Name: Do-It-Yourself dispositivo per il recupero di campioni crioconservati cadere accidentalmente nelle cisterne criogeniche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Scopri come recuperare campioni crioconservati da cisterne di azoto liquido con un dispositivo fai-da-te economico e sicuro. Questo metodo preserva l'integrità dei campioni e può essere utilizzato da un singolo operatore.

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DIY criogenico dispositivo di recupero era stato testato in corso dei progetti &quot;prenilazione proteica Modeling batteriche nelle cellule eucariotiche usando la bioinformatica e approcci molecolari&quot;, promosso dal Premio Mary Louise Andrews per il programma di ricerca sul cancro, Virginia Academy of Science &quot;, significato fisiologico di RNA editing in Plasma Le cellule dendritiche &quot;promosso dal Jeffress F. Thomas e Kate Miller Jeffress Memorial Trust e contratto 16.740.11.0364 Stato (Ministero della Scienza e Istruzione, Russia). Vorremmo ringraziare Beth Eom per l&#39;assistenza con l&#39;esperimento integrità RNA.

1. Montaggio del dispositivo per il recupero di Cryotolerant Cryoboxes <ol><li> Utilizzando pinza, raddrizzare un lato di 3 lati forte legame (Figura 1A) per effettuare una forma di L-forte legame nota mostrata in figura 1B:. Le dimensioni del forte legame-può essere selezionata a seconda del diametro del collo di Dewar . </li><li> Fissare due tali forte legame con un forte legame cinghia T (figura 2) utilizzando corona dado del bullone, la rondella e la vite per formare la base Cryoscoop come mostrato in Figura 3 (AB) Nota:. Due legami forti vengono utilizzati per consentire il recupero dei 5 ½ pollici X 5 ½ pollici cryoboxes. </li><li> Utilizzando una piastra scanalata (figura 4), ​​allineare le aperture sul forte legame cinturino T con le scanalature su un&#39;estremità della piastra asolata e fissare i due insieme con l&#39;aiuto di dado Hillman e bulloni (Figura 5). Nota: Se la piatto forato e forte legame non si come con fori predisposti, si dovrà avere fori praticati con punta in metallo duro. </li><li> Piegare l&#39;altra estremità della piastra asolata con l&#39;aiuto di una pinza come mostrato in Figura 6. (Questo passaggio è facoltativo). </li><li> Avvolgere la maniglia con schiuma di comprendere meglio il dispositivo quando in azoto liquido, come mostrato nella Figura 6. (Opzionale) Nota: rimuovere la schiuma prima della sterilizzazione in autoclave. </li></ol> 2. Montaggio del dispositivo per il recupero di Cryotolerant Cryovials Il Cryotolerant dispositivo di recupero fai da te può essere adattato anche per il recupero di cryovials. Ciò comporta sostituire la base piana con un filtro in acciaio inossidabile come mostrato alterato per scavando flaconi da azoto liquido (Figura 7). <ol><li> Svitare i dadi della Corona e bulloni che fissano il forte legame cinghia T alla piastra asolata. </li><li> Prima di applicare il filtro in acciaio inox alla piastra asolata, flettere leggermente il colloil filtro con l&#39;aiuto di pinze per orientare la base ad un angolo per assomigliare ad una siviera (Figura 8) Nota: Se il filtro è dotato di un labbro, utilizzare una pinza per piegare il labbro basso, questo renderà manovre con il dispositivo più facile.. </li><li> Allineare il foro sul manico del filtro con i fori sulla piastra asolata e fissare il filtro con l&#39;aiuto di Hillman dadi e bulloni, come mostrato nella Figura 8. Nota: se il filtro non viene fornito con fori predisposti, sarà necessario di organizzare per avere fori con la punta in metallo duro. </li></ol> 3. Recupero Cryoboxes e Cryovials Da Dewar <ol><li> Per iniziare, indossare guanti criogenici e togliere 1 o 2 rack freezer dal Dewar per lasciare spazio di manovra. </li><li> Raschiare delicatamente lungo la parte inferiore del Dewar con il montante Cryotolerant dispositivo di recupero fai da te dotata di una forte base di strap tie-T (Figura 5) e raccogliere l&#39;Falle boxn al fondo del serbatoio Dewar Nota:. bolle azoto liquido immediatamente a contatto con un oggetto più caldo, avvolgente l&#39;oggetto in isolante gas azoto (effetto Leidenfrost). Per raffreddare il dispositivo di recupero prima di campioni, lentamente immergere il dispositivo nella Dewar e consentire azoto liquido per raffreddare il dispositivo sufficientemente prima di procedere con la fase precedente. </li><li> Tirare il dispositivo in posizione verticale lungo le pareti del Dewar per raccogliere la scatola freezer dal serbatoio. </li><li> Afferrare la scatola recuperata dal fondo della Dewar. </li><li> Per il recupero cryovials, delicatamente raschiare il fondo del Dewar con la cryoscoop munito di un filtro (Figura 9). </li><li> Simile a cryobox recupero, estrarre il dispositivo in posizione verticale e prendere le fiale raccolti nel filtro. </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Una sfida in studi di espressione genica è che la qualità dell&#39;RNA dipende dalle condizioni di conservazioneper entrambi i campioni di tessuto congelato e la Figura estratto RNA 4. 10 mostra l&#39;effetto della manipolazione del campione sull&#39;integrità di RNA totale. L&#39;RNA totale dalla sorgente stesso tessuto (adiposo umano) è stato sottoposto a manipolazione dei campioni differenti. Prima di esperimento, intatto RNA totale preparato mostra chiare bande 28S e 18S rRNA con la banda 28S rRNA approssimativamente due volte più intenso come la banda 18S rRNA (Figura 10, corsia 1). Questo rapporto 2:1 (28S: 18S) è un&#39;indicazione che l&#39;RNA è intatto, mentre parzialmente degradata RNA appare come una macchia, o la sua 28S: intensità 18S rapporto parte da 2:01 5. Lanes 3-4 raffigura campioni di RNA con una degradazione significativa. Questi campioni di RNA sono stati sottoposti a ripetuti scongelamento parziale di breve termine richiami il Dewar (metodo A), modellando così stoccaggio a lungo termine con periodica decantazione a causa della necessità di recuperare il fiale caduta e caselle (Figura 10, corsia 3-4 ). Tuttavia, i campioni conservati in Dewar servitoutilizzare un dispositivo DIY (Metodo B) e, quindi, non scongelamento parziale, contengono RNA intatto (Figura 10, corsia 2). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig1.jpg" /> Figura 1. A) La base è costituito da due tre lati dimensioni indicate forte della cravatta. Ogni forte legame contiene una grande pre-forate per infilare (freccia solido) e fori più piccoli (più piccola freccia) su ciascuna faccia. Questo fornisce un opzione per consentire il fissaggio con dado e bulloni. Anche i fori più piccoli consentono il rapido deflusso del liquido durante il recupero del campione. B) Un lato di ogni della forte legame viene raddrizzata con l&#39;aiuto di una pinza per rendere L sagomato forte legame. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig2.jpg" /> Figura 2. Strong-tie strap T viene utilizzato per proteggere i forti legami di insieme. Come forte legame, T-strap ha una grande pre-forate per infilare (freccia piena) e due fori più piccoli (SMALl freccia) in ogni angolo. Questo permette di fissaggio forte legame per tutta la lunghezza del T - Strap con viti e bulloni. Consente inoltre di fissaggio T-strap alla piastra asolata. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig3.jpg" /> Figura 3. A) Ogni forte legame è fissata in un angolo di T-strap, tutta la sua lunghezza con i dadi dei bulloni corona, bulloni e rondelle. B) Due forte di legami sono fissati uno accanto all&#39;altro per aiutare recuperare 5 ½ X 5 ½ pollici dentro cryoboxes. Per i più piccoli cryoboxes come 2 mm x 2 pollici, un unico forte legame può essere fissato direttamente alla piastra asolata senza T-strap. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig4.jpg" /> Figura 4. Intaglio piastra piatta viene utilizzato come impugnatura. Lunghezza della piastra asolata dipende dalla profondità della Dewar. In questo caso, 4 piedi di piastra asolata stato utilizzato. Lo spessore della piastra scanalata s è criticacia sottili lastre scanalate (&lt;14 calibri) rendere il dispositivo fragile durante il recupero di campioni di azoto liquido riempito Dewar. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig5.jpg" /> Figura 5. La base piana costituita da forti legami di cinghia e T è poi fissato ad una estremità della piastra asolata. Il buco più grande all&#39;angolo rimanente della cinghia T è allineata con la fessura sulla piastra piatta e fissata con bulloni e dado esagonale. Questo dispositivo può essere ora utilizzato per recuperare cryoboxes da Dewar. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig6.jpg" /> Figura 6. Una estremità della piastra scanalata piana è piegata con una pinza e ricoperto di poliuretano per fornire una migliore aderenza soprattutto per Dewars profonde, come mostrato in questo caso. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig7.jpg" /> Figura 7. Filtro con rete metallica e maniglia in acciaio inoxviene utilizzato per recuperare cryovials da Dewar. Se la maniglia non è provvisto di una scanalatura, con trapano bit carburo saranno necessari per la perforazione di un foro. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig8.jpg" /> Figura 8. Per facilitare il recupero dei cryovials, filtro viene piegata lungo il collo con una pinza per ottenere filtro a forma di mestolo. Se il filtro è dotato di labbro come in questo caso, pinze possono essere utilizzati per piegarlo. In questo modo il filtro non rimanere intrappolati all&#39;interno della Dewar. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig9.jpg" /> Figura 9. Filtro è fissata alla piastra asolata piatta ad una estremità con dado e bullone. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig10.jpg" /> Figura 10. L&#39;integrità del campione di RNA totale sottoposta a diverse condizioni di gestione dei campioni. Per esplorare come la qualità RNA è influenzato dal campione gestione condizioni, una serie di campioni di RNA dalla stessa fonte è stato sottoposto a due metodi di manipolazioni. Metodo A consisteva di stoccaggio di RNA in Dewar sottoposto a recuperi di esempio utilizzando dispositivo fai da te, quindi non scongelamento parziale. Metodo B consisteva di stoccaggio di RNA in Dewar sottoposto a ripetute scongelamento parziale a breve termine richiami effettuati nell&#39;ambito del Dewar, modellando così una conservazione a lungo termine con travasi periodici per il recupero dei campioni caduti. Integrità RNA totale è stato poi analizzato mediante elettroforesi su gel. Lane1: campione prima dello stoccaggio in Dewar; Lane 2: esempio da Dewar sottoposto a recupero secondo il metodo A; Lane 3, 4: Esempio da Dewar sottoposti a recupero con il metodo B, M: ladder 100 bp.

<ol><li>Kittel, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKittel%2C+P+%22Advances+in+Cryogenic+Engineering%22">Advances in Cryogenic Engineering</a>. , Springer. 41(1996).</li>
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<li>Muyal, J., Muyal, V., Kaistha, B., Seifart, C., Fehrenbach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+RNA+extraction+techniques+from+frozen+and+fresh+lung+tissues%3A+checkpoint+towards+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies.</a> Diagnostic Pathology. 4, 9(2009).</li>
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<li>Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+sample+collection+and+processing+for+molecular+epidemiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FReviews+in+Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies.</a> Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 543, 217-234 (2003).</li>
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</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Uno dei metodi più comuni di recupero cryoboxes e cryovials dal fondo del serbatoio Dewar è decantare azoto liquido in un contenitore di riserva ed estrarre i campioni rimanenti nel pallone o galleggiare in azoto liquido decantato. Questo è, tuttavia, una pratica sicura, che può provocare ustioni criogeniche o di asfissia a causa di una prolungata esposizione ai vapori di azoto liquido 2. Altro modo comune per il recupero dei caduti cryovials comporta l&#39;uso di pinze esageratamente 3. Tuttavia, ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Hillman Group placcato intaglio piatto 1-3/8 x 4 metri; 14 Gauge </td><td> Hardware negozio locale </td><td> N / A </td><td> 1 unità necessaria </td></tr><tr><td> Crown Bolt Stainless Steel # 6 - 32 x 3/8 in Oval Screw Machine Head unità Phillips </td><td> Hardware negozio locale </td><td> Model # 42281 </td><td> 4 unità richieste </td></tr><tr><td> Bolt Crown 3/8 pollici x 1-1/2 in rondelle acciaio zincato Fender </td><td> Hardware negozio locale </td><td> Model # 20122 </td><td> 4 unità richieste </td></tr><tr><td> Crown Bolt zincati # 8-32 Vite Dado Macchina </td><td> Hardware negozio locale </td><td> Model # 18512 </td><td> 4 unità richieste </td></tr><tr><td> Simpson Strong-Tie BC40Z 4 pollici In.x4 Mezza Base </td><td> Hardware localeacquisti </td><td> Model # BC40Z </td><td> 2 unità richieste </td></tr><tr><td> Simpson Strong-Tie 6 pollici x 6 pollici Strap T </td><td> Hardware negozio locale </td><td> Model # 66T </td><td> 1 unità necessaria </td></tr><tr><td> Oneida 6 &quot;Mesh Strainer </td><td> Supermercato locale </td><td> Model # 7859W </td><td> 1 unità necessaria </td></tr><tr><td> Il Gruppo Hillman zincato Hex Nuts 3/8-16 </td><td> Hardware negozio locale </td><td> Model #: 810509 </td><td> 6 unità richieste </td></tr><tr><td> Il Gruppo Hillman zincato bulloni esagonali 3/8- 16 </td><td> Hardware negozio locale </td><td></td><td> 4 unità richieste </td></tr><tr><td> Espanso per l&#39;isolamento </td><td> Hardware negozio locale </td><td></td><td> 1 unità necessaria </td></tr><tr><td> Cacciavite </td><td> Hardware negozio locale </td><td></td><td> 1 unità necessaria </td></tr><tr><td> Pinze </td><td> Hardware negozio locale </td><td></td><td> 1 unità necessaria </td></tr></tbody></table>

do-it-yourself dispositivo per il recupero di campioni crioconservati cadere accidentalmente nelle cisterne criogeniche

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks 

L&#39;azoto liquido è incolore, inodore, estremamente freddo (-196 ° C) di liquido mantenuto sotto pressione. È comunemente usato come fluido criogenico per conservazione a lungo termine di materiali biologici come sangue, cellule e tessuti 1,2. La natura criogenico di azoto liquido, mentre l&#39;ideale per la conservazione del campione, può causare congelamento rapido dei tessuti vivi a contatto - noto come &#39;criogenico burn&#39; 2, che possono portare a gravi congelamenti in persone strettamente coinvolte nella conservazione e il recupero dei campioni di Dewars. Inoltre, come azoto liquido evapora riduce la concentrazione di ossigeno nell&#39;aria e possono causare asfissia, specialmente in spazi ristretti 2. Nei laboratori, i campioni biologici sono spesso conservati in cryovials cryoboxes o impilati in rack in acciaio inox all&#39;interno dei serbatoi Dewar 1. Questi scaffali sono provvisti di un albero lungo per evitare scatole di scivolare fuori dai rack e sul fondo dellaDewars durante la routine di gestione. Troppo spesso, tuttavia, scatole o fiale con i campioni preziosi scivolare fuori e si depositano sul fondo del serbatoio di azoto liquido riempito. In tali casi, i campioni possono essere tediously recuperato dopo il trasferimento della azoto liquido in un contenitore di riserva o eliminazione. Le scatole e flaconi possono essere relativamente sicuro recuperato dal svuotato Dewar. Tuttavia, la natura criogenico di azoto liquido e il suo tasso di espansione rende pericolosa affondata il recupero del campione. È comunemente raccomandato da Uffici sicurezza che il recupero del campione non essere effettuata da una sola persona. Un&#39;altra alternativa è quella di utilizzare grabber fresche reperibili in commercio o pinze per estrarre i flaconi 3. Tuttavia, la visibilità limitata all&#39;interno degli oscuri Dewars pieni di liquido costituisce un grande limite nel loro utilizzo. In questo articolo, si descrive la costruzione di un dispositivo di recupero Cryotolerant fai da te, che rende il recupero del campione da Dewar contenente liquidi criogenici sia sicuro unond facili.

Presentiamo qui un basso costo, durevole cryotolerant dispositivo per il recupero del campione da serbatoi Dewar riempiti con azoto liquido. La facilità di costruzione e la progettazione modulare del dispositivo rende il processo di recupero campione da serbatoi criogenici sicuro e facile.

Do-It-Yourself dispositivo per il recupero di campioni crioconservati cadere accidentalmente nelle cisterne criogeniche

L'azoto liquido è un liquido incolore, inodore, estremamente freddo (-196 °C) e mantenuto sotto pressione. È comunemente utilizzato come fluido criogenico per la conservazione a lungo termine...

L'obiettivo di questa procedura è facilitare il recupero di campioni da box criogenici e da provette criogeniche contenute in taniche doppie riempite con azoto liquido, utilizzando un dispositivo di facile costruzione. Questo risultato si ottiene innanzitutto rimuovendo uno o due supporti del congelatore per creare spazio necessario alle manovre ed inserire il dispositivo verticalmente nella tanica. Il secondo passaggio consiste nel raschiare delicatamente il fondo della tanica con il dispositivo.Successivamente, sollevare verticalmente il dispositivo lungo le pareti del contenitore per recuperare la scatola congelatore dal serbatoio; l'ultimo passaggio consiste nell'afferrare la scatola recuperata dal fondo del contenitore e reinserire gli scaffali congelatore rimossi. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il travaso o l'utilizzo di barre piene di azoto liquido, è che offre un'alternativa semplice, sicura e rapida, che preserva l'integrità del campione ed è eseguibile da un singolo operatore. Per iniziare l'assemblaggio del dispositivo criotollerante, utilizzare una pinza per raddrizzare un lato di un fermo triangolare resistente, ottenendo c

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