Isolamento e la coltura primaria di cellule epatiche di ratto

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un protocollo affidabile per generare epatociti vitali in gran numero. Ciò si ottiene perfondendo prima la soluzione di collagenasi attraverso la vena porta del ratto. Quindi le cellule dissociate vengono isolate e purificate utilizzando un filtro di nylon a rete e le cellule morte vengono separate dalle cellule vitali utilizzando una soluzione per richiamo.

Il passaggio finale consiste nel coltivare gli epatociti in un'incubatrice. In definitiva, questo protocollo genera fino a 100 milioni di cellule per preparazione con una vitalità cellulare del 90%. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché questa procedura richiede passaggi chirurgici e colturali che possono essere meglio compresi dal video che dal testo che dimostra che la procedura smentirà un tecnico del mio laboratorio, I vari perfusioni richiesti, i tamponi e il terreno completo di Williams dovrebbero essere preparati con un giorno di anticipo utilizzando una tecnica sterile prima del loro utilizzo.

Il tampone deve essere riscaldato per 30 minuti a bagnomaria a 42 gradi Celsius. Ciò corrisponde a una temperatura di uscita ottimale alla cannula di 37 gradi Celsius. Il sistema di perfusione è costituito dalla pompa autoclavabile, da un tubo elastico e da un bagno d'acqua preimpostato la portata della pompa di perfusione peristaltica a 10 millilitri al minuto.

Successivamente, anestetizzare un ratto adulto con un'iniezione intraperitoneale di ketamina e xilazina. Quando il ratto non risponde più a un pizzico di dolore, radere i peli addominali e pulire l'area chirurgica con betadina ed etanolo. Entra attraverso un'incisione della linea mediana ed esponi la vena porta epatica.

Spostare con cautela i visceri all'esterno destro della cavità addominale e inserire un angiocatetere calibro 18 nella vena porta epatica. Collegare il tubo PERFUSE eight all'ago e iniziare l'infusione in C due a una bassa portata con il tampone di perfusione preriscaldato uno. Se eseguito correttamente, il fegato dovrebbe iniziare immediatamente a sbiancare.

Una volta confermato il successo dell'incannulamento, tagliare il CVA della vena inferiore per consentire il flx. Un altro test per il successo dell'incannulamento consiste nell'applicare una leggera pressione sull'IVC. Usando un tampone, tutti i lobi del fegato dovrebbero iniziare rapidamente a gonfiarsi.

Quindi, aumentare il flusso di tampone a 25 millilitri al minuto. Il fegato dovrebbe diventare di colore pallido. Una volta che il fegato diventa pallido, cambiare la soluzione di perfusione per tamponare due con collagenasi due per sei minuti di digestione, da cinque a 10 volte durante la digestione, applicare pressione sull'IVC con un tampone per cinque secondi.

Il fegato si gonfierà portando a una maggiore dissociazione delle cellule epatiche. A sua volta, riducendo il tempo totale di digestione e aumentando la resa finale. Dopo la perfusione con collagenasi, il fegato dovrebbe iniziare ad apparire pastoso.

Sezionare il fegato liberamente. Metterlo in un becher sterile pre-raffreddato con 40 millilitri di terreno e trasferirlo in una cappa di coltura cellulare tissutale per l'isolamento cellulare nella cappa di coltura cellulare. Trasferire il fegato in una capsula di Petri con 20 millilitri di terreno completo di Williams e utilizzare un raschietto cellulare per disperdere delicatamente le cellule epatiche per rimuovere i tessuti connettivi e i frammenti di tessuto non digeriti.

Filtrare la dispersione cellulare attraverso un filtro cellulare di 100 micron di pori in un tubo conico da 50 millilitri. Quindi, sospendere le cellule in 40 millilitri di centrifuga media. La sospensione a 50 volte G per tre minuti a quattro gradi Celsius.

Aspirare il sup, la natina e risospendere delicatamente le cellule. In 40 millilitri di terreno freddo per lavare le cellule, centrifugare nuovamente le cellule, aspirare la trappola e risospendere delicatamente le cellule. Con 25 millilitri di pellet medio le cellule e aspirare le cellule morte Dalla parte superiore del gradiente di perolo, le cellule vitali rimangono sul fondo.

Sospendere il pellet di cella vitale in 30 millilitri di terreno caldo e ripetere la centrifugazione. Risospendere il pellet in 20 millilitri di terreno. Contare le cellule all'interno della sospensione utilizzando un emocitometro e determinare la vitalità della cellula.

Utilizzando la colorazione trian blue, diluire gli epatociti in Warm Williams, completare il terreno alla concentrazione preferita e depositarli su piastre di coltura non rivestite al volume desiderato. Una preparazione tipica ha più dell'85% di cellule vitali o una densità di cellule piatte dal 60 al 70% di confluenza. Ciò consente il contatto cellulare con le cellule mantenendo uno spazio sufficiente per consentire agli epatociti di crescere fino alla loro piena dimensione e produrre una confluenza finale dal 90 al 95% per far crescere un monostrato uniforme di epatociti senza aggregati cellulari.

Nella zona centrale del pozzetto, lasciare che le piastre rimangano a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'incubazione. A volte, quando si vedono le cellule aggregarsi nell'area centrale della balena, questo problema potrebbe essere superato lasciando la piastra nella cappa di coltura per 30 minuti prima di entrare nell'incubatrice. Ciò garantisce che le cellule crescano nel loro monostrato uniforme.

Dopo quattro ore di incubazione, il terreno può essere sostituito con terreno privo di siero per mantenere la morfologia cellulare senza effetti avversi da parte degli ormoni, consentendo alle cellule di riprendersi e crescere almeno una notte prima della sperimentazione. Gli enzimi critici come il P 4 50 saranno ancora funzionali entro 24 ore, ma non molto di più. Se necessario, sostituire il terreno di coltura a giorni alterni.

Dopo quattro ore di coltura, gli epatociti si aggregano e si raggruppano, la maggior parte delle cellule isolate si appiattisce e si diffonde nella tipica crescita monostrato. Entro 24 ore, le cellule si diffondono in una tipica crescita monostrato. I loro bordi sono definiti, le loro giunzioni sono lineari, le loro superfici sono abbastanza lisce e le goccioline lipidiche sono visibili.

Le cellule hanno da uno a tre nucleoli, che sono rotondi situati al centro delle cellule, e i nuclei mostrano dimensioni coerenti tra le cellule. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare hepato praticabile in grandi numeri in rosso.