Un liquido fase di cattura test affinità utilizzando biglie magnetiche per studiare interazioni proteina-proteina: il poliovirus-Nanobody Esempio

Questo protocollo utilizza l'interazione tra poliovirus e poliovirus, riconoscendo nano corpi per dimostrare un semplice saggio quantitativo di cattura dell'affinità in fase liquida. Principalmente le biglie magnetiche rivestite di cobalto vengono utilizzate per estrarre le proteine marcate e qualsiasi proteina radiomarcata interagente. Innanzitutto, mescola le proteine marcate e marcate e incubale a temperatura ambiente.

Quindi aggiungere perline magnetiche che riconoscano l'etichetta, separare la frazione legata della proteina marcata dalla frazione non legata utilizzando i magneti. Quindi misurare il segnale della proteina marcata che si trova nella frazione non legata e determinare la quantità di proteina marcata che si trova nella frazione non legata. I risultati di questo test di affinità in fase liquida sono estremamente utili quando vengono analizzate proteine sensibili alla conversione di conferma.

Questo test di acquisizione di affinità in fase liquida può fornire informazioni sull'interazione tra il poliovirus, riconoscendo i nano boie e diversi antigeni del poliovirus. Il metodo può essere applicato anche ad altre interazioni proteiche proteiche, a condizione che una proteina possa essere marcata e l'altra possa essere rilevata. Abbiamo avuto l'ID per questo metodo quando eravamo interessati a studiare l'interazione tra il poliovirus, riconoscendo i nanocorpi e diversi antigeni del poliovirus.

Poiché il poliovirus è sensibile alla conversione di conferma, quando è attaccato a una superficie solida, l'uso di e LSA è limitato. Dovrebbe quindi essere preferito un sistema basato sulla fase liquida. Un esempio di tale sistema basato sulla fase liquida spesso utilizzato nella ricerca sul poliovirus è la microproteina.

Un test di immunoprecipitazione. Anche se questo test ha dimostrato la sua applicabilità, richiede la struttura cristallizzata di un anticorpo convenzionale, che è assente nei nanocorpi. Questi nanocorpi, che sono anticorpi a dominio singolo interessanti e molto stabili, possono essere facilmente ingegnerizzati con testo diverso.

Il ampiamente usato. Lo stack mostra affinità per gli ioni bivalenti, come il nichel e il cobalto, che a loro volta possono essere facilmente rivestiti su perline magnetiche. Abbiamo quindi sviluppato il semplice saggio di acquisizione di affinità quantitativa basato su sfere magnetiche rivestite di cobalto.

Reese's è lo stock di perle magnetiche a vortice e trasferisce 10 microlitri per ogni campione in un tubo pellet le perle utilizzando un magnete. Rimuovere il supinato chiaro per lavare le perline. Aggiungere 150 microlitri di tampone legante.

Raccogli le perline usando un magnete e rimuovi il supinato dopo un secondo lavaggio. Risospendere le perle in 40 microlitri di tampone legante per ogni campione da controllare. Per lo sfondo del primo campione, preparare un pozzetto senza virus radiomarcato, ma con lo stesso volume di tampone di legame per il controllo.

Campione due di attività radio al 100%. Aggiungere tutti i componenti in un pozzetto, tranne sostituire il nano corpo con un tampone legante. Ora aggiungete 2000 conteggi al minuto di poliovirus marcato S 35 di tipo sette di tipo uno in un volume totale di 80 microlitri di tampone legante a tutti i campioni.

Accetta il controllo. Esempio uno. Aggiungere 10 microlitri di diluizione nano corporea a ciascun campione.

Mescolare bene per 10 secondi su uno shaker e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere 40 microlitri della sospensione di microsfere magnetiche lavate e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente sotto agitazione continua, pellettare le perle con un magnete e trasferire il natante SUP chiarito in una provetta per misurare la radioattività di ciascun campione, trasferire 50 microlitri di supinato in un pallone di conteggio. Aggiungere tre millilitri di miscela di fluido di scintillazione e leggere su questo isolamento.

Controtirare le perle magnetiche usate in una provetta con acqua e centrifugare 500 volte G per due minuti. Scartare il supinato e risospendere le perle in sei millilitri di idrossido di sodio molare 0,5. Quindi aliquotare la sospensione in più provette e incubare in un bagno a ultrasuoni per cinque minuti.

Dopo aver pellettato le perle con un magnete e rimosso il supinato, aggiungere un millilitro di soluzione SDS al 2% in ciascun tubo, quindi mescolare a vortice e laminare per cinque minuti. Ora, raccogli le perline. Aggiungere un millilitro di EDTA 0,2 molare pH sette a ciascuna provetta e incubare le provette in un bagno a ultrasuoni per cinque minuti.

Quindi raccogliere le perline, lavare le perle con un millilitro d'acqua tre volte seguito da un millilitro di soluzione di cloruro di cobalto da 10 millimolari. Mettere i tubi su uno shaker per 10 minuti. Procedere alla raccolta delle perline su un magnete e sospenderle in un millilitro di tampone legante.

Lavare due volte in un millilitro di etanolo al 20%, infine risospendere le perle nel loro volume originale di etanolo al 20% per ottenere perle rigenerate in una concentrazione di 40 milligrammi per millilitro. Correggere la radioattività di fondo impostando il controllo. Il campione uno come valore di radioattività 0% e il campione di controllo due come valore di radioattività 100%.

Ora, per ogni campione, calcolate la percentuale di radioattività nello stato come misura della precipitazione complessiva del virus radiomarcato da parte del nanocorpo. Questo esperimento valuta l'affinità di PVSS 38 C e anticorpi specifici per il poliovirus utilizzando tre diversi antigeni del poliovirus, antigene nativo, antigene riscaldato e subunità 14 s. È interessante notare che la radioattività nello stato dei campioni contenenti subunità 14 s radiomarcate diminuisce con l'aumento delle concentrazioni del nano corpo PVSS 38 C. Ciò indica un aumento della quantità di subunità 14 s del poliovirus collegate al nano corpo P pvs, S 38 C e indirettamente alle sfere magnetiche.

Poiché non si osserva alcuna affinità di pvs S 38 C per la forma antigenica N e H antigenica del poliovirus, il nano corpo sembra specifico per la subunità 14 s del poliovirus. L'affinità del nanocorpo verso i suoi antigeni, misurata con questo metodo, è specifica come il nanocorpo non correlato. NB uno non mostra reattività contro le tre forme antigeniche di poliovirus.

Questo sistema produce un'elevata riproducibilità come indicato in questa curva dose-risposta generata da diversi ricercatori in giorni diversi. Una volta padroneggiata questa fase liquida affidabile, il test di acquisizione dell'affinità può essere eseguito correttamente entro due ore dal riciclo dei battiti inclusi. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come utilizzare questo saggio di acquisizione dell'affinità in fase liquida basato sui battiti magnetici quando studiate l'interazione tra diverse proteine, soprattutto quando non è possibile utilizzare sistemi basati su fase solida.