Fibroblast rimozione veloce da alta densità Culture staminali embrionali umane
28 ottobre 2012
Nonostante gli sforzi volti a culture di transizione a feeder liberi condizioni, la derivazione e la cultura di cellule staminali embrionali umane (hESC) rimangono in gran parte dipendente dal co-colture con alimentatori embrionali di topo (MEF). Qui vi mostriamo una nuova metodologia per la rapida rimozione di alimentatori da culture hESC prima della sperimentazione.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è isolare colonie di cellule staminali umane in modo rapido ed efficiente. Questo risultato si ottiene coltivando cellule embrionali umane su uno strato denso di fibroblasti embrionali di topo. Nel tempo, l'espansione della popolazione di cellule staminali aumenta il numero di cellule staminali umane, ma permette loro anche di formare colonie simili a isole nel mes.
Successivamente, lo strato di metionina viene rimosso mediante aspirazione, lasciando alle spalle le singole colonie di cellule staminali embrionali umane. I risultati della colorazione immunohistochimica per i marcatori delle cellule staminali mostrano che questo è un metodo efficace per eliminare le cellule di supporto e mantenere l'integrità delle colonie. Ebbi per la prima volta l'idea di questo metodo durante la coltura in co-coltura delle cellule nel nostro laboratorio; desideravo salvare le colture di cellule staminali dai sistemi di coltura troppo confluenti.
Il problema che la maggior parte delle persone incontrerà nell'utilizzo di questo sistema è la mancanza di esperienza nella coltura di cellule staminali umane. Abbiamo trovato questa tecnica particolarmente utile quando è necessario isolare un elevato numero di cellule staminali embrionali umane per esperimenti, rispetto ad altri metodi come il sorting o la selezione manuale delle colonie di cellule staminali. Questo metodo è più rapido ed efficiente per isolare colonie da colture ad alta densità.
I fibroblasti embrionali murini devono essere trattati con mitomicina C o irradiati prima della coltivazione in co-coltura con cellule staminali embrionali, per impedire loro di andare incontro a divisione. Due ore prima della semina dei meph, rivestire ogni piastra da coltura da 60 millimetri trattata al plasma con due millilitri di gelatina allo 0,05%. Scongelare un'ampolla di mes trattati, centrifugare per cinque minuti a 1.500 giri al minuto e seminare. Seminare una coltura di circa 20.000 cellule per centimetro quadrato sulla piastra rivestita di gelatina e incubare la coltura durante la notte per le cellule aderenti. Nuove colture possono essere avviate da cellule criopreservate o trasferendo le colture attuali su piastre rivestite con metionina. Quando si inizia da una piastra contenente ampie colonie di cellule staminali embrionali umane, lavare una volta con tre millilitri di soluzione salina tamponata al fosfato riscaldata.
Aggiungere tre millilitri di una soluzione di collaghenasi quattro da un milligrammo per millilitro e incubare da cinque a 10 minuti. A 37 gradi Celsius, le cellule non diventeranno distinte né si arrotonderanno come si osserva con la tripsina. Utilizzando il bordo della punta di una pipetta da cinque millilitri, creare un modello a griglia sulle colonie e frammentarle in piccoli aggregati cellulari.
Ora, tenendo la punta della pipetta in un angolo perpendicolare rispetto alla piastra di coltura, raschiare il fondo della piastra e staccare tutte le cellule dalla superficie. Trasferire le cellule in un tubo falcon per raccoglierle, centrifugare a 1000 giri al minuto per cinque minuti e aspirare il mezzo. Successivamente, aspirare il mezzo dai fibroblasti embrionali di topo seminati il giorno precedente.
Quindi si seminano le cellule staminali embrionali umane in un rapporto da uno a tre rispetto alla piastra originale e si aggiungono tre millilitri di mezzo per cellule staminali embrionali umane. Le cellule HECS vengono coltivate ad alta densità per 10-14 giorni. Si posiziona la punta di una pipetta aspirante sul bordo della piastra e si utilizza l'aspirazione per sollevare delicatamente il bordo del foglio di metile.
Rimuovere il mezzo dalla piastra. Lasciare che la punta catturi il foglietto cellulare, quindi spostare lentamente la punta in modo arcuato sopra la piastra. Se il foglietto ostruisce frequentemente la pipetta, rimuoverlo dalla coltura.
Battere leggermente la parte superiore della piastra di coltura con un aspiratore per completare la dispersione delle cellule ed eliminare le cellule mediante un'aspirazione completa. Sostituire immediatamente il mezzo per cellule staminali embrionali umane e reinserire la coltura nell'incubatore per colture cellulari dopo il semina nelle piastre di coltura. Questo sistema di co-coltura produce colonie dense di cellule staminali embrionali umane circondate da fibroblasti embrionali di topo.
La tecnica di aspirazione rimuove il MES e produce piccole colonie di cellule staminali embrionali umane indisturbate. Con pochissimi MES attorno alla colonia intatta, le colonie di cellule staminali embrionali possono subire un'espansione significativa, formando colonie molto grandi. Ad esempio, questa colonia di cellule staminali embrionali umane mostrata immediatamente dopo la rimozione del metionina si è espansa in una colonia molto grande, con identificazione mediante immunofluorescenza delle colonie fino a 10 giorni dopo la rimozione del metionina.
L'esaurimento mostra che le colonie mantengono l'espressione dei marcatori di pluripotenza e non mostrano differenziazione verso il destino mesodermico. Queste immagini in luce trasmessa mostrano la morfologia di colonie colorate con immunofluorescenza a diverse ingrandimenti. Il DAPI colora i nuclei delle cellule.
È importante notare che le cellule staminali embrionali umane esprimono i marcatori delle cellule staminali umane SSEA4, TRA-1-60 e TRA-1-81. Si osservi che le immagini mostrano una colonia con bordi tipicamente lisci. Esse non esprimono FLK1, un marcatore precoce della differenziazione mesodermica, né contengono fibroblasti, come dimostrato dall'assenza di colorazione per DDR2.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare colonie di cellule staminali umane utilizzando tecniche di coltura per manipolare gli ambienti naturali. Una volta padroneggiato questo metodo, l'operazione può essere eseguita in pochi secondi. Inoltre, non dimenticare di evitare che le colture si secchino durante la rimozione del mezzo e degli strati di detriti.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo rapido ed efficiente per isolare colonie di cellule staminali embrionali umane (hESC) da colture co-coltivate con fibroblasti embrionali di topo (MEFs). La tecnica sfrutta le proprietà fisiche delle colture confluenti per aspirare via lo strato di supporto di MEF, lasciando intatte le colonie di hESC, adatte a ulteriore espansione e sperimentazione.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Biologia delle cellule staminali
- Tecniche di coltura cellulare
- Biologia dello sviluppo
Sfondo
- Le cellule staminali embrionali umane (hESC) sono comunemente coltivate su strati di cellule MEF per prevenire la differenziazione spontanea.
- I metodi tradizionali di co-coltura sono laboriosi e producono una bassa purezza delle hESC.
- Tecniche alternative di purificazione (FACS, MACS, selezione farmacologica) sono costose, distruttive o inefficienti.
- Esiste la necessità di un metodo semplice e non distruttivo per isolare colonie pure di hESC dagli strati di cellule di supporto.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo rapido ed efficiente per isolare colonie di hESC da colture co-coltivate con MEF.
- Mantenere la pluripotenza e l'integrità delle colonie di hESC dopo la rimozione dei feeder.
- Permettere il recupero su larga scala di hESC per applicazioni successive.
Metodi Utilizzati
- Coltura di hESC su strati di cellule della granulosa MEF trattati con mitomicina C o irradiati.
- Preparazione di piastre di coltura rivestite con gelatina per la semina delle MEF.
- Trattamento enzimatico (collagenasi IV) e dissociazione meccanica per preparare colonie di hESC.
- Tecnica di aspirazione per rimuovere il monostrato di MEF, lasciando intatte le colonie di hESC.
- Colorazione immunohistochimica per marcatori di pluripotenza (SSEA-4, Oct3/4, Tra 1-81) e assenza di marcatori di differenziamento (FLK1, DDR2).
Risultati principali
- Il metodo di aspirazione rimuove in modo efficiente le MEF, producendo colonie pure di hESC.
- Le colonie di hESC mantengono l'espressione dei marcatori di pluripotenza fino a 10 giorni dopo la rimozione delle MEF.
- Le colonie conservano la tipica morfologia e si espandono significativamente dopo l'eliminazione dei feeder.
- Non è stata osservata alcuna evidenza di differenziazione mesodermica o di contaminazione da fibroblasti.
Conclusioni
- La tecnica di aspirazione è un metodo rapido, semplice ed efficace per isolare colonie di hESC da colture co-coltivate con MEF.
- Questo metodo preserva l'integrità e la pluripotenza delle colonie, facilitando ulteriori espansioni e sperimentazioni.
- Offre un'alternativa pratica a metodi di purificazione più laboriosi o distruttivi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento efficiente di colonie di cellule staminali embrionali umane (hESC) ad alta purezza è fondamentale per le fasi iniziali della scoperta scientifica e per i percorsi di ricerca traslazionale. La rapida rimozione, mediante aspirazione, degli strati di supporto costituiti da fibroblasti embrionali di topo (MEF) consente una purificazione scalabile e non distruttiva delle hESC, favorendo esperimenti e amplificazioni successivi solidi e riproducibili. Questo metodo affronta i principali colli di bottiglia nella terapia cellulare, nella modellizzazione delle malattie e nello sviluppo di saggi, migliorando l'integrità delle popolazioni cellulari e l'efficienza dei flussi di lavoro.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente la rapida generazione di popolazioni pure di hESC per studi basati su ipotesi.
- Riduce la contaminazione da cellule feeder, favorendo la validazione funzionale delle proteine bersaglio.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistica mantenendo i marcatori di pluripotenza dopo l'isolamento.
- Migliora l'affidabilità predittiva nei saggi biologici delle fasi iniziali.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce colonie standardizzate di hESC senza l'uso di cellule sentinella, adatte a piattaforme sperimentali riproducibili.
- Consente analisi quantitative di tipo immunohistochimico per valutare lo stato di pluripotenza e di differenziazione.
- Accelera la preparazione di sistemi cellulari validati per flussi di lavoro di screening di composti.
- Permette l'espansione scalabile di hESC per applicazioni ad alto rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Mantiene marcatori di pluripotenza rilevanti per la malattia per studi successivi di differenziamento.
- Garantisce continuità dalla scoperta alla validazione preclinica preservando l'integrità delle colonie.
- Riduce il rischio di artefatti delle cellule nutrici nelle analisi traslazionali di biomarcatori.
- Supporta l'avanzamento dei modelli cellulari con rischio adeguato.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di rimozione dei MEF basato sull'aspirazione si colloca tra la fase iniziale di scoperta e lo sviluppo del modello preclinico, consentendo una transizione senza interruzioni dall'ampliamento cellulare a saggi funzionali successivi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi fornendo colonie di cellule staminali embrionali umane pure e indifferenziate.
- Screening: Fornisce popolazioni cellulari riproducibili e prive di cellule di supporto per la standardizzazione dei saggi.
- Analisi: Permette la valutazione quantitativa della pluripotenza e della differenziazione mediante l'espressione dei marcatori.
- Ricerca traslazionale: Preserva l'identità cellulare per la modellizzazione delle malattie e la validazione dei biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Offre una capacità di purificazione rapida e scalabile, adattabile a diversi flussi di lavoro sulle cellule staminali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi basati sulle cellule staminali.
- Valore operativo: Semplifica la purificazione cellulare, riducendo il lavoro manuale e le difficoltà tecniche.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione garantendo ingressi cellulari ad alta purezza.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata ai rischi dei programmi di scoperta e traslazionali basati su cellule.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di cellule staminali e nella gestione degli strati di supporto.
- Necessita dell'accesso a strumentazione standard per la coltura cellulare e l'aspirazione.
- Richiede una standardizzazione tra i team per l'isolamento riproducibile delle colonie.
- Adattabile a diverse linee di hESC, ma dipendente dalla densità di coltura e dalle caratteristiche dei MEF.
- Limitazioni potenziali includono la variabilità dell'operatore e la necessità di conferma della purezza basata su marcatori.
