Name: Con ovuli Schistosoma mansoni Come In vivo Modello di elminti-indotta infiammazione polmonare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Scopri come indurre infiammazione polmonare con uova di Schistosoma mansoni in un modello murino. Questo metodo permette di studiare la risposta immunitaria Th2 e il reclutamento di cellule infiammatorie nei polmoni.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH) AI091759 e il morbo di Crohn e Colite Fondazione William America e Shelby Modell Award Famiglia Research Foundation (a MN). Schistosoma topi infettati sono stati forniti dal Centro NIAID Resource schistosoma (NIAID Contract N01 A130026).

1. Purificante Schistosoma mansoni Eggs <ol><li> Infect svizzero-Webster topi con cercariae schistosoma, che è lo stadio infettivo del ciclo di vita Schistosoma 8. In alternativa, ottenere schistosoma topi infettati dal Resource Center NIAID schistosomiasi ( <a href="http://www.schisto-resource.org/" target="_blank">http://www.schisto-resource.org/~~V</a> ). Lasciare topi di 6-7 settimane dopo l&#39;infezione, per cui il tempo-punto, le uova sono presenti nel fegato e può essere recuperato come descritto di seguito (vedi Fig. 1). </li><li> Euthanize topi con CO 2, e bagnare con il 70% di etanolo. Posizionare il mouse sul retro. Utilizzare pinze smussate e forbici per tagliare via la pelle e del peritoneo sottostante. Excise il fegato, che si trova sotto la gabbia toracica e del diaframma. </li><li> Finemente macinata fegati e aggiungere 20 ml per fegato di miscela di digestione, composta di collagenasi / dispasi (0,5 mg / ml), penicillina (100 U / ml) e streptomicina (100 ug / ml) in PBS. Mettere MIXTure in una provetta da 50 ml Falcon ed incubare una notte a 37 ° C shaker. </li><li> Centrifugare miscela a 400 xg / 3 min / 20 ° C. Delicatamente versare il liquido in eccesso e riempire tubo con PBS. Centrifugare e ripetere lavaggio PBS. Dopo l&#39;ultima centrifugazione, Risospendere il pellet in 25 ml di PBS. </li><li> Filtrare il sedimento risospeso attraverso un filtro metallico standard di cucina (usare una siringa da 50 ml stantuffo per schiacciare i pezzi di fegato attraverso in un bicchiere di vetro), seguita da passare la miscela attraverso un setaccio fine (utilizzare siringa da 10 ml per spingere miscela attraverso il setaccio fine in un bicchiere di vetro secondo). </li><li> Mettere impasto strained in una provetta da 50 ml Falcon. Centrifugare a 400 xg / 5 min / 20 ° C. Versare con cautela out surnatante senza perdere pellet. Risospendere il pellet in 3 ml di PBS. </li><li> Overlay mescolare delicatamente su un Percoll 20%, 40 mL di gradiente Percoll 8 ml e 32 ml di saccarosio 0,25 M (FW = 342,3 così 8,56 g sucrose/100 mL H 2 0). </li><li> Centrifugare 10 min / 800 xg / 20 ° C. Pipettare fuori unod scartare gelatinoso strato superiore delle cellule epatiche. Rimuovere uovo pellet in basso con una pipetta di trasferimento e messo in una provetta da 15 ml Falcon. </li><li> Wash 3X pellet in 10 ml di PBS / EDTA 1 mM / 1 mm impostazioni centrifuga EGTA utilizzando: 3 min / 30 xg / 20 ° C. Risospendere in 500 pl PBS. </li><li> Mix Overlay su una nuova Percoll 25%, 10 mL gradiente (2,5 ml di Percoll e 7,5 mL saccarosio 0,25 M) utilizzando le impostazioni centrifuga: 10 min / 800 xg / 20 ° C. </li><li> Lavare 3 volte in 10 ml di PBS utilizzando le impostazioni di centrifuga: 3 min / 30 xg / 20 ° C. </li><li> Negli ultimi 10 mL di lavaggio, rimuovere 100 ul per contare le uova. Uova risolvere rapidamente, in modo che il tubo Falcon devono essere miscelati bene prima di rimuovere campione. Diluire il campione da 100 ml con 900 microlitri di PBS. 100 microlitri della miscela dovrebbe essere considerato come gocce su un vetrino da microscopio utilizzando un microscopio da dissezione (diluizione 1:10). Wide-foro puntali devono essere utilizzati. </li><li> Risospendere uova a 50.000 uova / ml in PBS. Le uova possono essere conservati per alcuni mesi a -80 ° C e scongelato una o TWICe per l&#39;uso. Prima dell&#39;uso, ispezionare sotto un microscopio per garantire che le uova sono ancora intatte (vedi fig. 1). </li></ol> 2. Sensibilizzazione intraperitoneale con S. Uova mansoni: Giorno 0 <ol><li> Preparare le uova a 5.000 pl eggs/100 PBS in una provetta da 5 mL snapcap. Per l&#39;iniezione, stimano uova 50% più del necessario. </li><li> Caricare un ago da 23 gauge 3/4inch e una siringa da 1 ml con 100 microlitri di sospensione uovo al mouse. Uova risolvere, in modo da aghi di carico con le uova immediatamente prima dell&#39;utilizzazione. </li><li> Roccia siringa avanti e indietro per mescolare le uova prima di ogni iniezione, e iniettare per via intraperitoneale 100 microlitri di sospensione per mouse. </li></ol> 3. Retro-orbitale sfida endovenosa con S. Uova mansoni: Giorno 14 <ol><li> Preparare le uova di cui sopra a 5.000 eggs/100 pl. </li><li> Anestetizzare topi in camera specializzata con isofluorano (4%), o intraperitoneale con xilazina (10 mg / kg) e ketamina (120 mg / kg). Profondità di Anesthesia è determinato dal pizzicamento della zampa e garantendo l&#39;assenza di risposta fisica. </li><li> Dopo il caricamento della siringa da 1 ml e 23 gauge 3/4inch con uova, utilizzare forcipe per piegare l&#39;ago con un angolo di 90 ° con la smussatura rivolta verso il basso l&#39;angolo. Assicurarsi che non siano presenti bolle. </li><li> Posizionare il mouse su un lato. Ritrarre la pelle in modo da sporgere occhio, e iniettare 100 microlitri nei vasi dietro il bulbo oculare in un angolo di 45 ° al naso. </li><li> Ritirare l&#39;ago ed applicare una leggera pressione per controllare l&#39;emorragia. </li></ol> Tutte queste procedure deve essere eseguita con cura, e topi deve essere monitorata fino recupero dall&#39;anestesia. Questi protocolli sono stati approvati dalla University of Pennsylvania Institutional Animal Care e del Comitato uso (IACUC). 4. Sperimentale Vendemmia: Day 22 <ol><li> Euthanize topi con CO 2. </li><li> Bagnare con il mouse etanolo al 70%, e il luogo sul retro. </li><li> Utilizzando blunt forceps, afferrare l&#39;addome del mouse e fare una piccola incisione nella pelle. Rimuovere con cura la pelle con le forbici ed esporre la gabbia toracica e del peritoneo. </li><li> Tagliare il peritoneo. Tagliare il aorta addominale di recuperare il sangue con una pipetta Pasteur. Conservare su ghiaccio. </li><li> Spostare il fegato giù per esporre il diaframma. Usare le forbici per tagliare sottili il diaframma. Tagliare con cautela aperta la gabbia toracica per esporre il tessuto polmonare. </li><li> Recuperare i linfonodi che drenano parathymic il polmone con una pinza fine. Questi sono infilato sotto la gabbia toracica, su entrambi i lati del timo 9. Conservare il ghiaccio in 1mL mezzi sterili (DMEM supplementato con 10% inattivato al calore siero di vitello fetale, 100 U / ml penicillina, 100 pg / ml streptomicina, 2 mM L-glutammina, 50 pM 2-mercaptoetanolo, tutti disponibili da Invitrogen). </li><li> Per recuperare il BAL, e gonfiare i polmoni per l&#39;analisi istologica, l&#39;intubazione endotracheale deve essere eseguita. Esporre la trachea spostando le ghiandole salivari di lato, e placing pinza sottile sotto la trachea. Utilizzando forbici sottili, tagliare un foro al centro della trachea, e inserire tubi nei polmoni. Fissare tubi legando con filo chirurgico. </li><li> Fissare PBS-riempita siringa da 1 ml al tubo e gonfiare i polmoni con 1 ml di PBS. Lavare accuratamente recuperare BAL con la siringa. Conservare su ghiaccio. </li><li> Attaccare 4% paraformaldeide (PFA) in PBS-riempita siringa da 1 ml per il tubo e gonfiare i polmoni. </li><li> Rimuovere il tubo, e serrare il filo chirurgico per prevenire le infiltrazioni della PFA. </li><li> Analizzare attentamente le tessuto polmonare e posto in una provetta Falcon 50 ml con 5 ml 4% PFA. </li></ol> 5. Preparazione dei tessuti recuperati <ol><li> Siero: memorizzazione seguito su ghiaccio per 30 minuti a 2 ore alla coagulazione del sangue, siero viene recuperato dal sangue mediante centrifugazione (13000 xg / 10 min / 4 ° C). Il siero è conservato a -20 ° C e può essere utilizzato per l&#39;ELISA citochine o S. mansoni uovo antigene-specifica isotipo IgG ELISA <sup&gt; 6, 10. </li><li> Linfonodi: sospensioni di cellule singole sono preparati e conta delle cellule utilizzate per valutare l&#39;entità della risposta immunitaria. Per esaminare la polarizzazione delle cellule Th2, le cellule vengono ri-stimolate con S. mansoni antigene uovo per 72 ore. Colorazione Intracellar citochina può essere esaminata mediante citometria di flusso, e supernatanti può essere recuperato e conservato a -20 ° C per ELISA di citochine Th2 (IL-4, IL-5, IL-13) 6. </li><li> BAL: Le cellule sono pellettizzato (400 xg / 5 min / 4 ° C). BAL viene recuperato e conservato a -20 ° C per l&#39;analisi di citochine Th2 mediante ELISA. BAL conteggi celle vengono utilizzate come un visualizzatore per infiammazione delle vie aeree. Preparazioni di citocentrifuga 10,000-100,000 cellule (500 giri / min 5/4 ° C), seguita da colorazione Diffquik consentirà enumerazione di infiltrato infiammatorio 4, 6. In alternativa, le cellule BAL può essere esaminata mediante citometria di flusso 6. </li><li> Tessuto polmonare: il tessuto polmonare è stored notte a 4 ° C. Tessuto fissato è incluso in paraffina, sezionati e montati su vetrini per l&#39;analisi istologica ed immunofluorescenza. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Questo protocollo dettagli tutti i passaggi necessari per (i) la preparazione purificata Schistosoma mansoni uova per uso in vivo (Fig. 1), (ii) sensibilizzare e sfidare i topi con queste uova e (iii) recuperare gli organi per l&#39;esame della risposta infiammatoria del polmone. Questo modello in vivo guida riproducibile una potente risposta infiammatoria polmonare Th2. Ciò è dimostrato da infiammazione delle vie aeree e come eosinofilia visualizzati tramite conta delle cellule del BAL e preparati citocentrifuga (Fig. 2). H &amp; E-colorate sezioni polmonari possono essere esaminati per l&#39;egg-indotta granulomi (Fig. 3a), e la colorazione di immunofluorescenza delle sezioni polmonari permette la visualizzazione di macrofagi attivati ​​alternativamente e Th2 citochine indotte geni come resistenzatin-come molecola (RELM) α (Fig. 3b). L&#39;antigene-specifica risposta citochina Th2 CD4 viene esaminata da ELISA per IL-5, IL-4 e IL-13-antigene di cellule stimolate parathymic linfonodi (Fig. 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig1.jpg" /> Figura 1 Schistosoma mansoni modello iniezione di uova foto rappresentativi di fegato granulomatose, caratteristiche di alta S.mansoni-uovo oneri, e di uova S.mansoni sono mostrati -.. Dimensione media (L) 120 micron (da W) 50 pm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig2.jpg" /> Figura 2. S. mansoni iniezione di uova guida infiammazione delle vie aeree. A. Numero di cellule BAL (x10 5) da naïve (N) o S.mansoni (Sm) uovo iniettato nei topi. * P &lt;0,05. B. citocentrifuga preparazione di cellule BAL. Mac, macrofagi; Eos, eosinofili, LINFA, linfociti. Bar, 10 micron. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig3.jpg" /> Figura 3. Visualizzazione di granulomi polmonari e macrofagi attivati ​​alternativamente che circondano l&#39;uovo S.mansoni. A. Granuloma polmonare che circonda l&#39;uovo Sm (freccia nera) è stata visualizzata in H &amp; E-colorate sezioni polmonari. B. colorazione per immunofluorescenza RELMα (verde), recettore del mannosio (rosso) e DAPI (blu) rivela in alternativa macrofagi attivati ​​(freccia bianca) nel granuloma che circonda la autofluorescente Sm uovo (freccia nera). Bar, 50 pm. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3905/3905fig4.jpg" /> Figura 4. S.mansoni uovo antigene-specifica risposta delle citochine Th2. Drenante parathymic cellule linfonodi di topi naïve (N) o uova Sm-iniettata sono state stimolate con Sm &lt;/ Em&gt; antigene uovo per 72 ore, seguita da ELISA di supernatanti per IL-4, IL-5 e IL-13. Scala, ng / mL. * P &lt;0,05.

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<li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrotic+disease+and+the+T%28H%291%2FT%28H%292+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm.</a> Nat. Rev. Immunol. 4, 583-594 (2004).</li>
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</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Qui, un modello che impiega le uova Schistosoma mansoni di indurre l&#39;infiammazione polmonare di tipo 2 viene descritto. Tratti caratteristici di questo modello includono il potente risposta immunitaria Th2, infiammazione delle vie aeree e la formazione di granuloma polmonare. Dal momento che questi parametri dipendono le risposte delle cellule CD4 Th2 11, questo è un modello utile per studiare gli effetti delle cancellazioni proteine ​​specifiche o lineage-specifica sulle risposte delle cellule T...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Dimensione / Descrizione </td><td> Azienda </td><td> Catalogo # </td></tr><tr><td> Collagenasi / dispasi </td><td> 500 mg </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11 097 113 001 </td></tr><tr><td> Diff Quik Hema 3 Stain </td><td> Imballare </td><td> Fisher Scientific Co. LLC </td><td> 122-911 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Liquido </td><td> Gibco </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> Falcon 50mL </td><td> Imballare </td><td> Falco </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> Intramedic PE Tubi </td><td> 0,58 millimetri </td><td> Becton Dickinson and Co. </td><td> 427410 </td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td> 250 mL </td><td> Abate Animal Health </td><td> 52600405 </td></tr><tr><td> Ketamina </td><td> 100 mg / mL </td><td> Fort Dodge, la salute degli animali </td&gt; <td> N / A </td></tr><tr><td> Recettore anticorpo mannosio </td><td> Biotina </td><td> ABD Serotec </td><td> MCA2235B </td></tr><tr><td> Metallic Filtro </td><td> Cucina filtro standard </td><td> Obiettivo </td><td> Laurentiis </td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> 16% </td><td> Electron Microsc. Scienze </td><td> 15710 </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> 100x </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> 1 litro </td><td> GE Healthcare Biosciences </td><td> 17 01 0891 </td></tr><tr><td> Anticorpi RELMα </td><td> 50 ug </td><td> Peprotech </td><td> 500-P214 </td></tr><tr><td> Filo chirurgico </td><td> 2,0 USP 100 yds </td><td> Surgical Specialties Corp. </td><td> SP118 </td></tr><tr><td> Siringa con ago </td><td> 23G, 3/4 di pollice </td><td> BD Vacutainer Lab. Med. </td><td>305143 </td></tr><tr><td> USA Standard Testing Sieve </td><td> 150 pm, 0.0059 &quot; </td><td> WS Tyler, Inc. </td><td> ASTME-11, Spec. No. 100 </td></tr><tr><td> Xilazina </td><td> 20 mg / mL </td><td> Maggiordomo </td><td> N / A </td></tr></tbody></table>

con ovuli<em&gt; schistosoma mansoni</em&gt; come<em&gt; in vivo</em&gt; modello di elminti-indotta infiammazione polmonare

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Parassiti Schistosoma sono trematodi del sangue che infettano circa 200 milioni di persone in tutto il mondo 1. In infezione cronica con Schistosoma, la patologia grave, inclusa la fibrosi epatica e splenomegalia, è causata dalla risposta immunitaria alle uova di parassiti piuttosto che il parassita stesso 2. Uova Parasite indurre una risposta Th2 caratterizzata dalla produzione di IL-4, IL-5 e IL-13, l&#39;attivazione dei macrofagi alternativa e il reclutamento di eosinofili. Qui, descriviamo l&#39;iniezione di uova di Schistosoma mansoni come un modello per esaminare parassita risposte specifiche citochine Th2 nei polmoni e dei linfonodi drenanti, la formazione di granulomi polmonari che circondano l&#39;uovo e l&#39;infiammazione delle vie aeree. Dopo sensibilizzazione intraperitoneale e sfida endovenosa, S. mansoni uova vengono trasportati al polmone attraverso le arterie polmonari in cui sono intrappolati all&#39;interno del parenchima polmonareda granulomi composti da linfociti, eosinofili e macrofagi attivati ​​alternativamente 3-6. Associata alla formazione di granulomi, infiammazione nelle bronco-alveolari spazi, l&#39;espansione dei linfonodi drenanti e l&#39;attivazione delle cellule T CD4 si può osservare. Qui dettaglio il protocollo per isolare le uova Schistosoma mansoni da fegati infettati (modificato da 7), la sensibilizzazione e sfidando i topi, e il recupero degli organi (lavaggio bronco-alveolare (BAL), del polmone e linfonodi drenanti) per l&#39;analisi. Abbiamo anche istologico dati rappresentativi e immunologici e suggerimenti per l&#39;analisi immunologica aggiuntivo. In generale, questo metodo fornisce un modello in vivo per indagare elminti indotte risposte immunologiche nel polmone, che è ampiamente applicabile allo studio di Th2 malattie infiammatorie comprese le infezioni elminti, malattie fibrotiche, infiammazione allergica e asma. I vantaggi di questo modello per lo studio del tip2 e infiammazione nel polmone includono la riproducibilità di una potente risposta infiammatoria Th2 nei polmoni e linfonodi drenanti, la facilità di valutazione di infiammazione mediante esame istologico dei granulomi circondano l&#39;uovo, e il potenziale di conservazione a lungo termine del parassita uova.

Schistosoma mansoni uova sono potenti stimolatori del T helper di tipo 2 (Th2) risposta immunitaria, caratteristica di infezioni parassitarie, asma e infiammazione allergica. Questo protocollo utilizza S. mansoni uovo iniezione per generare un CD4 Th2 citochine indotta da risposta infiammatoria nel polmone, caratterizzata dalla formazione di granulomi intorno al polmone l&#39;uovo, eosinofilia e l&#39;attivazione dei macrofagi alternative.

Con ovuli<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Come<em&gt; In vivo</em&gt; Modello di elminti-indotta infiammazione polmonare

I parassiti dello Schistosoma sono trematodi del sangue che infettano circa 200 milioni di persone in tutto il mondo 1. Nell'infezione cronica da Schistosoma, la grave ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare l'infiammazione polmonare e le risposte delle cellule immunitarie. Questo viene ottenuto purificando uova di elminti da fegati infettati da shta. Come secondo passo, i topi vengono immunizzati e sottoposti a sfida con uova purificate, inducendo così una marcata risposta infiammatoria polmonare.Successivamente, i polmoni e gli organi linfoidi drenanti dei topi vengono isolati al fine di valutare l'entità della risposta infiammatoria all'elmetto. I risultati ottenuti mostrano una marcata infiammazione polmonare indotta dall'elmetto, basata sul reclutamento di cellule infiammatorie nei polmoni e sull'osservazione della patologia polmonare indotta dalle uova. In generale, le persone alle prime armi con questa tecnica incontreranno qualche difficoltà poiché è necessaria una certa precisione nella dissezione dei polmoni e dei linfonodi, nonché nell'iniezione delle uova.Tuttavia, padroneggiare questa tecnica è vantaggioso perché consente la visualizzazione di una potente risposta infiammatoria polmonare alle uova di helmuth. A dimostrare la tecnica sono Karen e Will, tecnici del laboratorio di Nyer e Greenberg. Posizionare un topo eutanasizzato, precedentemente infettato con Schistosoma circ, supino e praticare un'incisione attraverso la cute per esporre il peritoneo; asportare il fegato, situato al di sotto della gabbia toracica e del diaframma; tritare finemente i fegati e aggiungere 20 millilitri per fegato di miscela digestiva, costituita da collagenasi, dys, base, penicillina e streptomicina in PBS. Versare questa miscela in un tubo Falcon da 50 millilitri e incubare tutta la notte in un agitatore a 37 gradi Celsius.Il giorno successivo. Centrifugare la miscela. Versare il liquido in eccesso e riempire il tubo con PBS, quindi centrifugare nuovamente e ripetere il lavaggio con PBS dopo l'ultima centrifugazione.Risospendere il pellet in 25 millilitri di PBS. Successivamente, filtrare il pellet risospeso attraverso un colino metallico, seguito da un passaggio attraverso un setaccio. Collocare la miscela filtrata in un tubo Falcon da 50 millilitri e centrifugare.Versare il soprannatante e risospendere. Sospendere il pellet in tre millilitri di PBS. Sovrapporre delicatamente la miscela su un gradiente di 40 millilitri composto da otto millilitri per cellula e 32 millilitri di saccarosio 0,25 M e centrifugare per 10 minuti a 800 ×g a 20 °C.Successivamente, scartare il livello superiore di cellule epatiche utilizzando una pipetta trasferibile. Rimuovere il pellet di uovo presente sul fondo e collocarlo in un tubo falcon da 50 millilitri. Lavare il pellet tre volte con 10 millilitri di PBS contenente un EDTA e EGTA e centrifugare.Risospendere il pellet in 500 microlitri di PBS. Sovrapporre questa miscela su un nuovo gradiente di 10 millilitri contenente 2,5 millilitri di per cellula e 7,5 millilitri di saccarosio 0,25 molare e centrifugare. Lavare il pellet tre volte in 10 millilitri.PBS e centrifuga. Assicurarsi che il tubo Falcon sia ben miscelato e prelevare 50 microlitri dall'ultimo lavaggio. Per contare le uova, diluire i 50 microlitri.Mescolare con 450 microlitri di PBS e aggiungere 100 microlitri di questa miscela su un vetrino posizionato sullo stage di un microscopio stereoscopico per contare le gocce; risospendere le uova a 50.000 uova per millilitro in PBS. Le uova possono essere conservate per diversi mesi a meno 80 gradi Celsius e scongelate una o due volte per l'uso. Prima dell'uso, ispezionare le uova al microscopio per assicurarsi che siano ancora integre in un tubo da 5 millilitri con tappo a vite.Preparare le uova a 5.000 uova per 100 microlitri di PBS per iniezione. Stimare il 50% in più di uova rispetto al necessario. Caricare un ago da 23 gauge, lungo cinque ottavi di pollice, e una siringa da un millilitro con 100 microlitri di sospensione di uova per topo.Muovere avanti e indietro la siringa per mescolare le uova prima di ogni iniezione ed iniettare 100 microlitri di sospensione per topo per via intraperitoneale al giorno 14 dopo la sensibilizzazione. Preparare le uova come in precedenza a 5.000 uova per 100 microlitri e caricare una siringa da un millilitro e un ago da 23 gauge con le uova. Utilizzare pinze per piegare l'ago ad un angolo di 90 gradi e assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria.Anestetizzare il topo e posizionarlo su un fianco. Iniettare 100 microlitri di sospensione nei vasi dietro l'occhio con un angolo di 45 gradi rispetto al naso. Otto giorni dopo la somministrazione endovenosa, eutanasia il topo ed effettuare una piccola incisione nella pelle dell'addome.Aprire la parete peritoneale e individuare l'aorta addominale. Recidere l'aorta per prelevare il sangue con una pipetta di Pasteur e conservarlo sul ghiaccio. Spostare il fegato verso il basso per esporre il diaframma.Utilizzare forbici fini per tagliare il diaframma e tagliare con attenzione. Aprire la gabbia toracica per esporre il tessuto polmonare. I linfonodi paratimici si trovano al di sotto della gabbia toracica, sopra i polmoni e su entrambi i lati del timo.Recuperare i linfonodi con pinzette fini e conservarli sul ghiaccio in un millilitro di mezzo sterile. Per iniziare la procedura di intubazione, spostare le ghiandole salivari lateralmente per esporre la trachea. Posizionare una pinzetta fine sotto la trachea e utilizzare forbici fini.Praticare un foro nella parte centrale della trachea e inserire un tubicino nei polmoni. Fissare il tubicino legandolo con filo chirurgico. A questo punto collegare al tubicino una siringa da un millilitro riempita con PBS ed espandere i polmoni con un millilitro di PBS.Recuperare con attenzione il lavaggio BAL con la siringa e conservarlo sul ghiaccio. Successivamente, collegare una siringa da un millilitro riempita con paraformaldeide al 4% in PBS al tubo e gonfiare i polmoni. Quindi rimuovere il tubo e stringere il filo chirurgico per evitare che la PFA fuoriesca.Infine, dissezionare con attenzione il tessuto polmonare e collocarlo in una provetta falcon da 50 millilitri contenente cinque millilitri di PFA al 4% in PBS. Dopo un'incubazione da 0,5 a due ore su ghiaccio, centrifugare il sangue raccolto per separare il surnatante sieroso, che può essere utilizzato per saggi ELISA specifici per l'isotipo IgG contro l'antigene dell'uovo di S. mansoni. I linfonodi parassitici escissi possono essere ri-stimolati con l'antigene dell'uovo di S. mansoni per analizzare le citochine TH2 specifiche per l'antigene. Dopo centrifugazione e formazione del pellet cellulare, recuperare il liquido BAL per l'analisi delle citochine TH2 mediante ELISA. Le cellule BAL vengono recuperate per la preparazione citocentrifugata.Tessuto polmonare fissato durante la notte per lisi istologica e immunofluorescenza: qui sono mostrate immagini di fegati granulomatosi, caratteristici di un elevato carico di uova di esman. Sono inoltre raffigurate uova di esman. Questa figura rappresenta l'infiammazione delle vie aeree indotta dall'iniezione di uova di essman sooni.Il grafico a sinistra mostra che il numero di cellule nel lavaggio broncoalveolare è molto più elevato nei topi inoculati con uova di s mansoni rispetto ai topi naïve. Le immagini a sinistra sono rappresentative della citocentrifuga. In queste si possono chiaramente visualizzare i preparati delle cellule del lavaggio broncoalveolare e l'infiltrato infiammatorio composto da macrofagi, eosinofili e linfociti.Un granuloma polmonare che circonda l'uovo di esson è mostrato in una sezione polmonare colorata con ematossilina ed eosina (H&E). Questa immagine mostra la colorazione immunofluorescente per realm alpha, in verde. Il recettore mano, in rosso, e il colorante DPI, in blu, rivelano macrofagi attivati in modo alternativo, indicati dalla freccia bianca.La risposta citochinica di tipo TH2 specifica per l'antigene dell'uovo di S. mansoni nei linfonodi parac ai topi naïve e ai topi inoculati con S. mansoni è mostrata qui. Le cellule dei linfonodi di ciascun gruppo sono state stimolate con antigene dell'uovo di S. mansoni per 72 ore. Successivamente, è stata eseguita una ELISA del sopranatante per IL-4, IL-5 e IL-13.Le concentrazioni di tutte e tre le citochine infiammatorie erano molto più elevate nei topi iniettati con esman dopo il suo sviluppo. Questa tecnica fornisce un metodo semplice per i ricercatori nel campo delle allergie e delle infezioni da helmet per studiare le cellule immunitarie reclutate in risposta all'infezione da helmet parassitari e all'allergia in un organismo modello murino.

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