Name: Fibroblast rimozione veloce da alta densità Culture staminali embrionali umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-28T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Scopri un metodo rapido per isolare colonie di cellule staminali embrionali umane da co-culture con fibroblasti embrionali di topo. Questa tecnica di aspirazione preserva la pluripotenza e l'integrità delle colonie.

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Questo lavoro è stato finanziato da un premio II Facoltà di nuovo dal California Institute of Regenerative Medicine (RN2-00921-1), e un NIH-finanziato Premio Nazionale delle Ricerche (F32-HL104924)

1. Preparazione di Alimentatori embrionali di topo <ol><li> Il MEFs utilizzato nella co-coltura delle hESC devono essere preventivamente trattati mediante irradiazione o mitomicina-C per inibire le cellule dalla fase di divisione. </li><li> Due ore prima della semina MEF, cappotto ogni plasma 60 mm trattato piastra di coltura con 2 ml di 0,05% gelatina. </li><li> Scongelare una fiala di trattato MEF e piastra a ~ 20.000 cellule / cm 2. </li><li> Consentire alle cellule di aderire durante la notte. </li></ol> 2. Co-semina hESC sul MEF <ol><li> Nuove colonie possono essere avviate da colture crioconservati o passaging culture attuali sui nuovi MEF rivestite piatti, come indicato di seguito. </li><li> Lavare la piastra contenente le colonie hESC grandi da diversi passaggi 1 volta con 3 ml di caldo 1x PBS. </li><li> Aggiungere 3 ml di collagenasi IV / PBS soluzione (1 mg / ml), e incubare per 5-10 minuti a 37 ° C. (Nota: Le cellule non diventerà distinto o palla come visto con tripsina). </li><li> Mentre le cellule sono ancora nellacollagenasi, utilizzare un bordo di una punta di pipetta da 5 ml, creare un modello di griglia sulle colonie, il loro inserimento in ciuffi piccole cellule. </li><li> Utilizzare l&#39;estremità della punta di pipetta (tenuto in maniera perpendicolare alla piastra di coltura) a raschiare il fondo della piastra di coltura, rimuovendo tutte le cellule dalla superficie. </li><li> Raccogliere le cellule in un tubo Falcon e centrifugare a (1000 rpm) per 5 min. </li><li> Dopo centrifugazione, aspirare il terreno, lasciando il pellet di cellule nel tubo Falcon. </li><li> Aspirare il mezzo MEF dal placcato MEF il giorno prima. </li><li> Re-piastra le cellule in un rapporto 1:3 dalla piastra originale, e mangimi con 3 ml di terreno hESC </li></ol> 3. L&#39;esaurimento MEF dal Co-cultura Nota: le culture umane CES deve essere ad alta densità, di solito tra 10 e 14 giorni di coltura. <ol><li> Posizionare la punta di una pipetta aspirante sul bordo della piastra e consentire l&#39;aspirazione di tirare delicatamente il bordo del foglio MEF. </li><li> RTogliete il supporto dal piatto, e che questo venga a prendere il foglio di cella e spostare lentamente la punta in modo arcuato sopra la piastra. Nota: Il foglio può intasare la punta della pipetta, ma questo non è un problema in quanto non deve impedire all&#39;utente di tirare manualmente il foglio dalla superficie della piastra di coltura. Se le cellule sono bloccati alla fine dell&#39;aspiratore, è possibile utilizzare la parte superiore del piatto di coltura per rompere il foglio cella per la completa aspirazione. </li><li> Sostituire media hESC immediatamente, e mettere la piastra posteriore nell&#39;incubatore. </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Il risultato finale del processo di rimozione MEF produce piccole colonie hESC inalterate (Figura 1D) in grado di sottoporsi a una forte espansione in colonie molto grandi (Figura 2), pur mantenendo l&#39;espressione dei produttori di pluripotenza SSE-4 ottobre, ¾, e TRA 1-81 (Figura 3). Figura 1. ESC Colony Morfologia Prima e dopo la rimozione del MEF. Umani embrionali colonie di cellule staminali in A) giorno 1 e B) 2 ° giorno dopo la semina su piastre di coltura. C) ad alta densità Colonie umane embrionali cellule staminali (H7) circondato da MEF. Le due colonie hESC sono descritti nella trattini rossi. D) Dopo la rimozione MEF utilizzando la tecnica di aspirazione descritta, ci ritroviamo con una colonia di cellule staminali embrionali umane isolato con pochissimi MEF che circonda la colonia intatto. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3951/3951fig2.jpg" /> Figura 2. Colony espansione ESC 10 giorni dopo la rimozione MEF. La colonia hESC originale immediatamente dopo l&#39;esaurimento MEF (a sinistra) è consentito di espandersi in una colonia molto grande (a destra) approximately 800 micron, 10x. Si noti che la colonia originale immaginata allo stesso ingrandimento (10x) come colonia composito. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3951/3951fig3.jpg" /> Figura 3. Immunostaining del MEF-impoverito colonie hESC. Identificazione immunofluorescente delle colonie fino a 10 giorni dopo l&#39;esaurimento MEF indica che le colonie mantenere la loro espressione di marcatori di pluripotenza, come evidente da ottobre ¾, SSE-4, e Tra-1-81 colorazione. Inoltre, queste colonie hESC non presentano differenziazione verso un destino mesodermica, indicato dall&#39;assenza di Flk-1. A, E, I e M) sono immagini di trasmissione della luce delle colonie immunoflouscently macchiati, 20, 10, 10 e 2x, . rispettivamente B, F, J e N) mostrano i nuclei -. cellule DAPI colorate delle colonie immunofluorescently macchiati, 20, 10, 10 e 2x, rispettivamente CD) mostrano l&#39;espressione dimarcatore di cellule staminali umane SSE-4 solo, e l&#39;immagine composita, 20x. GH) mostrano l&#39;espressione di cellule staminali umane marcatore ottobre ¾ solo, e l&#39;immagine composita, KL 10x.) mostrano l&#39;espressione del marcatore di cellule staminali umane Tra 1-81 solo , e l&#39;immagine composita, 10x. MP) L&#39;ultima riga se le immagini ritraggono una colonia raffigurante i confini tipici lisce visto in questo ingrandimento, 2x, e queste colonie non ha espresso O) Flk-1, un marker precoce di differenziazione mesoderma, né essi P) contiene fibroblasti come dimostra l&#39;assenza di colorazione DDR2. Video supplementare. Rimozione fibroblasti da aspirazione Foglio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3951/3951movie1.mp4" target="_blank">Clicca qui per visualizzare filmati</a> .

<ol><li>Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+inner+cell+mass+cells+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts.</a> Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).</li>
<li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts%3A+somatic+differentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).</li>
<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+scalable+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions.</a> Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).</li>
<li>Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+surfaces+for+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture.</a> J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).</li>
<li>Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+culture+system+using+human+foreskin+fibroblasts+as+feeder+cells+allows+production+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells.</a> Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).</li>
<li>McKay, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+feeder+cell+line+for+derivation+and+culture+of+hESc%2FhiPSc%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc.</a> Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStein%2C+GS+%22Thawing%2C+Seeding%2C+and+Changing+Medium+of+Human+Embryonic+Stem+Cells%22">Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells</a>. Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol. Biol. 767, 107-123 Forthcoming.</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo presentato in questo manoscritto offre un&#39;alternativa rapida e meno costosa per eliminare cellule di alimentazione fibroblasti umani da colture di cellule embrionali. Un&#39;efficace rimozione dei fibroblasti dipende dall&#39;esistenza di un monostrato confluente strettamente di queste cellule che si sviluppa in colture di cellule staminali più lunghi. Dopo 7-10 giorni, le colonie hESC crescenti spingerà i fibroblasti feeder in una direzione verso l&#39;esterno, generando un monostrato di fibroblasti sempr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> DDR2 </td><td> Santa Cruz </td><td> 7555 </td><td> Fibroblast Marker </td></tr><tr><td> Dapi </td><td> Calbiochem </td><td> 268298 </td><td> Nucleo cellulare Marker </td></tr><tr><td> SSE-4 </td><td> Millipore </td><td> MAB4304 </td><td> Umano ESC Marker </td></tr><tr><td> Oct 3/4 </td><td> Santa Cruz </td><td> 9081 </td><td> Umano ESC Marker </td></tr><tr><td> Flk-1 </td><td> BD Pharma </td><td> 555307 </td><td> Differenziazione marker precoce </td></tr><tr><td> Tradi-1-81 </td><td> Acris </td><td> AM20377AF4-S </td><td> Umano ESC Marker </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Tabella di motivi specificisignori utilizzato per la immunocolorazione cellule staminali embrionali umane.

fibroblast rimozione veloce da alta densità culture staminali embrionali umane

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Mouse fibroblasti embrionali (MEF) sono stati usati per creare cellule staminali embrionali umane (hESC) colture dopo l&#39;isolamento blastocisti 1. Questo sistema di alimentazione mantiene hESCs dal subire differenziazione spontanea durante l&#39;espansione delle cellule. Tuttavia, questo metodo di co-cultura è un lavoro dispendioso, richiede personale altamente qualificato, e la purezza hESC rendimenti bassi 4. Molti laboratori hanno tentato di minimizzare il numero di cellule feeder in colture hESC (cioè incorporando matrice rivestite piatti o altri tipi di cellule alimentatore 5-8). Questi sistemi di coltura modificati hanno mostrato qualche promessa, ma non hanno soppiantato il metodo standard per hESC coltura con fibroblasti di topo mitomicina C trattati con embyronic al fine di ritardare indesiderato differenziazione spontanea delle culture hESC. Pertanto, le cellule di alimentazione utilizzati in espansione hESC devono essere rimosse durante esperimenti di differenziazione. Sebbene diverse tecniche sono disponibili per purificare il co hESClonies (FACS, MACS, o l&#39;uso di vettori resistenti ai farmaci) da alimentatori, queste tecniche sono alta intensità di manodopera, costoso e / o distruttiva per la cellule staminali embrionali umane. Lo scopo di questo progetto è stato quello di inventare un metodo di purificazione che consente la raccolta di una popolazione pura di hESC. Abbiamo osservato che in una cultura hESC confluenti, la popolazione MEF può essere rimosso con una semplice e rapida aspirazione del foglio MEF. Questa rimozione dipende da diversi fattori, tra laterale cellula-cellula legame di MEFs che hanno una bassa affinità di legame alla piastra di coltura stirene, e la capacità di colonie di cellule staminali per spingere i fibroblasti verso l&#39;esterno durante la generazione della propria &quot; di nicchia &quot;. Il hESC sono stati poi esaminati per SSE-4, Oct3 / 4 e Tra 1-81 espressione fino a 10 giorni dopo la rimozione MEF per garantire il mantenimento della pluripotenza. Inoltre, le colonie hESC sono stati in grado di continuare a crescere in grandi formazioni da dopo la rimozione del MEF, che fornisce un ulteriore livello di espansione cellule staminali embrionali umane.

Nonostante gli sforzi volti a culture di transizione a feeder liberi condizioni, la derivazione e la cultura di cellule staminali embrionali umane (hESC) rimangono in gran parte dipendente dal co-colture con alimentatori embrionali di topo (MEF). Qui vi mostriamo una nuova metodologia per la rapida rimozione di alimentatori da culture hESC prima della sperimentazione.

Fibroblast rimozione veloce da alta densità Culture staminali embrionali umane

I fibroblasti embrionali di topo (MEF) sono stati utilizzati per stabilire colture di cellule staminali embrionali umane (hESC) dopo l'isolamento della blastocisti1. Questo sistema di feeder ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è isolare colonie di cellule staminali umane in modo rapido ed efficiente. Questo risultato si ottiene coltivando cellule embrionali umane su uno strato denso di fibroblasti embrionali di topo. Nel tempo, l'espansione della popolazione di cellule staminali aumenta il numero di cellule staminali umane, ma permette loro anche di formare colonie simili a isole nel mes.Successivamente, lo strato di metionina viene rimosso mediante aspirazione, lasciando alle spalle le singole colonie di cellule staminali embrionali umane. I risultati della colorazione immunohistochimica per i marcatori delle cellule staminali mostrano che questo è un metodo efficace per eliminare le cellule di supporto e mantenere l'integrità delle colonie. Ebbi per la prima volta l'idea di questo metodo durante la coltura in co-coltura delle cellule nel nostro laboratorio; desideravo salvare le colture di cellule staminali dai sistemi di coltura troppo confluenti.Il problema che la maggior parte delle persone incontrerà nell'utilizzo di questo sistema è la mancanza di esperienza nella coltura di cellule staminali umane. Abbiamo trovato questa tecnica particolarmente utile

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Questo articolo descrive un protocollo per l'isolamento e il mantenimento delle colture primarie di fibroblasti della pelle e tessuto polmonare dei roditori selvatici.

Stabilire colture primarie di fibroblasti adulti dai roditori

Il comportamento dei fibroblasti è alla base di uno spettro di entità cliniche, ma rimangono scarsamente caratterizzate, in gran parte a causa della loro intrinseca eterogeneità. La ricerca tradizionale sui fibroblasti si basa sulla manipolazione in vitro, mascherando il comportamento dei fibroblasti in vivo. Descriviamo un protocollo basato su FACS per l'isolamento di fibroblasti cutanei di topo che non richiede colture cellulari.

Murino Dermal fibroblasti Isolation di FACS

Descriviamo una procedura sperimentale semplice e rapido per la generazione di fibroblasti primari dalle orecchie e le code di topi. La procedura non richiede addestramento speciale animali e può essere utilizzato per la generazione di colture di fibroblasti da spighe conservati a temperatura ambiente per 10 giorni.

Generazione di primaria fibroblasti culture da orecchio e coda tessuti di topo

Una robusta derivazione di cellule pluripotenti indotte da humano (hiPS) è stata ottenuta utilizzando riprogrammazione mediata dei fibroblasti dermici da virus Sendai (SeV) non integrante. La manutenzione delle cellule hiPS e l'espansione clonale sono state eseguite usando condizioni di coltura xeno-free e chimicamente definite con matrice umana laminina 521 (LN-521) e Essential E8 (E8) Medium ricombinante.

Derivazione libera dell&#39;integrazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall&#39;uomo usando la matrice Laminina 521

Qui descriviamo un metodo clinicamente rilevante, ad alta efficienza e privo di alimentatore per riprogrammare i fibroblasti primari umani in cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando modificate mRNA che codificano per fattori di riprogrammazione e maturo microRNA-367/302 imita. Sono inoltre inclusi metodi per valutare l'efficienza di riprogrammazione, espandere le colonie clonali iPSC e confermare l'espressione del marcatore pluripotenza TRA-1-60.

RNA-ha basato riprogrammazione dei fibroblasti primari umani in cellule staminali pluripotenti indotte

Questo manoscritto descrive un protocollo basato su FACS per l'isolamento dei fibroblasti papillari e reticolari dalla pelle umana. Si aggira in vitro cultura che era inevitabile con il protocollo di isolamento comunemente usato attraverso le colture espianti. I sottogruppi di fibroblasti emananti sono funzionalmente distinti e mostrano l'espressione genica differenziale e la localizzazione all'interno del derma.

Isolamento dei fibroblasti papillari e reticolari dalla pelle umana mediante selezione cellulare attivata a fluorescenza

Questo protocollo delinea un metodo rapido per generare simultaneamente colture di melanociti e fibroblasti dalla pelle di topi di 0-4 giorni. Queste colture primarie possono essere mantenute e manipolate in vitro per studiare una varietà di processi fisiologicamente rilevanti, tra cui biologia cellulare della pelle, pigmentazione, guarigione delle ferite e melanoma.

Generazione rapida delle culture primarie di Murine Melanocite e Fibroblast

Presentiamo un protocollo per isolare i fibroblasti adulti primari in modo semplice, veloce e affidabile, performabile dai principianti (ad esempio, gli studenti). La procedura combina la digestione del tessuto enzimatico e l'agitazione meccanica con onde ultrasoniche per ottenere fibroblasti primari. Il protocollo può essere facilmente adattato a specifiche esigenze sperimentali (ad esempio, tessuto umano).

Isolamento fibroblasto adulto primario aumentata ad ultrasuoni

La riprogrammazione cellulare richiede l'introduzione di geni chiave, che regolano e mantengono lo stato cellulare pluripotente. Il protocollo descritto consente la formazione di colonie di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) da fibroblasti dermici umani senza metodi virali/integranti, ma utilizzando RNA non modificati (NM-RNA) combinati con fattori di evasione immunitaria che riducono i meccanismi di difesa cellulare.

Isolamento di fibroblasti dermici umani adulti dalla pelle addominale e generazione di cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un metodo non integrato

Presentiamo qui un metodo che combina l'uso della cancellazione epigenetica chimica con segnali correlati al meccanosensing per generare in modo efficiente cellule pluripotenti di mammiferi, senza la necessità di trasfezione genica o vettori retrovirali. Questa strategia è, quindi, promettente per la medicina traslazionale e rappresenta un notevole progresso nella tecnologia degli organoidi delle cellule staminali.

Una strategia in due fasi che combina modificazione epigenetica e segnali biomeccanici per generare cellule pluripotenti di mammifero

Qui viene presentato un protocollo per generare tessuti connettivi ingegnerizzati per una coltura parallela di 48 tessuti in una piastra multi-pozzo con doppi poli, adatto per studi meccanicistici, modellazione di malattie e applicazioni di screening. Il protocollo è compatibile con fibroblasti di diversi organi e specie ed è esemplificato qui con fibroblasti cardiaci primari umani.

Tessuto connettivo ingegnerizzato umano derivato da fibroblasti per applicazioni di screening

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