Purificazione e visualizzazione di lipopolisaccaride da batteri Gram-negativi da Hot acquosa-fenolo di estrazione

L'obiettivo generale di questa procedura è estrarre LPS dai batteri Gram-negativi. Ciò si ottiene coltivando prima una coltura notturna di batteri da cinque millilitri in un terreno appropriato e regolando la coltura a una densità ottica a 600 nanometri di 0,5. Successivamente, i batteri vengono pellettati mediante microcentrifugazione e le cellule vengono risospese in un tampone tris contenente SDS e fascio o capto etanolo.

Quindi i lisati cellulari vengono bolliti e trattati con proteasi e nucleasi. Infine, vengono effettuate due estrazioni sequenziali con fenolo acquoso caldo e dyl etere per rimuovere e trattenere con cura lo strato acquoso blu. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano la quantità, la presenza o l'assenza di LPS e ceppi di batteri, nonché la modalità di lunghezza della catena dell'antigene O attraverso la separazione mediante SDS page e analisi del sangue occidentale con anticorpi specifici per LPS o colorazione diretta dei polisaccaridi nel gel.

Il vantaggio di questa tecnica rispetto al trattamento con proteasi di Hitchcock e Brown è che questa tecnica porta a campioni di LPS puri che possono essere risolti meglio mediante SDS page e western blotting. Questo metodo può fornire informazioni sulla sintesi e la regolazione del lipopolisaccaride in VIR praticamente in qualsiasi batterio gram-negativo, tra cui E coli e salmonella, nonché nella biodifesa e nei patogeni emergenti come Ella e Acetobacter rispettivamente per far crescere i batteri. Per l'estrazione dell'LPS, impostare una coltura notturna di batteri gram-negativi in cinque millilitri di LB integrata con antibiotici.

Se necessario, coltiva la coltura durante la notte in un'incubatrice vibrante a 200 giri/min e 37 gradi Celsius. Utilizzare LB per diluire la coltura da uno a 10, quindi misurare la densità ottica a 600 nanometri in base al risultato. Preparare una sospensione di 1,5 millilitri di batteri con una densità ottica finale a 600 nanometri di 0,5.

Pellettare i batteri in una microcentrifuga a 10, 600 volte G per 10 minuti. Quindi rimuovere e scartare il surnatante. Per estrarre l'LPS preparare le seguenti soluzioni, un tampone XSDS, etanolo al 4% betta me capto o BME 4% SDS e glicerolo al 20% in tris molare 0,1 HCL pH 6,8 con un pizzico di blu di bromo fenolo e soluzioni di 10 milligrammi per millilitro di DNA un RNA e proteinasi K in risospensione sterile in acqua distillata.

I batteri pellettati in 200 microlitri di un tampone XSDS assicurano che il pellet venga completamente risospeso pipettando la soluzione su e giù. Far bollire lentamente i batteri sospesi a bagnomaria per 15 minuti. Quindi lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente per 15 minuti.

Come passaggio facoltativo, aggiungere cinque microlitri di ciascuna delle soluzioni di DNA e RNA e incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Aggiungere 10 microlitri della soluzione di proteasi K e incubare i campioni a 59 gradi Celsius per tre ore. Accanto a ogni campione, aggiungere 200 microlitri di tris ghiacciato, fenolo saturo.

Chiudere bene i tappi e agitare ogni tubo per cinque-10 secondi. Incubare i campioni a 65 gradi Celsius per 15 minuti. Vorticandoli, raffreddarli di tanto in tanto a temperatura ambiente.

Quindi, sotto una cappa aspirante, aggiungere un millilitro di etere etilico a temperatura ambiente a ciascun campione e agitare per cinque-10 secondi. Centrifugare i campioni a 20, 600 volte G per 10 minuti e rimuoverli con cura dalla centrifuga. Estrarre lo strato blu inferiore da ogni campione, evitando lo strato superiore trasparente.

Aggiungere altri 200 microlitri di tris ghiacciato, fenolo saturo e ripetere l'estrazione in ogni tubo. Aggiungere 200 microlitri di due tamponi XSDS. Separare da cinque a 15 microlitri di ciascun campione LPS su gel di poliacrilammide SDS dall'8 al 15%.

Qui è mostrato un gel di pagina SDS al 12% di campioni di LPS preparati da diversi ceppi di frese cold area de losa, isolati da campioni di espettorato di pazienti con fibrosi cistica. I diversi modelli di bande riflettono i diversi numeri di antigene O, unità ripetute attaccate agli oligosaccaridi core. Un numero simile di unità ripetute può essere visto nei campioni uno e sei.

Non dimenticare che lavorare con l'etere fenolico datilico può essere pericoloso con precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale come camice da laboratorio, guanti e occhiali protettivi e questi esperimenti devono essere eseguiti in una cappa aspirante mentre si tenta questa procedura. È importante eseguire le estrazioni rapidamente in modo da non perdere i campioni durante l'elaborazione. Seguendo questa procedura, è necessario eseguire l'immunoblotting occidentale o metodi per visualizzare il polisaccaride lipo mediante silver STR o altri metodi per visualizzare la parentela tra i ceppi.