Rilevamento di Rare varianti genomiche da Sequencing pool Uso SPLINTER

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di identificare i geni all'interno di una popolazione di individui che mostrano una preponderanza di rara variazione funzionale. Ciò si ottiene raggruppando prima una popolazione di campioni di DNA. Il secondo passo consiste nel creare e sequenziare una libreria di sequenziamento di nuova generazione.

Segue l'allineamento delle letture alla sequenza di riferimento e la creazione di un modello di errore. Il passaggio finale è l'analisi computazionale utilizzando l'algoritmo splinter. In definitiva, l'analisi delle schegge del sequenziamento aggregato di nuova generazione viene utilizzata per mostrare i geni all'interno delle popolazioni che ospitano una preponderanza di rara varianza funzionale Dimostrando la procedura.

Oggi sarà la volta di Francesco Vilania, che è uno studente laureato nel laboratorio del mio mentore e nostro collaboratore, Rob Mitra, e sarà affiancato da Enrique Ramos, uno studente laureato nel mio laboratorio. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i singoli genotipi, è che consente di rilevare con precisione varianti di sequenza rare in una popolazione mista di molecole di DNA senza richiedere alcuna informazione preventiva. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della genetica e della genomica, ad esempio come determinare la frequenza di nuove varianti rare che causano malattie in studi di coorte di grandi dimensioni.

Ogni esperimento di scheggia richiede la presenza di un controllo negativo e positivo per ottenere un'accuratezza ottimale, preparare la miscela di reazione PCR utilizzando PFU ultra high fidelity. DNA polimerasi. Il controllo negativo è un prodotto della PCR da qualsiasi sequenza di DNA nota per essere priva di variazioni genetiche, come una spina dorsale vettoriale clonata.

Qui, viene utilizzato un amplicone da 1.934 coppie di basi del vettore M 13 MP 18. Il controllo positivo può essere qualsiasi insieme di varianti di sequenza precedentemente convalidate presenti nell'intera popolazione. Se questi dati non sono disponibili, questo laboratorio ha progettato un controllo positivo artificiale costituito da una base 331 per prodotto PCR da una miscela di sequenze ingegnerizzate clonate nel vettore facile PGMT come elencato in questa tabella.

Queste sequenze vengono combinate per imitare varie frequenze alleliche minori di varianti reali all'interno del pool di pazienti. Dopo l'amplificazione PCR dei campioni, come discusso nel protocollo scritto che accompagna questo video, pulire ogni prodotto PCR dai primer in eccesso utilizzando la purificazione rapida della colonna kyogen kayak o piastre filtranti a 96 pozzetti con collettore a vuoto per una pulizia su larga scala. Una volta purificato, quantificare ogni prodotto PCR utilizzando tecniche standard.

Prepararsi a combinare tutti i prodotti e i controlli PCR in un pool normalizzato per numero di molecole. Il raggruppamento per concentrazione risulterà in una sovrarappresentazione di piccoli ampliconi rispetto a prodotti più grandi. Invece, metti insieme un numero normalizzato di molecole per ampliconi.

Scegliere numeri arbitrari sufficientemente grandi da mantenere l'accuratezza durante il pipettaggio. Estrarre i prodotti e i controlli PCR. La legatura dei prodotti della PCR è necessaria perché la frammentazione dei piccoli richiedenti PCR probabilmente distorcerà la rappresentazione verso i loro fini.

Per questo motivo, lighiamo i prodotti pull PCR in grandi contorsioni prima della loro frammentazione. Preparare la miscela per la legatura con estremità smussata utilizzando T quattro ligasi, T quattro PNK e PEG come elencato nel protocollo. Incubare la reazione a 22 gradi Celsius per 17 ore.

Seguire con l'incubazione a 65 gradi Celsius per 20 minuti e mantenere a quattro gradi Celsius. Controllare la legatura caricando 50 nanogrammi di campione in un gel di arosi. Una legatura riuscita si tradurrà in una banda ad alto peso molecolare presente nella corsia.

Preparati alla frammentazione del DNA attraverso una strategia di sonicazione casuale diluendo il campione 10 a uno nel tampone PB Qiagen per renderlo meno viscoso. Quindi frammentare il grande cono di prodotti PCR utilizzando una biorottura del nodo diagon di 24 campioni, sonicare ad alta potenza nel corso di 25 minuti con 40 secondi di accensione e 20 secondi di spegnimento al minuto. Verificare i risultati della frammentazione del DNA su un agro gel e procedere con il sequenziamento illuminato come descritto nel testo.

Per iniziare la sequenziazione, leggere allineamento. Converti la sequenza non elaborata, leggi i file in formato scarf o comprimili. La compressione è facoltativa.

Risparmia tempo e spazio per le successive fasi di analisi senza perdere alcuna informazione rilevante. Utilizzando lo strumento di allineamento incluso, allineate le letture non elaborate alla sequenza di riferimento più veloce annotata. Specifici per le regioni target includono le reazioni PCR e i controlli positivi e negativi.

Il formato di input deve essere in formato sciarpa o compresso. Quindi, esegui l'assegnazione di tag ai file come descritto nel testo. Ogni esecuzione genera un profilo univoco di errore di sequenziamento da caratterizzare per una chiamata accurata delle varianti per modellare gli errori per ogni esecuzione.

Un controllo interno noto per essere distribuito della variazione di sequenza è incluso in ogni libreria di campioni del pool Dal file con tag allineato. Genera un file del modello di errore utilizzando lo strumento incluso con la sequenza di riferimento del controllo negativo, tutta la sequenza di controllo negativo può essere utilizzata o in alternativa solo un sottoinsieme quando specificato dalle sue cinque estremità prime e tre prime. Le letture univoche e gli pseudo conteggi devono essere sempre applicati.

Lo strumento genererà tre file denominati come parametro del nome del file di output che terminano con zero, uno o due. Questi file corrispondono a un modello di errore del primo e del secondo ordine pari a zero, rispettivamente, per la chiamata di varianti con splinter. Il modello di errore del secondo ordine deve essere sempre utilizzato per la visualizzazione del profilo del tasso di errore di esecuzione.

Lo script Pearl utilizzato per tracciare il grafico del modello di errore può essere utilizzato per generare un grafico di errore PDF sul file del modello di errore di ordine zero. Il file di tracciato rivelerà tendenze di errore specifiche per l'esecuzione e può essere utilizzato per dedurre il numero massimo di basi di lettura per l'analisi. La sezione seguente dimostrerà come eseguire lo splinter sul file allineato utilizzando il modello di errore per rilevare varianti di sequenza rare.

Il primo passo dell'analisi consiste nell'eseguire lo splinter sul file allineato utilizzando la sequenza di riferimento e il modello di errore. Le basi a lettura singola possono essere escluse dall'analisi se risultano difettose. Il valore limite P determina quanto sarà rigorosa l'analisi delle chiamate delle varianti.

Un cutoff minimo di meno 1,301 è un buon inizio. L'opzione della dimensione del pool ottimizza il segnale dell'algoritmo per la discriminazione del rumore eliminando la varianza potenziale con frequenze alleliche minori inferiori a quelle di un singolo allele nel pool effettivo. L'opzione della dimensione del pool deve essere impostata sul valore più vicino che è maggiore del numero effettivo di alleli analizzati nell'esperimento.

La varianza chiamata alle frequenze più basse verrà ignorata come rumore. Dopo aver inserito tutti i parametri e i nomi dei file, eseguire splinter. Questo file restituisce tutti gli hit statisticamente significativi nel campione con una descrizione della posizione del tipo di variante.

Valore P per filamento di DNA, frequenza della variante e copertura totale per filamento di DNA. La fiala dell'elenco viene utilizzata da splinter per normalizzare la copertura in tutto il campione. Il primo campo indica l'amplicone di interesse, mentre il secondo campo indica la posizione in cui è presente la mutazione.

N indica che il resto della sequenza non contiene alcuna mutazione. Una normalizzazione, l'analisi del controllo positivo è la chiave per massimizzare la sensibilità e la specificità per una particolare corsa. Questo è importante perché molto probabilmente il cutoff iniziale di meno 1,301 non sarà sufficiente per eliminare tutti i falsi positivi.

Ogni analisi delle schegge mostrerà il valore P effettivo per ogni variante chiamata, che non può essere prevista come priorità. Tuttavia, l'intera analisi può essere ripetuta utilizzando il valore P meno rigoroso visualizzato nell'output iniziale per le posizioni di base positive note. Ciò servirà a mantenere tutti i veri positivi escludendo la maggior parte, se non tutti, i falsi positivi, che in genere hanno valori P molto meno significativi rispetto ai veri positivi.

Per automatizzare questo processo, è possibile utilizzare lo script del tester di taglio. Lo script del tester di cutoff richiede un file di output splinter e un elenco di hit di controllo positivi sotto forma di un file delimitato da tabulazioni come quello utilizzato per la normalizzazione. L'output risultante sarà un elenco di cutoff che raggiungono progressivamente quello ottimale.

L'ultima riga rappresenta il cutoff ottimale per la corsa e può quindi essere utilizzata per l'analisi dei dati. Il risultato ottimale è quello di raggiungere la sensibilità e la specificità di uno. Tuttavia, se non viene raggiunta, l'analisi delle schegge può essere ottimizzata modificando il numero di basi di lettura incorporate.

Il taglio finale può essere applicato ai dati utilizzando lo script di taglio taglio, che filtrerà il file di output della scheggia dai colpi al di sotto del taglio ottimale. Questo passaggio genererà il file di output splinter finale, che conterrà snip e indels presenti nel campione. Si noti che l'output per gli inserimenti è leggermente diverso da quello per le sostituzioni o le eliminazioni.

L'accuratezza in funzione della copertura di un singolo allele in un campione aggregato viene visualizzata in questo tipo di grafico. L'accuratezza è stimata come l'area sotto la curva abbreviata in UC di una curva dell'operatore ricevitore e varia da una precisione casuale di 0,5 a una precisione perfetta di 1,0. In questo esempio, una UC viene tracciata in funzione della copertura per allele per il rilevamento di singoli alleli mutanti in pool di 200.501.000 alleli.

Qui una UC viene tracciata in funzione del totale per inserimenti, delezioni e sostituzioni. Questo grafico degli errori mostra la probabilità di incorporare una base errata in una data posizione. Il profilo di errore mostra bassi tassi di errore con una tendenza crescente verso le tre estremità prime della lettura del sequenziamento.

In particolare, nucleotidi di riferimento diversi mostrano diverse probabilità di errore. Questo grafico rivela l'accuratezza di splinter nella stima della frequenza allelica per le posizioni che avevano una copertura superiore a 25 volte per allele. Un confronto tra le frequenze alleliche del DNA aggregato stimate da splinter con la conta degli alleli misurata da studi di associazione a livello di genoma o risultati GWAS.

In una correlazione molto alta, una popolazione di 974 individui è stata prelevata e mirata a oltre 20 kilobasi per il sequenziamento. Splinter è stato applicato per il rilevamento di varianti rare. Seguendo il protocollo standard, ogni individuo aveva precedentemente eseguito la genotipizzazione mediante concordanza gwas tra la genotipizzazione delle varianti marcate e quelle nuove.

Chiamati nel campione aggregato erano eccellenti. Tre varianti, due delle quali erano rare nella popolazione, sono state chiamate denovo dai risultati del sequenziamento e sono state convalidate dal sequenziamento piro individuale, dalle frequenze alleliche minori o dalla concordanza matematica tra il sequenziamento piro e il sequenziamento tirato era eccellente. Una volta che hai finito di trovare la tua varianza rara nel tuo campione aggregato, molte persone vogliono sapere quali sono le conseguenze funzionali della varianza che hai identificato.

Quindi l'annotazione della varianza diventa il passo successivo nel processo Dopo uno sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del sequenziamento del DNA per studiare varianti rare in modo rapido ed economico per caratterizzare varianti rare in studi su un'ampia popolazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come rilevare varianti di sequenza rare in un pool, un campione di DNA utilizzando una scheggia.