettrocinetica chiamata Isot Apheresis.Il nostro gruppo ha introdotto metodi di ITP per la rilevazione senza marcatura, la preparazione del campione e saggi di ibridazione rapida. Condivideremo con voi tre saggi rappresentativi che dimostrano la capacità dell'ITP di preconcentrare analiti, estrarre acidi litici e purificare e rilevare aminoacidi. Questi saggi evidenziano la versatilità dell'ITP e mostrano i semplici passaggi necessari per garantire esperimenti ripetibili.In laboratorio. Negli ioni del campione ITP, questi si focalizzano selettivamente all'interfaccia tra un elettrolita leader e uno di coda, abbreviati rispettivamente come LE e TE. Gli ioni del campione viaggiano attraverso il microcanale a velocità costante determinata dalla velocità degli ioni leader.Gli ioni del campione si focalizzano se la loro mobilità elettroforetica efficace è compresa tra la mobilità degli ioni LE e quella degli ioni TE, dove la mobilità è definita come il rapporto tra la velocità di deriva dell'ione e il campo elettrico locale. Gli ioni del campione mescolati nel TE si muovono più velocemente degli ioni TE circostanti e di conseguenza si accumulano all'interfaccia LETE. Inoltre, l'interfaccia ITP è autorifinantesi: gli ioni LE, che potrebbero diffondere nella zona TE, subiscono un forte flusso di ripristino e tornano nella zona leader. Lo stesso vale per gli ioni TE nella zona LE.Le proprietà di autolimitazione e di focalizzazione di I due P contribuiscono alla robustezza di questa tecnica e la rendono insensibile a disturbi all'interfaccia, come il flusso generato da pressione. Nella modalità picco, le concentrazioni ioniche del campione sono significativamente inferiori rispetto a quelle degli ioni LE e TE. Pertanto, gli ioni del campione contribuiscono in modo trascurabile alla conducibilità locale in queste condizioni.Molti analiti si focalizzano nella regione dell'interfaccia ITP, formando principalmente picchi sovrapposti. In seguito, gli ioni del campione possono raggiungere una concentrazione sufficientemente elevata da separarsi e focalizzarsi in modalità plateau. Nella modalità plateau, gli ioni del campione si separano e purificano in zone di concentrazione localmente uniforme e costante, in un ordine determinato dalla loro mobilità elettroforetica.Gli ioni in modalità plateau determinano la conducibilità locale. Anche ioni molto diluiti possono comunque focalizzarsi in modalità picco tra zone plateau. Per i saggi presentati in questo protocollo, viene utilizzato un chip microfluidico in vetro con canale a croce, realizzato mediante incisione isotropica con bagnatura.Tuttavia, la ITP può essere eseguita anche in semplici canali rettilinei o capillari privi di intersezioni o giunzioni. La seguente procedura di pulizia deve essere effettuata prima degli esperimenti per garantire la ripetibilità tra un'esecuzione e l'altra e l'efficace applicazione di rivestimenti dinamici utilizzati per sopprimere il flusso elettroosmotico. Per decontaminare il canale, riempire i serbatoi nord, est e sud con 10-20 microlitri di soluzione di ipoclorito al 10%.Se si utilizza un caddy per chip calibro standard, collegare l'estremità larga di una punta da pipetta da 200 microlitri al serbatoio ovest del chip e connettere la linea del vuoto a un tubo con diametro interno di due millimetri. Applicare il vuoto per due minuti, quindi svuotare i serbatoi e pulirli accuratamente riempiendoli con acqua deionizzata e svuotandoli nuovamente con la linea del vuoto. Ripetere il lavaggio con acqua deionizzata diverse volte.Ripetere questo processo con idrossido di sodio uno molare. Le superfici dei canali verranno leggermente incise, producendo una superficie pulita di borosilicato utile a stabilire proprietà superficiali uniformi. Pulire i serbatoi con acqua deionizzata e quindi risciacquare i canali con le.Durante questo periodo, le proprietà superficiali e i rivestimenti dinamici raggiungeranno l'equilibrio all'interno dei canali. Per iniziare l'esperimento, preparare un millilitro di elettrolita leader e un millilitro di elettrolita trailer. Quindi combinare 90 microlitri di TE con 10 microlitri di una soluzione micromolare.Alexa Fluor 488. Dopo aver sciacquato con LE, svuotare il serbatoio ovest e risciacquare il serbatoio diverse volte con acqua deionizzata per diluire fortemente qualsiasi residuo di LE presente nel serbatoio. Infine, riempire questo serbatoio con 20 microlitri di TE contenente il colorante.Posizionare l'elettrodo positivo nel serbatoio orientale e l'elettrodo di massa o negativo nel serbatoio occidentale ed applicare una corrente costante di due microampere. Il picco del campione migrerà a velocità costante e la tensione tra i serbatoi aumenterà man mano che il tampone TE a più bassa conducibilità si accumula. Gli acidi nucleici provenienti da lisati cellulari non trattati possono essere purificati mediante ITP selezionando un anione di coda con una mobilità elettroforetica in modulo inferiore rispetto all'acido nucleico bersaglio, ma superiore rispetto agli inibitori ionici della PCR.Gli inibitori della PCR onic migrano in direzione opposta e quindi vengono lasciati indietro. Per iniziare, risospendere il pellet di cellule di E. coli contenente 10 alla ottava unità formante colonie in 80 microlitri di acqua priva di RNA e aggiungere 10 microlitri di agente lisante, mescolare delicatamente e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, aggiungere 10 microlitri di idrossido di sodio 1 M per innalzare il pH del lisato a circa 12,5. Agitare delicatamente la pipetta su e giù fino a quando la soluzione diventa limpida, momento in cui la lisi è completa.Successivamente, aggiungere 10 microlitri di lisato in 90 microlitri di Racine 50 millimolari e bis-tris 100 millimolari. Questa soluzione può ora essere utilizzata come te; preparare inoltre un millilitro di LE contenente il colorante cyber green come descritto nel protocollo scritto e utilizzare l'LE per riempire il chip microfluidico come dimostrato in precedenza. Dopo il risciacquo, sostituire il contenuto del serbatoio est con un compatibile PCR.Risciacquare il serbatoio occidentale con acqua deionizzata e riempirlo con 20 microlitri di te. Applicare 1000 volt tra i serbatoi orientale e occidentale per iniziare l'esperimento. La corrente tra questi serbatoi diminuirà al termine dell'esperimento.Il campione eluisce nel serbatoio di LA contemporaneamente a questa soluzione. La corrente in funzione del tempo per il sistema raggiunge tipicamente un valore di plateau. Mescolare delicatamente il contenuto del serbatoio azionando la pipetta su e giù per alcune volte.Quindi estrarre il volume di cinque microlitri per l'analisi mediante R-T-P-C-R quantitativo. L'R-T-P-C-R-I-T-P può essere utilizzato anche per separare e concentrare ioni piccoli in plateau adiacenti e rilevabili tra il TE e il LE, consentendo il rilevamento in base alle proprietà fisico-chimiche dimostrate. Di seguito è riportato un saggio con tracciante non concentrante in cui una specie ionica fluorescente viene aggiunta al LE.La specie fluorescente non si focalizza, ma la sua concentrazione si adatta a un campo elettrico locale, permettendo così la visualizzazione delle zone plateau purificate. Preparare innanzitutto un millilitro di elettrolita leader contenente il cationico Fluor four rod Domine six G e un millilitro di elettrolita trailer. Quindi combinare 90 microlitri di TE con 10 microlitri, ciascuno di arginina 50 millimolare e lisina 50 millimolare, per caricare il campione mediante iniezione finita.Dispensare 20 microlitri di Ellie nei serbatoi ovest e nord; dispensare il campione di aminoacido nel serbatoio est. Successivamente, applicare un vuoto nel serbatoio sud per un minuto. Dopo aver risciacquato il serbatoio est con acqua deionizzata, sostituire il contenuto con te.Come passaggio finale, applicare 500 volt tra i serbatoi est e ovest negli esperimenti in modalità picco con il marcatore fluorescente Alexa Fluor 4 88. L'intensità complessiva della fluorescenza può essere integrata e confrontata con una curva di calibrazione per ottenere una concentrazione quantitativa. Le informazioni mostrate qui derivano da esperimenti effettuati con una gamma di correnti applicate che rivelano il campione.La larghezza del picco è inversamente proporzionale alla corrente. Questo è un esempio di estrazione di acidi nucleici da lisato cellulare totale mediante ITP in modalità picco. Il picco totale di acidi nucleici in ITP presenta spesso una forma non ideale.Negli esperimenti di estrazione degli acidi nucleici, il campione viene lasciato eluire nel serbatoio LE ed estratto con una pipetta per l'analisi mediante risultati di RT-qPCR (reazione a catena della polimerasi con trascrizione inversa quantitativa) della trascrizione inversa quantitativa. La PCR ha verificato la corretta purificazione del rRNA 16S e del DNA ribosomiale 16S dalla coltura batterica; i cicli soglia del controllo negativo per rRNA 16S e DNA ribosomiale 16S erano entrambi superiori a 30 cicli, come previsto. È stata eseguita la modalità plateau di ITP per due aminoacidi, arginina e lisina, utilizzando il saggio NFT con RUMINE sei G come tracciante fluorescente in corsa veloce.Qui, l'intensità della fluorescenza relativa all'intensità della zona LE o TE può essere utilizzata per l'identificazione delle zone, mentre la larghezza delle zone consente la quantificazione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione pratica dell'ITP e della metodologia alla base di tre diversi saggi basati sull'ITP. In particolare, abbiamo mostrato come utilizzare l'ITP per purificare aminoacidi, preconcentrare analiti ed estrarre selettivamente acidi nucleici.Non dimenticare che lavorare con alta tensione può essere estremamente pericoloso. È necessario adottare sempre precauzioni, come l'uso di apparecchiature che limitano la corrente e il mantenimento di una distanza sufficiente dagli elettrodi.

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