Bioassay Electroantennographic come strumento di screening per Volatili piante ospiti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di esaminare rapidamente un elevato numero di composti volatili delle piante ospiti per identificare un'eventuale attività biologica. Questo viene realizzato innanzitutto raccogliendo e analizzando mediante GCMS i composti volatili delle piante ospiti di interesse. Successivamente, i componenti chimici vengono identificati e verificati.

Il terzo passaggio consiste nel sottoporre i singoli componenti a schermatura per l'attività biologica, mediante analisi elettrografica, in un numero sufficiente di repliche. L'ultimo passaggio prevede la formulazione e la valutazione di miscele costituite da componenti attivi. In definitiva, i risultati possono fornire una serie ridotta di componenti o una miscela di componenti pronti per ulteriori indagini in studi comportamentali con l'insetto di interesse.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come gli studi comportamentali che richiedono molto tempo, è che lo screening rapido mediante analisi elettrografica riduce in modo significativo il numero di composti che devono essere selezionati per ulteriori studi che dimostrano una procedura. Il sig. MR Wage è un tecnico del mio laboratorio? Una volta identificati i composti volatili rilevanti mediante cromatografia gassosa e spettrometria di massa, è possibile eseguire prima l'analisi elettroiconografica o EAG di ciascun volatile disponibile.

Tuttavia, è necessario preparare i composti volatili disponibili. Preparare una soluzione di ciascun composto volatile in pentano a una concentrazione di cinque milligrammi per millilitro in un contenitore che possa essere sigillato ermeticamente e conservato a quattro gradi Celsius. Successivamente, preparare le pipette per lo stimolo.

Etichettare 10 pipette Pasteur per ciascun composto volatile e avvolgere le loro estremità con un piccolo pezzo di parafilm. Un numero di 10 pipette è sufficiente per somministrare il composto volatile a ciascun sesso in uno schermo preliminare con un numero ridotto di repliche. Disporre ora il set rimanente di cinque pipette su un portaprovette e inserire un disco per bioassay nell'estremità aperta di ciascuna pipetta.

Piegare delicatamente un disco con pinzette e inserirlo parzialmente nell'estremità più larga della pipetta in modo che due o tre millimetri del disco siano esposti. Utilizzando una pipetta o una siringa, aggiungere 10 microlitri di soluzione volatile su ciascun disco. È estremamente importante calcolare, formulare e preparare correttamente le soluzioni per garantire repliche consistenti.

Attendere due minuti, quindi spingere completamente i dischetti nelle rispettive pipette. Una volta caricati, sigillare immediatamente ogni pipetta con del param. Ripetere questa preparazione delle pipette per il numero desiderato di repliche.

Utilizzando lo stesso protocollo, preparare un controllo negativo contenente solo pentani e controlli positivi, in questo caso acetofenone ed ormone sessuale. Procedere ora con la preparazione delle antenne degli insetti.

In questo esperimento, un preamplificatore trasmette il segnale da un elettrodo a forcella allo strumento di acquisizione EAG. Il software fornito con lo strumento EAG deve essere configurato adeguatamente nel software. Configurare le impostazioni impostando innanzitutto la frequenza di campionamento a 106,7.

Impostare l'interruttore di rettifica su "know" e il filtro su zero fino a 42 hertz nella scheda del filtro. Impostare il filtro EAG su "on" e il taglio basso su 0,1 hertz. Quindi salvare le impostazioni in un file di configurazione per un utilizzo futuro.

Utilizzare il programma è quindi semplice come aprire un nuovo file di progetto, salvarlo con un nome specifico e procedere con la registrazione. L'icona del triangolo rosso avvia il processo di registrazione e rimane attiva per un tempo predeterminato per ogni singola soffiata. Quando tutte le soffiate sono state eseguite per le antenne, l'icona della croce nera interrompe la registrazione, rendendo più facile leggere con precisione le risposte EAG.

Un piccolo righello può essere fissato con del nastro allo schermo del computer all'altezza della linea di base del segnale. La risposta viene registrata in millimetri e successivamente convertita nell'ampiezza in microvolt. Se necessario, le registrazioni possono essere riascoltate per ulteriori valutazioni.

In questo esempio, vengono utilizzate arance navali di tre o quattro giorni e falene maschio e femmina accoppiate. Tuttavia, questo protocollo può essere adattato ad altri insetti. Trasferire ciascun insetto in un piccolo contenitore di plastica con lettiera.

Nel giorno dell'analisi, subito prima del saggio biologico, inserire l'insetto nell'apertura larga della punta di una pipetta, che presenta un'apertura più piccola, appena sufficiente a far passare la testa. Quindi, utilizzando una punta di pipetta più piccola, spingere con attenzione l'insetto verso l'apertura ridotta finché la testa non risulti visibile al microscopio stereoscopico. Assicurarsi che le antenne siano fissate all'interno del tubo di contenimento e che la base delle antenne sia esposta per l'escissione.

Posizionare successivamente il supporto per forcella con un sottile strato di gel elettrodico in prossimità dell'antenna; utilizzando forbici microchirurgiche, separare delicatamente e quindi escindere entrambe le antenne, avviando contemporaneamente un cronometro per registrare il tempo trascorso tra questo evento e lo stimolo successivo. Utilizzando uno strumento con punta metallica e un piccolo quantitativo di gel all'estremità, prelevare un'antenna e posizionarla sulla forcella. Assicurarsi che la base dell'antenna sia appoggiata sull'elettrodo di riferimento non rosso (ground) della forcella.

Eseguire la stessa operazione per la seconda antenna. Posizionare la base dell'antenna sullo stesso lato della forcella, a due o tre millimetri di distanza, mantenendo l'antenna in posizione. Tagliare le punte delle antenne secondo necessità.

Applicare l'elettrodo al gel con un pennello e assicurarsi che la base e la punta siano immerse nel gel elettrodico in modo da non lasciare bolle d'aria nel gel. Evitare di coprire la porzione centrale dell'antenna con il gel, per massimizzare la superficie dell'antenna esposta al soffio di composti volatili. Una volta che il preparato è stato correttamente gelificato, collegare la forcella al preamplificatore della sonda.

Ora applicare un flusso di aria umidificata sulla preparazione per mantenere la vitalità del prep dell'antenna. Dopo 10 minuti dal momento dell'escissione, procedere applicando il primo stimolo. L'ordine delle operazioni per stimolare una preparazione inizia e termina con un controllo positivo, alternando una sequenza randomizzata di composti senza composti identici consecutivi e includendo almeno un controllo negativo; il numero di composti somministrati a un'antenna varia in base alla specie.

Un preparato di farfalla del verme dell'arancia può rimanere attivo per più di 30 minuti, consentendo l'analisi rapida di fino a 10 composti volatili con un numero ridotto di repliche. Lo stesso principio di somministrazione del campione si applica a schermate successive di miscele di composti che hanno mostrato di provocare risposte nella schermata preliminare. La prima pipetta per lo stimolo deve essere preparata 30 secondi prima dell'applicazione della bolla d'aria: suggellare la pipetta e posizionarla nel supporto in modo che diriga il flusso d'aria a due o tre millimetri dalle antenne, dieci minuti dopo l'escissione dell'antenna.

Somministrare la prima soffiata di stimolo nell'arco di uno-due secondi a 300 millilitri al minuto. Ora, sostituire rapidamente la pipetta in modo che, un minuto dopo il primo stimolo, venga somministrato il secondo. Mantenere una coerenza tra i campioni ridurrà al minimo la variabilità delle quantità di composti volatili effettivamente erogati.

Dopo l'amministrazione dell'ultimo soffio di controllo positivo, rimuovere l'antenna e pulire la forcella. Con una salvietta satura di etanolo, lasciarla asciugare completamente prima di un successivo utilizzo. Per aumentare la produttività dei saggi, un assistente dovrebbe preparare l'antenna successiva con forcelle pulite 10 minuti prima della fine delle preparazioni precedenti.

Sequenza di prova, è necessaria più di una forcella per questo metodo. Dopo ogni esperimento, eutanasia le falene di prova in un ambiente con ghiaccio secco e disseca le falene femmine per verificare il loro stato di accoppiamento. Si presuppone che i maschi conviventi si siano accoppiati; l'antenna del verme arancione navale è stata stimolata con soffi di due secondi e sono state effettuate registrazioni di dieci secondi con una finestra di dieci secondi su una scala di cinque millivolt.

Una deflessione negativa era la risposta tipica. Tuttavia, furono registrati i valori assoluti. Tutte le preparazioni femminili con una risposta debole al controllo positivo furono scartate.

La risposta media dei preparati rimanenti era di 2.600 microvolt. Analogamente, la risposta media dei maschi al controllo del pH sessuale era tipicamente di 3000 microvolt. Pertanto, gli anani con una risposta al di sotto dello standard sono stati scartati; i dati provenienti da antenne che mostravano una risposta degradata durante la prova sono stati anch'essi scartati.

Si è verificato un degrado se la risposta di Anton allo stimolo della puffata finale di controllo positivo era inferiore al 75% della prima puffata del controllo pre-con oppure inferiore alla seconda puffata del controllo pre-con per le restanti prove sperimentali. I valori di risposta sono stati analizzati prendendo le misurazioni grezze di ogni prova e sottraendo da ogni valore di quella prova la risposta del controllo negativo relativo alla stessa prova. Successivamente, tutti i controlli positivi di ciascuna prova sono stati mediati e corretti a 1000 microvolt, annotando il rapporto di correzione a 1000 microvolt per ogni prova.

I valori dei composti testati sono stati quindi moltiplicati per il rapporto di correzione del controllo positivo. Infine, la risposta corretta media di ciascun composto testato su tutte le prove è stata confrontata per valutare la candidatura di ciascun composto per ulteriori indagini. Non dimenticare che lavorare con sostanze chimiche può essere estremamente pericoloso e si devono sempre adottare le opportune precauzioni.