Purificazione e visualizzazione di lipopolisaccaride da batteri Gram-negativi da Hot acquosa-fenolo di estrazione

L'obiettivo generale di questa procedura è estrarre il LPS da batteri Gram-negativi. Questo viene ottenuto innanzitutto coltivando una coltura di cinque millilitri di batteri in un mezzo appropriato per tutta la notte e regolando la coltura a una densità ottica a 600 nanometri di 0,5. Successivamente, i batteri vengono pellettizzati mediante microcentrifugazione e le cellule vengono risospese in un buffer tris contenente SDS e beam o etanolo capto.

Quindi i lisati cellulari vengono bolliti e trattati con proteasi e nucleasi. Infine, vengono effettuate due estrazioni sequenziali con fenolo acquoso caldo ed etere dietilico, rimuovendo con cura e conservando lo strato acquoso blu. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano la quantità e la presenza o assenza di LPS e ceppi batterici, nonché la modalità della lunghezza della catena dell'antigene O, mediante separazione tramite elettroforesi SDS-PAGE e analisi western blot con anticorpi specifici per LPS o colorazione diretta dei polisaccaridi nel gel.

Il vantaggio di questa tecnica rispetto al trattamento con proteasi di Hitchcock e Brown è che questo metodo consente di ottenere campioni di LPS puri che possono essere meglio risolti mediante elettroforesi SDS-PAGE e immunoblotting. Questo metodo può fornire informazioni sulla sintesi e regolazione del lipopolisaccaride in VIR in praticamente qualsiasi batterio gram-negativo, inclusi e coli e salmonella, nonché in agenti patogeni per la difesa biologica e patogeni emergenti come rispettivamente Ella e Acetobacter. Per coltivare i batteri, preparare una coltura notturna di batteri gram-negativi in cinque millilitri di terreno LB integrato con antibiotici.

Se necessario, coltivare la cultura durante la notte in un incubatore sotto agitazione a 200 giri al minuto e a 37 gradi Celsius. Diluire la cultura in LB di uno a dieci e misurare quindi la densità ottica a 600 nanometri in base al risultato ottenuto. Preparare una sospensione di 1,5 millilitri di batteri con una densità ottica finale a 600 nanometri pari a 0,5.

Centrifugare i batteri in una microcentrifuga a 10.600 ×g per 10 minuti. Rimuovere quindi e scartare il soprannatante. Per estrarre il LPS, preparare le seguenti soluzioni: un buffer XSDS, 4% beta-mercaptoetanolo o BME 4% SDS e 20% glicerolo in Tris-HCl 0,1 M, pH 6,8, con una traccia di blu di bromofenolo e soluzioni da 10 milligrammi per millilitro di DNAasi, RNasi e proteinasi K in acqua distillata sterile per la risospensione.

I batteri in pellet in 200 microlitri di buffer XSDS vengono completamente risospesi mediante pipettaggio della soluzione su e giù. Far bollire lentamente i batteri sospesi in un bagno d'acqua per 15 minuti. Successivamente, lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente per 15 minuti.

Come passaggio facoltativo, aggiungere cinque microlitri di ciascuna delle soluzioni di DNA uno e di RNA e incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Aggiungere 10 microlitri della soluzione di proteasi K e incubare i campioni a 59 gradi Celsius per tre ore. Accanto a ciascun campione, aggiungere 200 microlitri di fenolo saturo in tris freddo di ghiaccio.

Chiudere bene i tappi e vorticare ogni provetta per cinque-dieci secondi. Incubare i campioni a 65 gradi Celsius per 15 minuti. Durante la vortichazione, raffreddarli occasionalmente a temperatura ambiente.

Quindi, sotto cappa, aggiungere un millilitro di etere etilico a temperatura ambiente a ciascun campione e vortexare per cinque-dieci secondi. Centrifugare i campioni a 20.600 ×g per 10 minuti ed estrarli con attenzione dalla centrifuga. Prelevare lo strato inferiore blu da ciascun campione, evitando lo strato superiore limpido.

Aggiungere ulteriori 200 microlitri di tris freddo di ghiaccio, fenolo saturo con tris, e ripetere l'estrazione in ogni provetta. Aggiungere 200 microlitri di buffer 2X SDS. Separare da cinque a 15 microlitri di ogni campione di LPS su gel di poliacrilamide SDS all'8-15%.

Qui è mostrato un gel elettroforetico SDS-PAGE al 12% di campioni di LPS preparati da diversi ceppi di bur cold area de losa, isolati da campioni di espettorato di pazienti affetti da fibrosi cistica. I diversi profili di bande riflettono il diverso numero di unità ripetitive dell'antigene O legate agli oligosaccaridi centrali. Un numero simile di unità ripetitive è osservabile nei campioni uno e sei.

Non dimenticare che lavorare con fenolo dathil etere può essere pericoloso; è necessario adottare precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale, ad esempio camice da laboratorio, guanti e occhiali protettivi, e tali esperimenti devono essere eseguiti in una cappa aspirante durante il tentativo di questa procedura. È importante eseguire le estrazioni rapidamente per evitare di perdere i campioni durante l'elaborazione. Dopo questa procedura, devono essere eseguiti un'immunoblotting Western o altri metodi per visualizzare il lipopolisaccaride mediante colorazione argentica STR o altre tecniche, al fine di osservare la relazione tra i ceppi.