Imaging multimodale impianto di cellule staminali nel sistema nervoso centrale di topi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere un follow-up standardizzato nel comportamento in vivo delle cellule staminali trapiantate nel cervello del topo. Ciò si ottiene marcando prima le cellule stromali derivate dal midollo osseo, che co-esprimono EGFP e luciferasi con particelle di ossido di ferro fluorescenti di dimensioni micron. Il secondo passo consiste nell'iniettare in modo appropriato i BMC marcati con MPIO nel tessuto cerebrale del topo.

Successivamente, la sopravvivenza e la localizzazione degli innesti cellulari vengono seguite in modo non invasivo utilizzando l'imaging a bioluminescenza e la risonanza magnetica. Il passaggio finale consiste nel convalidare i risultati dell'imaging in vivo utilizzando l'analisi istologica post mortem. Questi metodi possono fornire informazioni sul comportamento delle cellule staminali dopo il trapianto nel cervello del topo, ma possono anche essere applicati ad altri sistemi come organismi modello e studi su una malattia.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di manipolazione degli animali sono difficili da apprendere perché le iniezioni endovenose e intracerebrali sono difficili da eseguire e contengono alcuni rischi per la sopravvivenza degli animali. Per iniziare questa procedura, aggiungere 75 volte 10 alle sei particelle di ossido di ferro blu glaciale di dimensioni micron a una coltura cellulare in crescita subconfluente. Incubarli per altre 16 ore per consentire l'assorbimento delle particelle tramite endocitosi, quindi lavare via le particelle rimanenti.

Lasciare che le cellule crescano per altre 24 ore per ottenere la cofluenza cellulare e la distribuzione omogenea del G-B-M-P-I-O. Successivamente, utilizzare la microscopia a fluorescenza per convalidare visivamente l'assorbimento delle particelle calcolando il rapporto tra le cellule EGFP positive e G-B-M-P-I-O e la quantità totale di cellule EGFP positive. Quindi, lavare due volte le cellule G-B-M-P-I-O, marcate con BMSC luciferasi EGFP con 10 millilitri.

I PBS trattano le cellule con tripsina EDTA e le raccolgono successivamente. Ricompensa, quindi lavare le cellule e risospenderle a una concentrazione finale di 133 volte 10 al sesto di cellule per millilitro in PBS. Infine, mantieni le cellule sul ghiaccio fino al trapianto.

In questa procedura, anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale della miscela di ketamina a 80 milligrammi per chilogrammo e xilazina a 16 milligrammi per chilogrammo. Attendi cinque minuti che il topo si addormenti, quindi rasa la testa per consentire manipolazioni sterili. Quindi posiziona il mouse in una cornice stereotassica, disinfetta la pelle con alcol.

Dopodiché, applica un unguento sugli occhi Per prevenire la disidratazione. Praticare un'incisione del cuoio capelluto sulla linea mediana per esporre il cranio al fine di colpire l'ippocampo. Praticare un foro nel cranio a due millimetri posteriormente e due millimetri lateralmente utilizzando una fresa per trapano dentale.

A questo punto, agitare brevemente la sospensione cellulare, quindi aspirare la sospensione cellulare nella siringa. Successivamente abbassare la siringa dell'ago a una profondità di 2,5 millimetri sotto la dura madre e lasciare che la pressione si equilibri per un minuto. Dopo un minuto, ritrarre l'ago in una posizione di due millimetri sotto la dura dura.

Quindi iniettare tre microlitri di sospensione cellulare utilizzando una pompa di microiniezione automatizzata alla velocità di 0,70 microlitri al minuto. Dopo l'iniezione, attendere altri cinque minuti per evitare il riflusso della sospensione cellulare iniettata. Quindi, ritrarre lentamente l'ago.

Successivamente, disinfettare i bordi della pelle, quindi suturare la pelle. Iniettare 300 microlitri di soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% per via sottocutanea per prevenire la disidratazione. Al termine, posizionare il mouse sotto una lampada riscaldante per consentire il recupero dall'anestesia per eseguire l'imaging a bioluminescenza.

Anestetizzare il topo con una miscela di 3% di iso, fluoro e ossigeno. Quindi posizionare il mouse nell'imager fotonico. Ridurre il livello di anestesia regolando l'isof fluoro all'1,5% Successivamente, iniettare d Lucifer per via endovenosa a 150 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo.

Acquisisci l'immagine per cinque minuti utilizzando il software di visione fotografica. Successivamente, eseguire l'elaborazione delle immagini utilizzando il software di visione M three e quantificare il segnale osservato utilizzando regioni fisse di interesse. Per eseguire la risonanza magnetica, anestetizzare il topo con fluoro ISO al 3% in una miscela di ossigeno e ossido nitrico.

Quindi posizionare il mouse nel sistema di ritenuta di un sistema RM orizzontale da 9,4 Tesla. Ridurre il livello di anestesia regolando l'isof fluoro all'1%Successivamente, applicare un unguento sugli occhi del topo per prevenire la disidratazione. Successivamente, utilizzare una sonda rettale per monitorare la temperatura corporea.

Quindi posizionare un sensore sotto la pancia del topo per monitorare la frequenza respiratoria. Mantenere la frequenza respiratoria a 110 più o meno 10 volte al minuto e mantenere la temperatura corporea costante entro un intervallo ristretto di 37 più o meno 0,5 gradi Celsius. Quindi posizionare la bobina RF di superficie sopra la testa del mouse.

Posiziona il mouse al centro del magnete. Aprire ParaVision 5.1 Impostare i parametri di sequenza in base al manoscritto allegato. Quindi acquisire un set di 10 immagini di eco di spin pesate T coronali a due al fine di ottenere informazioni anatomiche specifiche.

NT due immagini di eco a gradiente pesate a stella per studiare la migrazione delle cellule staminali con una risoluzione di 70 micrometri quadrati. In questo passaggio, sacrifica il topo e rimuovi il cervello. Fissare il tessuto cerebrale a temperatura ambiente in paraldeide al 4% in PBS per due ore.

Dopo due ore. Disidratare il tessuto cerebrale ponendolo in diversi gradienti di saccarosio a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, congelare il tessuto cerebrale utilizzando azoto fluido e conservare il tessuto a meno 80 gradi Celsius fino al sezionamento quando è pronto.

Sezionare il tessuto cerebrale in sezioni spesse 10 micrometri utilizzando un criostato. Successivamente, sotto un microscopio a fluorescenza, esamina le sezioni criogeniche non colorate per la fluorescenza blu dalle particelle G-B-M-P-I-O e la fluorescenza verde dalle cellule che esprimono EGFP. Quindi esaminare le sezioni criogeniche non colorate per la fluorescenza di fondo verde rosso dalle cellule infiammatorie.

La procedura di marcatura MPIO blu glaciale descritta consente di marcare in modo altamente efficiente le cellule BMSC, luciferasi EGFP, che possono essere facilmente convalidate mediante microscopia a fluorescenza. Successivamente, dopo l'innesto di cellule G-B-M-P-I-O, marcate BMSC, luciferasi EGFP nel SNC dei topi, la sopravvivenza del trapianto cellulare può essere monitorata mediante imaging a bioluminescenza in vivo basato sull'attività della luciferasi. Inoltre, l'esatta localizzazione delle cellule innestate può essere monitorata mediante risonanza magnetica in vivo basata sul contenuto di ferro dell'MPIO blu glaciale.

Infine, l'analisi istologica mostra la validazione dei risultati ottenuti mediante imaging a bioluminescenza e risonanza magnetica. La sopravvivenza stabile è stata confermata da un'espressione stabile di EGFP nel tempo dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'imaging molecolare per esplorare gli eventi cellulari e molecolari dopo il trapianto di cellule staminali in diversi modelli animali per le malattie neurodegenerative.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'imaging molecolare, applicare la bioluminescenza e la risonanza magnetica e convalidare adeguatamente i risultati in vivo utilizzando la valutazione istologica post mortem.