Utilizzo non fissati, tessuti congelati allo Studio di distribuzione naturale Mucina

L'obiettivo generale del seguente esperimento è preservare la distribuzione naturale della glicosilazione del muco secreto nei campioni di tessuto. Questo viene ottenuto innanzitutto incorporando i tessuti in una soluzione crioprotettiva a temperatura di taglio ottimale, o OCT, per ridurre al minimo la lavorazione del tessuto, e successivamente consentendo la rilevazione di strutture di glicani, mucine e muco. Le sezioni vengono incubate con lectine, anticorpi e colorazioni istochimiche.

L'interazione con le lectine può essere ulteriormente verificata mediante inibizione competitiva o scissione enzimatica degli epitopi glicanici, al fine di confermare la specificità del legame con le lectine. In ultima analisi, la conservazione del muco e dei campioni di tessuto congelati può essere confrontata con la conservazione del muco in campioni inclusi in paraffina mediante analisi chimica mistica. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'inclusione del tessuto in paren e la fissazione con soluzione di car noise, consistono nel fatto che questo metodo non richiede l'uso di fissativi specializzati e permette l'utilizzo di tessuti congelati già disponibili in laboratorio.

Per iniziare, lasciare che il tessuto congelato rapidamente si riscaldi fino a meno 20 gradi Celsius ponendolo all'interno di una camera di microtomo criogenico. Nel frattempo, preparare un bagno refrigerante aggiungendo due butano metilico a una scatola bassa in polistirolo e quindi aggiungendo anidride carbonica solida (gelo secco) alla scatola. Successivamente, aggiungere una quantità sufficiente di OCT da coprire il fondo di uno stampo per congelamento rimovibile, quindi posizionare il tessuto nello stampo.

Assicurarsi che il tessuto poggia sul fondo dello stampo nella posizione desiderata. Coprire il tessuto con altro OCT e quindi posizionare lo stampo nel bagno di congelamento. Il composto OCT diventerà bianco durante la congelazione del tessuto. Dopo il congelamento, rimuovere lo stampo dal blocco congelato e inserire il blocco in un sacchetto per il congelatore precedentemente etichettato.

Conservare i blocchi congelati a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso, prima di sezionare il tessuto. Posizionare i blocchi congelati di interesse nella camera del microtomo criogenico per circa 30 minuti, in modo che raggiungano la temperatura di meno 20 gradi Celsius. Quando i blocchi hanno raggiunto questa temperatura, tagliare una sezione spessa da tre a cinque micrometri e quindi appoggiare un vetrino carico positivamente sulla sezione.

Il tessuto aderirà al vetrino dopo aver lasciato asciugare all'aria i tessuti per 30-60 minuti. Fissare i vetrini con soluzione al 10% tampone per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi lavare i vetrini tre volte in PB PBS mediante 10 immersioni rapide in 250 millilitri di tampone per colorare i tessuti con aum. Prima in blu, risciacquare i vetrini in acqua e poi incubare in acido acetico al 3% per tre minuti.

Quindi incubare i tessuti con la soluzione blu AUM. Dopo 30 minuti, lavare i vetrini con acqua corrente del rubinetto per 10 minuti, quindi risciacquare con acqua deionizzata. Controstainare i nuclei con rosso nucleare rapido per cinque minuti, quindi lavare i vetrini tre volte con acqua deionizzata. A questo punto disidratare e chiarire i vetrini incubando per un minuto in etanolo al 95%, seguito da tre rapide sostituzioni in etanolo al 100% e poi da tre sostituzioni in citrus resolve per due minuti ciascuna.

Infine, montare un coprioggetto sul vetrino con un mezzo di montaggio come cyto seal 60 per colorare i tessuti con la reazione dell'acido periodico di Schiff. In primo luogo, risciacquare i vetrini in acqua e quindi incubarli con acido periodico al 1% appena preparato per cinque minuti. A questo punto, lavare i vetrini tre volte in acqua deionizzata.

Immergere i vetrini una volta in acqua Milli Q e quindi colorare i tessuti con il reagente di Schiff. Dopo 15 minuti, lavare i vetrini in acqua corrente del rubinetto per altri 10 minuti, quindi immergerli una volta in acqua deionizzata. Controcolorare i nuclei con metanolo di safranina per 30 secondi, quindi lavare i vetrini tre volte in acqua deionizzata.

Infine, incubare i vetrini per 30 secondi. In reagente bluante Scot's tap water, lavare tre volte in acqua deionizzata e quindi disidratare i tessuti come appena mostrato per la colorazione con blu di calcio. Montare i vetrini con un coprioggetti per la rilevazione in fluorescenza di epitopi glicanici mediante lectine.

Prima, bloccare il vetrino con BSA in PBS per 10-30 minuti. Quindi bloccare la biotina endogena incubando il vetrino per 15 minuti con avadina, seguito da un lavaggio con PBS e successivamente da un'incubazione di 15 minuti con biotina 0,01% dopo un altro lavaggio con PBS. Posizionare il vetrino in una cassetta di colorazione, applicare uno strato di una miscela appena preparata dei lectini desiderati su ciascuna sezione di tessuto e quindi ricoprire delicatamente la miscela di lectine con parafilm.

Ora incubare la preparazione al buio dopo un'ora. Rimuovere delicatamente il parfum e lavare la preparazione tre volte con PBS. Quindi applicare sulla preparazione lo streptavidina coniugata con SCI cinque e incubare nuovamente al buio dopo 30 minuti; lavare le preparazioni tre volte con PBS e quindi eseguire la controcolorazione dei nuclei con dappy.

Infine, montare il vetrino con un coprioggetto utilizzando un mezzo acquoso come il mezzo di montaggio Vector Mount per il controllo dell'enzima sase. Iniziare aggiungendo acqua sul fondo di una scatola per puntali vuota per formare una camera umidificata. Posizionare i vetrini del controllo negativo con la superficie rivolta verso l'alto sul vassoio superiore della scatola per puntali.

Applicare da 150 a 200 microlitri di una soluzione US sulle sezioni di tessuto, quindi coprire ogni vetrino con un coverslip, evitando la formazione di bolle d'aria. Chiudere il coperchio della scatola e incubare la scatola a 37 gradi Celsius dopo due ore e mezza. Lavare i vetrini tre volte in PBS a temperatura ambiente per rimuovere eventuali acidi slic liberi.

Quindi incubare i vetrini con SNA per un'ora a temperatura ambiente per l'inibizione competitiva. Aliquotare 200 microlitri della miscela di lectina in due vial Eppendorf. Aggiungere quindi 200 millimoli del Meli bios inibitore di Jacqueline a uno dei vial e aggiungere il chitinato idrolizzato inibitore SWGA in un rapporto di diluizione uno a dieci nell'altro vial.

Quindi incubare i vetrini con le miscele contenenti l'inibitore per un'ora a temperatura ambiente. In questa prima figura, sezioni di tessuto di colon di topo o di pollo fissate in OCT o incluse in paraffina sono state colorate con acido periodico di Schiff in rosa o con blu di calcio in blu. Un confronto tra campioni di tessuto inclusi in paraffina e tessuti congelati inclusi nel mezzo crioprotettivo OCT ha rivelato differenze notevoli nella conservazione e nella qualità della colorazione delle glicoproteine della mucina nei tessuti congelati.

Oltre alla mucina nelle cellule caliciformi, il muco secreto era visibile anche come indicato dalle frecce nei tessuti inclusi in paraffina. La colorazione del muco era limitata alle cellule caliciformi. In questa figura, si può osservare la notevole perdita di mucina e dei tessuti incubati in succo di agrumi.

Sezioni seriali di campioni congelati di ileo di pollo sono state fissate in formalina tamponata al 10% e mantenute idratate, disidratate nell'etanolo mediante incubazione sequenziale in etanolo al 70%, 90% e 100% per 20 minuti ciascuno, oppure disidratate nell'etanolo e quindi chiarificate con citrus all per un'ora. La sola disidratazione in etanolo e la disidratazione in etanolo seguita da chiarificazione con citrus all hanno migliorato la morfologia del tessuto. Un'ulteriore disidratazione in etanolo da sola non ha avuto effetti significativi sulla colorazione blu.

Al contrario, con l'incubazione con alliacea si è osservata una riduzione e un confinamento della colorazione blu alle cellule caliciformi, con un pattern simile a quello riscontrato nei tessuti inclusi in paraffina mostrati nella figura precedente. I riquadri indicano le aree visualizzate con ingrandimento maggiore nelle sezioni di tessuto colorate con alliacea blu. In questa serie successiva di immagini, vengono mostrati campioni di ileo di pollo congelati in OCT o inclusi in paraffina, quindi sottoposti a sonda con Jacqueline in blu, SWG in verde e SNA in rosso, nei tessuti congelati.

Il legame di Jacqueline ai glicani Olink rivelava strutture che sembravano fuoriuscire dalle cellule caliciformi verso la luz, come indicato dalle frecce nella sezione di tessuto congelato OCT. Al contrario, il legame di Jacqueline ai tessuti inclusi in paraffina era limitato alle cellule caliciformi e al bordo a spazzola dei villi, indicato da queste frecce. La colorazione con SWGA del beta uno quattro GL mostra un parziale co-localizzazione con il legame della lectina Jacqueline sia nei tessuti congelati che in quelli inclusi in paraffina, come indicato dalle frecce.

Al contrario, la lectina SNA in rosso, indicata dalle teste di freccia, si lega intracellularmente agli acidi sialici legati in alfa due sei e non co-localizza con Jacqueline, che è in blu ed è indicata con le frecce tratteggiate in questa figura. Gli epitopi di acido sialico sono stati rimossi da campioni di ileo di pollo digerendo la sezione di tessuto con una aUS oppure sono stati lasciati non rimossi mediante incubazione in tampone di acetato di sodio, come mostrato qui. Il trattamento con aUS ha abolito la colorazione con SNA biotinilata osservata nel tessuto non trattato, confermando la specificità di legame della SNA per gli acidi sialici.

La specificità delle lectine può essere confermata anche aggiungendo un inibitore competitivo come mely bios per la colorazione con Jacqueline o idrolizzato di chitina per la colorazione SWGA. I campioni di ileo di pollo sono stati nuovamente incubati con una miscela di Jacqueline e SWGA, questa volta in presenza di specifici inibitori delle lectine, mely bios o idrolizzato di chitina. La colorazione con Jacqueline è stata inibita da mely bios, ma non dall'idrolizzato di chitina. Al contrario, la colorazione SWGA è stata inibita dall'idrolizzato di chitina, ma non da mely bios.

Questa serie finale di immagini dimostra che campioni di tessuto congelati rapidamente, comunemente ottenuti in ambito clinico e nei laboratori di ricerca, possono essere ulteriormente inclusi in OCT e utilizzati per lo studio di glicani su mucine, glicoproteine, glicolipidi e glicani. Queste biopsie di cancro del colon-retto provenienti da tessuti di carcinoma villoglandolare e carcinoma mucinoso sono state congelate rapidamente in azoto liquido, incluse in OCT e successivamente colorate con successo per i vari epitopi di mucina e glicani indicati. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come includere i tessuti in OCT e di come analizzare la glicosilazione del muco e dei tessuti mediante metodi immunoistochimici.