Name: Purificazione e visualizzazione di lipopolisaccaride da batteri Gram-negativi da Hot acquosa-fenolo di estrazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Impara a purificare il lipopolisaccaride da batteri Gram-negativi mediante estrazione con fenolo acquoso caldo. Questo metodo consente l'analisi tramite SDS-PAGE e Western blot per studi immunologici.

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Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni da parte del National Institutes of Health e dalla Fondazione Fibrosi Cistica.

1. Preparazione di batteri per l&#39;estrazione LPS <ol><li> Avviare una cultura pernottamento in 5 ml di Luria Broth (LB), integrato con antibiotici se necessario. Grow coltura durante la notte (12-18 ore) in un incubatore agitazione a 37 ° C e 200 rpm. </li><li> Diluire il 01:10 cultura con LB e prendere un 600 lettura OD in uno spettrofotometro. Sulla base della lettura 600 OD, una sospensione 1,5 mL dei batteri ad una OD 600 di 0,5. </li><li> Pellet i batteri in una microcentrifuga a 10.600 xg per 10 minuti. Rimuovere e scartare il surnatante. Il pellet può essere conservato a -20 ° C, se LPS non sta per essere estratto immediatamente. </li></ol> 2. Estrazione di LPS <ol><li> In primo luogo, preparare 2x tampone SDS. Effettuare una soluzione di 50 mL del 4% β-mercaptoetanolo (BME), 4% SDS e 20% glicerolo in 0,1 M Tris-HCl, pH 6,8. Aggiungere un pizzico di blu di bromofenolo per tingere la soluzione. Fai una SDS-buffer 1x magazzino diluendo 2X stock 1:1 in sterile distillata H 2 O. Questo può essere conservato a temperatura ambiente. </li><li> Fare tre distinti a 10 mg / mL soluzioni di DNasi, RNasi e proteinasi K in sterile distillata H 2 O. </li><li> Risospendere i batteri pellet a partire dal punto 1,3 in 200 microlitri di 1x SDS-buffer. Assicurarsi che il pellet è completamente risospeso pipettando la soluzione su e giù lentamente. Non vortice. </li><li> Lessare i batteri in sospensione in un bagnomaria per 15 minuti. Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente per 15 minuti. </li><li> Aggiungere 5 microlitri di entrambi I DNasi RNasi e soluzioni preparate in 2.2. Incubare i campioni a 37 ° C per 30 minuti. * Questo passaggio è facoltativo, c&#39;è minima differenza nella qualità di LPS tra campioni nucleasi trattati e non trattati. </li><li> Aggiungere 10 pl di soluzione di proteinasi K preparata in 2,2. Incubare i campioni a 59 ° C per 3 ore. Questa fase può essere eseguita durante la notte, se ci sono vincoli di tempo. </li><li> Per ogni annuncio campione,d 200 pl di ghiacciato Tris-fenolo saturo (acqua-fenolo saturo può essere utilizzato come sostituto se Tris-fenolo saturo non è disponibile). Assicurarsi che i tappi sui tubi sono chiuse ermeticamente, e vortex ogni campione per circa 5 a 10 secondi. </li><li> Incubare i campioni a 65 ° C per 15 minuti, vortex occasionalmente. Dopo incubazione raffreddare a temperatura ambiente, poi aggiungere 1 ml di temperatura ambiente etere dietilico per ciascun campione e vortex per 5 a 10 secondi. Assicurarsi di eseguire etere manico in una cappa aspirante, in quanto è volatile. </li><li> Centrifugare i campioni a 20600 x g per 10 minuti. Rimuovere con cautela i campioni dalla centrifuga ed estrarre lo strato di fondo blu. Essere sicuri di evitare la parte superiore, strato trasparente. Lasciando una piccola quantità dello strato blu è preferibile contaminazione con lo strato superiore. </li><li> Ri-estrarre i campioni ripetendo i punti da 2,7-2,9. Due estrazioni sono di solito sufficienti. Se i campioni appaiono nuvoloso, più estrazioni può essere Effettuared. Aggiungere 200 pl di 2x SDS-buffer per ciascuno dei campioni estratti prima separazione mediante SDS-PAGE. I campioni possono essere eseguiti su 8% -15% SDS-poliacrilammide gel. Cinque a quindici microlitri di LPS preparate utilizzando questo metodo è di solito sufficiente per la visualizzazione. </li></ol> 3. Risultati rappresentativi LPS campioni preparati come sopra può essere visualizzato mediante colorazione diretta dopo la separazione su SDS-PAGE usando uno standard di argento o di un protocollo di colorazione disponibile in commercio kit di colorazione LPS. In alternativa, LPS separati su un gel di poliacrilammide può essere trasferita ad una membrana di nitrocellulosa e sottoposto a Western immunoblotting usando LPS-specifici anti-sieri. Per questo protocollo, abbiamo usato il Pro-Q Emerald 300 Kit Gel Stain Lipopolisaccaride (Molecular Probes), e seguito le istruzioni del produttore. In figura 1 è una Pro-Q Emerald 300 tinto 12% SDS-gel di poliacrilammide. Ciascuna corsia contiene 15 pl di LPS preparati da DIFdifferenti ceppi di Burkholderia dolosa isolati da campioni di espettorato di pazienti affetti da fibrosi cistica. Differenti modelli di LPS banding scala, riflettenti di numeri diversi O-antigene unità ripetitive attaccato al centro oligosaccaride, sono evidenti con questo metodo, ad esempio, campioni in corsia 1 e 6 sono simili schemi bande tra loro (scatolato in rosso). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3916/3916fig1.jpg" /> Figura 1. Pro-Q Emerald 300 LPS macchiate da Burkholderia dolosa isolati clinici. LPS di sette B. ceppi dolosa di un focolaio in pazienti affetti da fibrosi cistica sono stati isolati come descritto in questo protocollo. Quindici pl sono stati separati su un 12% SDS-gel di poliacrilammide, e colorate con Pro-Q Emerald 300, secondo le istruzioni del produttore. LPS nucleo è indicata una freccia, e LPS che mostrano modelli simili bande di O-antigene ripetizioni sono boxed in rosso. M = marcatore di peso molecolare.

<ol><li>Raetz, C. R., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+endotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide endotoxins.</a> Annu. Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).</li>
<li>Valvano, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Export+of+O-specific+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Export of O-specific lipopolysaccharide.</a> Front. Biosci. 8, 452-471 (2003).</li>
<li>Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide%3A+a+major+virulence+factor%2C+initiator+of+inflammation+and+target+for+effective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide: a major virulence factor, initiator of inflammation and target for effective immunity.</a> Int. J. Med. Microbiol. 297, 277-295 (2007).</li>
<li>Freudenberg, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+lipopolysaccharide+susceptibility+in+the+innate+immune+response+to+Salmonella+typhimurium+infection%3A+LPS%2C+a+primary+target+for+recognition+of+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Role of lipopolysaccharide susceptibility in the innate immune response to Salmonella typhimurium infection: LPS, a primary target for recognition of Gram-negative bacteria.</a> Microbes Infect. 3, 1213-1222 (2001).</li>
<li>Jann, K., Jann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharide+antigens+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Polysaccharide antigens of Escherichia coli.</a> Rev. Infect. Dis. 9, Suppl 5. S517-S526 (1987).</li>
<li>McCallum, K. L., Schoenhals, G., Laakso, D., Clarke, B., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-molecular-weight+fraction+of+smooth+lipopolysaccharide+in+Klebsiella+serotype+O1%3AK20+contains+a+unique+O-antigen+epitope+and+determines+resistance+to+nonspecific+serum+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">A high-molecular-weight fraction of smooth lipopolysaccharide in Klebsiella serotype O1:K20 contains a unique O-antigen epitope and determines resistance to nonspecific serum killing.</a> Infect. Immun. 57, 3816-3822 (1989).</li>
<li>Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+isolates+from+patients+with+cystic+fibrosis%3A+a+class+of+serum-sensitive%2C+nontypable+strains+deficient+in+lipopolysaccharide+O+side+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis: a class of serum-sensitive, nontypable strains deficient in lipopolysaccharide O side chains.</a> Infect. Immun. 42, 170-177 (1983).</li>
<li>Gupta, S. K., Masinick, S., Garrett, M., Hazlett, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide+binds+galectin-3+and+other+human+corneal+epithelial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide binds galectin-3 and other human corneal epithelial proteins.</a> Infect. Immun. 65, 2747-2753 (1997).</li>
<li>Hitchcock, P. J., Brown, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+heterogeneity+among+Salmonella+lipopolysaccharide+chemotypes+in+silver-stained+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels.</a> J. Bacteriol. 154, 269-277 (1983).</li>
<li>Westphal, O., Jann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+lipopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Carbohyr.+Chem%22%5BJournal%5D)">Bacterial lipopolysaccharides.</a> Methods Carbohyr. Chem. 5, 83(1965).</li>
<li>Lieberman, T. D. Parallel bacterial evolution within multiple patients ties novel genes to pathogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLieberman%2C+TD+%22Nat+Genet%22">Nat Genet</a>. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Abbiamo descritto un metodo di purificazione LPS lontano dagli altri componenti cellulari, tra cui gli acidi nucleici e proteine. Questo metodo consente di alta qualità LPS che possono essere utilizzati in un certo numero di metodi di visualizzazione differenti, compresa la colorazione carboidrati di SDS-PAGE gel, come mostrato nella Figura 1. Questo metodo può essere utilizzato per sierotipo LPS da una varietà di ceppi, utilizzando specifici anti-sieri, o per mostrare connessione tra isolati tramite visualizzazione dir...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> DNasi ricombinante, RNasi-free </td><td> Roche </td><td> 04716728001 </td></tr><tr><td> RNasi A </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> Proteinasi K </td><td> Pescatore </td><td> BP1700 </td></tr><tr><td> Tris-saturi Fenolo </td><td> Pescatore </td><td> BP1750-100 </td></tr><tr><td> Etere etilico </td><td> Thomas Scientific </td><td> C313K31 </td></tr><tr><td> Pro-Q Emerald 300 Gel Kit Lipopolisaccaride Stain </td><td> Molecular Probes </td><td> P20495 </td></tr></tbody></table>

purificazione e visualizzazione di lipopolisaccaride da batteri gram-negativi da hot acquosa-fenolo di estrazione

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Lipopolisaccaride (LPS) è un componente principale delle membrane batteriche Gram-negativi esterni. Si tratta di una molecola composta dal lipide A, che è incorporato nella membrana esterna, un oligosaccaride e ripetibile nucleo O-antigene unità che si estendono verso l&#39;esterno dalla superficie della cella 1, 2. LPS è una molecola immunodominante che è importante per la virulenza e patogenesi di molte specie batteriche, tra Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp, Escherichia coli e 3-5, e le differenze di LPS O-antigene composizione forma la base per la sierotipizzazione di ceppi. LPS è coinvolto in attaccamento alle cellule ospiti all&#39;inizio della infezione e fornisce protezione da complemento-mediata uccisione; ceppi privi LPS può essere attenuato per virulenza 6-8. Per queste ragioni, è importante visualizzare LPS, in particolare da isolati clinici. LPS visualizzando bande modelli e il riconoscimento da uno specificontibodies possono essere strumenti utili per identificare i lignaggi di deformazione e caratterizzare i vari mutanti. In questa relazione, si descrive un hot-fenolo acquoso metodo per l&#39;isolamento e la purificazione di LPS da cellule batteriche gram-negativi. Questo protocollo consente l&#39;estrazione di LPS lontano da acidi nucleici e proteine ​​che possono interferire con visualizzazione di LPS che si verifica con brevi e metodi di estrazione meno intensi 9. LPS preparato in questo modo possono essere separati da sodio dodecil solfato (SDS)-poliacrilammide gel elettroforesi (PAGE) e direttamente colorati usando carboidrati / glicoproteina macchie o normali metodi di colorazione d&#39;argento. Molti anti-sieri di LPS contenere anticorpi che cross-reagiscono con le proteine ​​della membrana esterna o altri bersagli antigenici che possono ostacolare la reattività osservati dopo immunoblot occidentale SDS-PAGE separate da lisati cellulari grezzi. Proteasi trattamento di lisati cellulari grezzi da sola non è sempre un modo efficace per rimuovere questosfondo di utilizzare questo o altri metodi di visualizzazione. Inoltre, il trattamento della proteasi esteso nel tentativo di eliminare questo sfondo può portare a LPS scarsa qualità che non è ben risolto da uno qualsiasi dei metodi summenzionati. Per queste ragioni, riteniamo che il seguente protocollo, adattato da Westpahl Jann e 10, è l&#39;ideale per l&#39;estrazione LPS.

Descriviamo una modificato caldo acquosa-fenolo metodo di estrazione per purificare lipopolisaccaride (LPS) da batteri Gram-negativi. Una volta estratto, le LPS può essere successivamente analizzati mediante SDS-PAGE e visualizzati tramite colorazione diretta o immunoblot occidentale.

Purificazione e visualizzazione di lipopolisaccaride da batteri Gram-negativi da Hot acquosa-fenolo di estrazione

Il lipopolisaccaride (LPS) è un componente principale delle membrane esterne dei batteri Gram-negativi. Si tratta di una molecola tripartita composta dal lipide A, che è...

L'obiettivo generale di questa procedura è estrarre il LPS da batteri Gram-negativi. Questo viene ottenuto innanzitutto coltivando una coltura di cinque millilitri di batteri in un mezzo appropriato per tutta la notte e regolando la coltura a una densità ottica a 600 nanometri di 0,5. Successivamente, i batteri vengono centrifugati in microcentrifuga per formare un pellet e le cellule vengono risospese in un buffer tris contenente SDS e beam o etanolo capto.Successivamente, i lisati cellulari vengono portati a ebollizione e trattati con proteasi e nucleasi. Infine, vengono effettuate due estrazioni sequenziali con fenolo acquoso caldo ed etere dietilico, rimuovendo con cura e conservando lo strato acquoso blu. In ultima analisi, si possono ottenere risultati che mostrano la quantità e la presenza o assenza di LPS e ceppi batterici, nonché la modalità della lunghezza della catena dell'antigene O, mediante separazione tramite elettroforesi SDS-PAGE e analisi western blot con anticorpi specifici per LPS o colorazione diretta dei polisaccaridi nel gel.Il vantaggio di questa tecnica rispetto al trattamento con proteasi di Hitchcock e Brown è che questo metodo consente di ottenere campio

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

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Arricchimento di lipoproteine batteriche mediante separazione di fase con detergente non ionico

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Esecuzione di cromatografia a strato sottile per valutare la degradazione degli esopolisaccaridi batterici

Questo video dimostra la separazione degli acidi micolici basata sulla cromatografia su strato sottile. Questa tecnica separa i diversi acidi micolici, lipidi a catena lunga presenti nella parete cellulare dei micobatteri, in base alla loro polarità.

Separazione basata sulla cromatografia su strato sottile di varianti di acido micolico: un metodo per separare i lipidi della parete cellulare micobatterica in base alla polarità

Isolamento e caratterizzazione del lipide Un dominio di lipopolisaccaride (LPS) da batteri gram-negativi fornisce comprensione dei meccanismi cellulari di superficie a base di antibiotico-resistenza, la sopravvivenza dei batteri e fitness, e come chimicamente lipidi varia Una specie molecolari differenziale modulano la risposta immunitaria innata.

Isolamento e Caratterizzazione chimica del lipide A da batteri Gram-negativi

La parete cellulare batterica è composta da peptidoglycan, una rete macromolecolare di fili di zucchero reticolati da peptidi. La cromatografia liquida ad alte prestazioni fornisce alta risoluzione e produttività per nuove scoperte della composizione peptidoglycan. Presentiamo una procedura per l'isolamento delle pareti cellulari (sacculi) e la loro successiva preparazione per l'analisi tramite UPLC.

Isolamento e preparazione delle pareti cellulari batteriche per l'analisi compositia mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni

Gli acidi grassi dei fosfolipidi forniscono informazioni sulla struttura delle comunità microbiche del suolo. Vi presentiamo i metodi per l'estrazione di campioni di terreno con una miscela monofase cloroformio, frazionamento dei lipidi estratti utilizzando colonne di estrazione in fase solida, e metanolisi per la produzione di esteri metilici degli acidi grassi, che vengono analizzati mediante gascromatografia capillare.

Estrazione e l&#39;analisi delle microbica fosfolipidi acidi grassi nei terreni

L'arricchimento delle lipoproteine batteriche mediante una fase di tensioattivo non ionico metodo di partizionamento è descritto per uso diretto in saggi TLR o altre applicazioni. Ulteriori iniziative sono dettagliate per preparare lipopeptidi triptico N-terminale per la caratterizzazione strutturale mediante spettrometria di massa.

Arricchimento delle lipoproteine batteriche e preparazione del N-terminale lipopeptidi per determinazione strutturale mediante spettrometria di massa

I batteri Gram-negativi producono due membrane selvadenti spazialmente. La membrana esterna è partizionata dalla membrana interna da un periplasma e da uno strato peptidoglycan. La capacità di isolare i doppi bistrati di questi microbi è stata fondamentale per comprendere la loro fisiologia e patogenesi.

Separazione dell'involucro cellulare per i batteri Gram-negativi in frazioni di membrana interne ed esterne con regolazioni tecniche per Acinetobacter baumannii

Questo protocollo copre un'analisi dettagliata della composizione del peptidoglicano utilizzando la spettrometria di massa per cromatografia liquida abbinata a software avanzati di estrazione delle caratteristiche e analisi bioinformatica.

Analisi semi-quantitativa del peptidoglicano mediante cromatografia liquida spettrometria di massa e bioinformatica

Viene presentato un protocollo per estrarre il contenuto lipidico totale della parete cellulare di una vasta gamma di micobatteri. Inoltre, vengono mostrati i protocolli di estrazione e analisi dei diversi tipi di acidi micolici. Viene inoltre fornito un protocollo cromatografico a strato sottile per monitorare questi composti micobatterici.

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I gangliosidi sono glicosfingolipidi contenenti acido sialico che sono particolarmente abbondanti nel cervello. La loro natura anfipatica richiede tecniche di estrazione e purificazione organiche/acquose per garantire un recupero ottimale e analisi accurate. Questo articolo fornisce una panoramica dell'estrazione, della purificazione e dell'analisi della cromatografia su ganglioside su scala analitica e preparativa.

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Impara a purificare il lipopolisaccaride da batteri Gram-negativi mediante estrazione con fenolo acquoso caldo. Questo metodo consente l'analisi tramite SDS-PAGE e Western blot per studi immunologici.

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