Sviluppo sessuale e scarico in ascospore Fusarium graminearum

L'obiettivo generale di questa procedura è imparare a generare e manipolare lo sviluppo della paratesia e chiedere la scarica dell'APO in coltura. Ciò si ottiene inducendo prima e facendo crescere attivamente la cultura per avviare lo sviluppo sessuale. Il secondo passo consiste nel testare la secrezione attiva delle spore, quindi vengono generate le parastesia ricombinanti.

Il passo finale consiste nel valutare la progenie per i fenotipi che indicano se la ricombinazione è avvenuta o meno. In definitiva, i risultati possono essere utilizzati per lo screening dei mutanti nello sviluppo sessuale o per generare mutazioni multiple all'interno di un ceppo. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto i passaggi sono difficili da descrivere e, sebbene semplici, devono essere eseguiti con precisione per ottenere una scarica ottimale delle spore e una produzione costante di paratesia.

Inizia inoculare al centro la coclea della carota in una capsula di Petri di sei centimetri con un ceppo fertile di gramina. Arum incubare i piatti inoculati sotto brillante standard commerciale. Utilizzare un'illuminazione fluorescente a temperatura ambiente.

Lascia che i funghi crescano per tre o cinque giorni fino a quando il micelio non ha raggiunto il bordo esterno del piatto. Al cofano. Raschiare delicatamente la superficie della coltura con lo stuzzicadenti sterile per rimuovere i miceli aerei.

Quindi applicare un millilitro di tensioattivo sulla coclea e strofinare sulla superficie con l'estremità piegata o bulbosa di un'asta di vetro sterile. Senza applicare perfil. Rimetti le piastre sotto le luci.

Dopo 24 ore, la superficie delle piastre dovrebbe avere un aspetto lucido. Se i miceli riappaiono res raschiare, affiorare, riapplicare la soluzione di tween 60 e immergerli nella luce per altre 24 ore. Ora osserva lo sviluppo della paratesi per una settimana.

Le giovani parathesie sono visibili come grani neri sulla superficie della coclea. Rispetto alla paratesi matura. Non dovrebbero esserci quasi miceli superficiali.

Entro il settimo giorno le spore mature si accumulano sul coperchio della piastra e al nono giorno le spore sono così dense da essere visibili senza ingrandimento. Per raccogliere lo stadio intermedio, la parathesia raschia delicatamente la superficie della coclea con un bisturi e trasferisce la paratesi in un tubo criogenico. La provetta può quindi essere congelata per l'estrazione dell'RNA sei giorni dopo l'applicazione del tensioattivo.

Taglia un cerchio di un centimetro di diametro dalla coclea con un legno, un boero o un bisturi. Tagliare il cerchio a metà e montare le metà su un vetrino da microscopio, orientare i pezzi in modo che la superficie contenente i corpi fruttiferi sia perpendicolare alla superficie del vetrino e le spore vengano sparate lungo la lunghezza del vetrino. A questo punto, se si desidera un inibitore di spore acro, applicarlo sul retro del blocco coclea.

Questa tecnica può essere utilizzata per lo screening di sostanze chimiche per inibitori della secrezione e per lo screening di mutanti genetici per la perdita della capacità di sparare spore, abbiamo fatto entrambe le cose con successo. Ora, incubare il vetrino per una notte in una semplice camera umidificata illuminata a temperatura ambiente. Quando i corpi fruttiferi eruttano, le spore si accumulano sul vetrino e saranno visibili lì al mattino.

Le spore accumulate possono ora essere lavate via dal vetrino, raccolte in un piatto pulito e quantificate. Inizia creando un incrocio genetico tra due ceppi di f gramine arum inoculandoli sui lati opposti di una capsula di Petri a coclea di carote. Come descritto in precedenza, fai crescere i funghi fino a quando l'ifia non ha riempito la superficie.

Raschiare le parti aeree e applicare T tra 60 soluzioni. In questo scenario, segnare il piatto in cui si incontrano le ife. Riporta le colture alla luce e incubale per circa sette giorni quando la paratesi si è sviluppata e Siri inizia a formarsi dalla paratesi lungo l'intersezione tra le culture.

Questa tecnica può essere utilizzata per combinare più mutazioni in un unico ceppo. Vale anche la pena notare che sia la maglia più che la maglia meno possono essere selezionate per renderlo un pennarello selezionabile molto utile. Sotto il microscopio da dissezione, porta in vista la paratesi lungo l'intersezione delle due culture.

Quindi trova l'occhio scottato. Ora immergi uno spillo per insetti sterilizzato in acqua sterile e tocca lo spillo con uno sieroso formato al confine tra le colture. Gli SRI dovrebbero aderire all'umidità del perno.

Quindi sciacquare la punta dello spillo in 200 microlitri di acqua sterile contenuta in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Fiammare il perno, inumidirlo di nuovo e scegliere un altro sru. Scegli da tre a cinque Siri e trasferiscili tutti sul proprio tubo.

Ora brevemente vortice. Ogni tubo contiene Siri sospeso per ogni tubo. Distribuire 60 microlitri di sospensione di spore su una capsula di Petri da nove millimetri.

Con il terreno MMTS, incubare le piastre a temperatura ambiente con o senza luci e conservare la sospensione di spore rimanente a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana. Dopo tre-cinque giorni, sul piatto compaiono colonie molto piccole. Un fenotipo può essere valutato al microscopio.

Le colonie negative lavorate a maglia avranno un'ifia più rada rispetto alle colonie positive lavorate a maglia. Scartare quelle piastre con solo uno dei fenotipi. I Siri da parathesia ricombinante hanno entrambi i fenotipi di colonia in proporzione approssimativamente uguale.

Conserva queste piastre. A volte altri fenotipi risultano dovuti alla segregazione di altri fattori come le colonie, che sono intermedie tra la maglia positiva e la maglia negativa per scopi di conservazione, il trasferimento delle colonie dalle piastre ricombinanti a una piastra a otto V o a coclea di carota per continuare lo studio esaminando altri fenotipi a piastra le colonie sulla coclea del bacino del Chap X e su piastre con PDA contenente clorato. Le parathesia sono cresciute in un prato nero vellutato senza miceli o spore.

24 ore dopo l'applicazione di tween, la superficie della coclea presentava una leggera lucentezza. Se i miceli erano ricomparsi, la placca potrebbe non essere stata raschiata abbastanza da indurre lo sviluppo della paratesia. Diversi blocchi di trivella con corpi fruttiferi di un ceppo di tipo selvatico sono stati allestiti per sparare le loro spore su vetrini da osservare.

È stata preparata un'illuminazione adeguata. Le parathesia troppo giovani o troppo vecchie spesso non si attivavano. Quando era troppo vecchio, numerosi hyphy apparivano sulla superficie della cultura, dandogli una tonalità biancastra.

Quando erano troppo giovani, i corpi fruttiferi non si attivavano e l'esperimento veniva ripetuto. 24 ore dopo, quando 10 Siri sono stati raccolti da un incrocio, almeno sei erano tipicamente ricombinanti come valutato da un mix di fenotipi negativi e positivi. Molto occasionalmente una mutazione impediva a un ceppo di accoppiarsi.

Se uno dei genitori aveva un fenotipo di crescita apparente, allora più di due fenotipi erano presenti tra le colonie su MMTS. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare di iniziare con una coltura che è stata ben mantenuta e non trasferita in sequenza nel tempo. Inizia sempre con una coltura che è stata coltivata da un brodo di congelamento stabile.