Name: Isolamento e la coltura primaria di cellule epatiche di ratto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-29T12:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Impara un protocollo affidabile per isolare epatociti primari di ratto con alta vitalità. Questo metodo produce fino a 100 milioni di cellule per preparazione, ideale per studi biochimici e metabolici.

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Gli autori desiderano ringraziare il Sig. Josh Basford e il dottor Xiao Li-min per l&#39;assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni NIH (DK70992 e DK92779 alla ML).

1. Preparazione Tutti i buffer sono preparati al momento utilizzando una tecnica sterile e sterilizzato per filtrazione con un filtro di 0,22 micron Corning. <ol><li> Preparare perfusione Buffer I aggiungendo la seguente soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS, senza Ca 2 + e Mg 2 +, vedi Tabella 1): Mg 2 + (MgCl 2) a 0,9 mM, EDTA a 0,5 mM e HEPES a 25 mM. </li><li> Preparare perfusione tampone II aggiungendo il seguente HBSS (con Ca 2 + e Mg 2 +, vedi Tabella 1): HEPES a 25 mM. </li><li> Preparare perfusione tampone II plus collagenaseII: Sciogliere collagenasi II (1000 U), 300 ml di perfusione tampone II e conservare la soluzione in acqua calda-bagno prima di perfusione. Questa soluzione deve essere utilizzata entro 30 minuti perché l&#39;attività della collagenasi II è diminuito con il tempo. </li><li> Preparare terreno completo William: Aggiungere il seguenteE a media Williams &#39;: L-glutammina 2 mM, siero bovino fetale (FBS) al 5%, a 100 nM insulina, desametasone e 100 nm, penicillina 100 IU / ml e streptomicina a 100 mg / ml. </li><li> Questi buffer deve essere riscaldata per 30 minuti in bagno d&#39;acqua a 42 ° C, una temperatura ottimale corrispondente ad una temperatura di uscita alla cannula di 37 ° C. </li></ol> 2. Perfusione Rat Liver per l&#39;isolamento <ol><li> Il sistema di perfusione costituito dalla pompa, autoclavabile tubazione di silastic e un bagno di acqua (vedi Figura 1). Pre-impostare la portata della pompa peristaltica perfusione a 10 ml / min. </li><li> Anestetizzare un ratto adulto (300 g di peso corporeo) con intraperitoneale (ip) ketamina (87 mg / kg di peso corporeo) più xilazina (13 mg / kg). Profondità dell&#39;anestesia deve essere monitorata mediante pizzico punta. Quando il topo non risponde più agli stimoli nocivi, radersi i capelli addominale e preparazione l&#39;addome con Betadine ed etanolo. Inserisci attraverso una incisione mediana. </li><li> Esporrela vena portale epatica attentamente spostando il visceri all&#39;esterno destro della cavità addominale, ed inserire un 18-gauge angiocath nella vena porta (vedi Figura 1). </li><li> Collegare il tubo perfusato all&#39;ago e avviare l&#39;infusione in situ a una portata bassa (10 ml / min) con pre-riscaldato (37 ° C) Buffer I perfusione. </li><li> Se eseguita correttamente, il fegato deve immediatamente iniziare a sbollentare. Una volta cannulazione successo è confermata, effettuare un taglio a vena cava inferiore (IVC) per consentire efflusso (Figura 1). Un ulteriore test per la cannulazione di successo può essere eseguita applicando una leggera pressione con un tampone sterile sulla IVC, tutti i lobi del fegato dovrebbe iniziare rapidamente a gonfiarsi. </li><li> Aumentare la velocità del flusso di 25 ml / min. Il fegato dovrebbe diventare di colore pallido. </li><li> Passare il liquido di perfusione di perfusione tampone II plus collagenasi II senza interruzione del flusso per altri 6 minuti. </li> &lt;li&gt; Periodicamente (5-10 volte durante la digestione) applicare una pressione con un tampone alla IVC per intervalli di 5 secondi. Il fegato si gonfiano, che porta alla dissociazione maggiore epatica cella, a sua volta riduzione del tempo totale di digestione, e aumentando resa finale. </li><li> Dopo la perfusione collagenasi, fegato dovrebbe iniziare a guardare molle. Sezionare il libero fegato, posto in un pre-refrigerato beaker sterile con 20 ml di terreno completo William, e poi portarla al cofano coltura cellulare dei tessuti. </li></ol> 3. Cella di isolamento degli epatociti <ol><li> All&#39;interno del cofano coltura cellulare, usare un raschietto cella per disperdere delicatamente le cellule in terreno completo di William all&#39;interno di una piastra di Petri sterile. </li><li> Filtrare la dispersione cellulare attraverso un filtro 100 dimensione dei pori cella um in una provetta conica da 50 ml per rimuovere tessuto connettivo e frammenti di tessuto non digerito. </li><li> Sospendere cellule in 40 ml di mezzo completo William e centrifugare a 50 xg per 3 min a 4 ° C. </li><li> Aspirare il supernatante, edelicatamente risospendere le cellule in mezzo completo 40 ml freddo di William per lavare le cellule. Ripetere centrifugazione. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere delicatamente le cellule con 25 ml di terreno completo di William. Aggiungere 25 ml di soluzione di Percoll 90% in PBS nel tubo e mescolare delicatamente. </li><li> Centrifugare a 200 xg per 10 min a 4 ° C. Aspirare le cellule morte dalla parte superiore del gradiente perché le cellule vitali rimanere sul fondo del gradiente Percoll. </li><li> Sospendere il pellet di cellule in 30 ml caldo terreno completo di William, e poi ripetere la centrifugazione e risospendere il pellet cellulare in 20 ml caldo terreno completo di William. </li><li> Contare le cellule all&#39;interno della sospensione cellulare utilizzando un emocitometro e determinare la vitalità cellulare mediante colorazione con blu tripano. </li></ol> 4. Cultura degli epatociti <ol><li> Diluire le cellule con mezzo completo caldo William a concentrazione preferita, ad esempio 2,5 x 10 5 cellule / ml. Celle di dischi ad un volume desiderato su piastre di coltura cellulare, per esempio. 5 x 10 5 cellule / 2 ml / pozzetto, 6 pozzetti / piastra, o 2,5 x 10 5 cellule / 1,5 ml / pozzetto, 12 pozzetti / piastra. Un rivestita con lastra è bene per colture di cellule epatiche. </li><li> In una preparazione tipica con&gt; 85% cellule vitali, la densità cellulare dovrebbe raggiungere circa 60-70% di confluenza, che consente di contatto cellula-cellula mantenendo uno spazio sufficiente per gli epatociti crescere delle dimensioni delle cellule piena e dare un finale di confluenza 90-95%. </li><li> Al fine di formare un monostrato anche di epatociti, in altre parole, per minimizzare la tendenza per le cellule di aggregazione nella zona centrale del pozzo (più probabilmente dovuta al flusso d&#39;aria all&#39;interno della cella incubatore), le piastre consentono di rimanere all&#39;interno la cultura cappa cellulare per 30 minuti prima di metterle in una incubatrice. </li><li> Coltivare le cellule a 37 ° C in atmosfera umidificata al 95% aria e 5% CO 2. Dopo 4 h-coltura, le cellule potrebbero o rimanere nello stesso medium contenente siero o sostituire il mezzo con siero-free media, ad esempio HepatoZYME-SFM (vedi Tabella 1). Il mezzo privo di siero aiuta a mantenere la morfologia delle cellule senza effetti negativi da ormoni quando un terreno privo di siero viene utilizzato. </li><li> Consentono alle cellule di recuperare e crescere almeno per una notte prima della sperimentazione. Si consiglia di utilizzare le cellule per il test entro 24 ore perché questo può aiutare a preservare la funzione degli enzimi critici (ad esempio, P450). </li><li> Sostituire il mezzo di crescita a intervalli di 2 giorni, se necessario. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Le condizioni descritte generare periodicamente raccolti cellule di 1.0 x 10 8 cellule per la preparazione di un fegato di ratto. La vitalità degli epatociti misurata mediante esclusione con Trypan blu era costantemente all&#39;interno dell&#39;intervallo di 88 ~ 96%. Come illustrato in figura 2, l&#39;aggregato epatociti e cluster di forma dopo 4 ore la semina. Cellule più isolate appiattire e diffuso in crescita monostrato tipica. Entro 24 ore, i bordi delle cellule sono definite, superficie delle cellule è abbastanza regolare, e goccioline lipidiche sono visibili. Le cellule hanno da uno a tre nucleoli, di forma rotonda, situati al centro delle cellule, e la dimensione di visualizzazione nuclei coerente tra cellule (Figura 2). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3917/3917fig1.jpg" /> Figura 1. Un diagramma di perfusione del fegato. Una 18-gauge angiocath viene inserito nella vena porta di fegato, poi un tubo perfusato è collegato all&#39;ago. Una volta cannulazione successo è confermato, fare un taglio alla vena cava inferiore (IVC) per consentire efflusso. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3917/3917fig2.jpg" /> Figura 2. Morfologia di epatociti coltivati ​​nel tempo (4 ore a 24 ore), ingrandimento x 200. Dopo la coltura per 24 ore, le cellule diffuse in crescita monostrato tipico, e le giunzioni tra le cellule sono lineari. <table border = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> HBSS (senza Ca 2 +, e Mg 2 +) </td><td> Invitrogen </td><td> 14174 </td></tr><tr><td> HBSS (con Ca 2 +, e Mg 2 +) </td><td> Invitrogen </td><td> 14025 </td></tr><tr><td> E Media Williams </td><td> Invitrogen </td><td> 12551-032 </td></tr><tr><td> Collegenase II </td><td> Worthington </td><td> LS004176 </td></tr><tr><td> Cella filtro (100 micron) </td><td> BD </td><td> 352360 </td></tr><tr><td> HepatoZYME-SFM </td><td> Invitrogen </td><td> 17705 </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> Sigma </td><td> P4937 </td></tr><tr><td> Angiocath (18-gauge) </td><td> BD </td><td> 381705 </td></tr></tbody></table> Tabella 1.

<ol><li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells%3A+a+biochemical+and+fine+structural+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> J. Cell Biol. 43, 506-520 (1969).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Saito, K., Kobayashi, K., Mizuno, Y., Fukuchi, Y., Furihata, T., Chiba, K., Schmidt, M., Schmitz, H. J., Baumgart, A., Guedon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+%28PPARalpha%29+agonists+induce+constitutive+androstane+receptor+%28CAR%29+and+cytochrome+P450+2B+in+rat+primary+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab.+Pharmacokinet%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) agonists induce constitutive androstane receptor (CAR) and cytochrome P450 2B in rat primary hepatocytes.</a> Drug Metab. Pharmacokinet. 25, 108-111 (2010).</li>
<li>Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatocytes+in+primary+culture%3A+the+choice+to+investigate+drug+metabolism+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Metab%22%5BJournal%5D)">Human hepatocytes in primary culture: the choice to investigate drug metabolism in man.</a> Curr. Drug Metab. 5, 443-462 (2004).</li>
<li>Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+isolation+of+murine+hepatocytes+for+in+vitro+malaria+liver+stage+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Malar.+J%22%5BJournal%5D)">Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies.</a> Malar. J. 6, 169(2007).</li>
<li>Bu, S. Y., Mashek, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+long-chain+acyl-CoA+synthetase+5+mediates+fatty+acid+channeling+between+anabolic+and+catabolic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Hepatic long-chain acyl-CoA synthetase 5 mediates fatty acid channeling between anabolic and catabolic pathways.</a> J. Lipid Res. 51, 3270-3280 (2010).</li>
<li>Aiken, J., Cima, L., Schloo, B., Mooney, D., Johnson, L., Langer, R., Vacanti, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+in+rat+liver+perfusion+for+optimal+harvest+of+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Surg%22%5BJournal%5D)">Studies in rat liver perfusion for optimal harvest of hepatocytes.</a> J. Pediatr. Surg. 25, 140-144 (1990).</li>
<li>Jauregui, H. O., McMillan, P. N., Hevey, K., Naik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+lectin+binding+to+adult+rat+hepatocyte+cell+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of lectin binding to adult rat hepatocyte cell surfaces.</a> In Vitro Cell. 24, 401-412 (1988).</li>
<li>Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+liver+cell+culture.+II.+Primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Mouse liver cell culture. II. Primary culture.</a> In Vitro. 17, 926-934 (1981).</li>
<li>Hay, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Operator-induced+contamination+in+cell+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol.+Stand%22%5BJournal%5D)">Operator-induced contamination in cell culture systems.</a> Dev. Biol. Stand. 75, 193-204 (1991).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Coltura primaria di epatociti è un modello in vitro ampiamente utilizzato per studiare vari aspetti della fisiologia del fegato e della patologia. Ad esempio, la cultura primaria viene utilizzata per valutare l&#39;espressione e la funzione di enzimi che metabolizzano i farmaci inclusi i citocromi P450, metabolismo dei farmaci, interazioni farmaco-farmaco e dei meccanismi di citotossicità e genotossicità 3-7. Il protocollo descrive l&#39;isolamento e la coltura di cellule epatiche di ratto è adattato...

isolamento e la coltura primaria di cellule epatiche di ratto

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

La cultura degli epatociti primario è uno strumento prezioso che è stato ampiamente utilizzato nella ricerca di base della funzione epatica, patologia, la fisiopatologia, farmacologia e altri argomenti correlati. Il metodo basato su due fasi perfusione collagenasi per l&#39;isolamento di epatociti intatti è stato introdotto da Berry e Friend nel 1969 1 e, da allora, ha subito molte modifiche. La tecnica più comunemente usata è stata descritta da Seglenin 1976 2. Essenzialmente, epatociti sono dissociate da ratti adulti anestetizzati da un non-ricircolo perfusione con collagenasi attraverso la vena porta. Le cellule isolate vengono quindi filtrata attraverso un filtro a pori 100 um nylon dimensioni delle maglie, e coltivate su piastre. Dopo 4 ore di coltura, il terreno viene sostituito con terreno contenente siero o privo di siero, ad esempio HepatoZYME-SFM, per il tempo aggiuntivo di cultura. Queste procedure richiedono operazioni chirurgiche cultura e sterili che possono essere meglio dimostrato dal video che da testo. Here, ci documentare i passaggi dettagliati di queste procedure sia da video e protocollo scritto, che consentono costantemente la generazione di epatociti vitali in gran numero.

Epatociti primari costituirà un valido strumento per valutare le funzioni biochimiche, molecolari e metaboliche in un sistema fisiologicamente rilevante sperimentale. Noi descriviamo un protocollo affidabile per la perfusione di fegato di ratto in situ, che genera costantemente epatociti vitali fino to1.0 × 10<sup&gt; 8</sup&gt; Cellule per la preparazione con la vitalità delle cellule tra 88 ~ 96%.

Isolamento e la coltura primaria di cellule epatiche di ratto

La coltura di epatociti primari è uno strumento prezioso che è stato ampiamente utilizzato nella ricerca di base sulla funzione, le malattie, la fisiopatologia e la farmacologia epatica...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un protocollo affidabile per generare epatociti vitali in grandi quantità. Ciò viene ottenuto innanzitutto percuotendo una soluzione di collaghenasi attraverso la vena porta del ratto. Successivamente, le cellule dissociate vengono isolate e purificate utilizzando un filtro in nylon a maglie, e le cellule morte vengono separate da quelle vitali mediante soluzione per coltura cellulare.L'ultimo passaggio consiste nel coltivare gli epatociti in un incubatore. Alla fine, questo protocollo genera fino a 100 milioni di cellule per preparazione con una vitalità cellulare del 90%. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la procedura richiede passaggi chirurgici e sterili che possono essere compresi meglio mediante video piuttosto che tramite testo. La dimostrazione della procedura sarà effettuata da un tecnico del mio laboratorio. Tutti i vari sistemi di perfusione, i tamponi e il mezzo completo di Williams devono essere preparati un giorno prima dell'uso, impiegando tecniche sterili.Il buffer deve essere riscaldato per 30 minuti in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius. Questo corrisponde a una temperatura ottimal

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