Name: Rat Esteriorizzazione mesentere: un modello per indagare le dinamiche cellulari coinvolti nellangiogenesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Esplora la dinamica cellulare dell'angiogenesi con il modello di esteriorizzazione del mesentere nel ratto. Questo metodo semplice e riproducibile consente la visualizzazione bidimensionale delle reti microvascolari a livello di singola cellula.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Board of Regents dello Stato della Louisiana LEQSF (2009-12)-RD-A-19 (PI: WL Murfee) e la Tulane e Centro Ipertensione renale di Eccellenza finanziato dal NIH concessione P20RR017659-08 (PI : L. Gabriel Navar).

1. Set-Up Notes Procedura chirurgica <ol><li> Prima della chirurgia sterilizzare gli strumenti chirurgici e forniture. Forniture utilizzati per la procedura chirurgica sterile per ciascun ratto includono 1 pellicola di essere disposti come una superficie sterile per il collocamento di strumenti, un telo con un foro pretagliato in circa 0,5 x 1,5 nel nel centro per essere posizionato sul ratto , e garza. Il foro pretagliato sul telo si allinea con l&#39;incisione fatta sul ratto. Gli strumenti necessari per l&#39;intervento chirurgico comprendono 1 paio di forbici norma da utilizzare per tagliare materiale di sutura, due pinze e un porta ago sottile per la movimentazione e presa della sutura, un bisturi e con una lama. Abbiamo elencato i comuni strumenti utilizzati dal nostro laboratorio nella tabella di specifici materiali e strumenti chirurgici. Tuttavia, strumento di selezione finale dipende dalle preferenze sperimentatore. </li><li> Preparare lo spazio chirurgico. Inserire un mL 100 0,9% sacca salina sterile sotto un cuscinetto riscaldante per garantire che la soluzione salina che viene in contatto wesima il tessuto mesenterico viene preriscaldata a circa 37 ° C. In alternativa alla soluzione salina, è possibile utilizzare la soluzione di Ringer o altro tampone fisiologico. Lay out sterilizzati gli strumenti chirurgici e forniture su un telino sterile per un facile accesso durante la procedura di esteriorizzazione. Inoltre, avrete bisogno di cotton-fioc sterili applicatori e gli opportuni 3 tipi di suture (4-0, 5-0 e 7-0). Crea pacchetti sicuri sono già aperti in modo che i materiali possono essere raggiunti con la manipolazione sterile. Infine, disinfettare la pre-modificato fase plastica immergendolo in etanolo al 100% per almeno 5 minuti. Lo stadio è di 100 millimetri capsula Petri con un foro ellittico tagliato al centro (Figura 1). Uno strumento Dremel può essere usato per fare inizialmente e, se necessario, allargare il foro. Dopo che il foro viene effettuato, i bordi della plastica taglio sono realizzati liscia con carta abrasiva di grani diversi. Il palco è poi lavato e, infine, sia plastilina inerte (acquistato da un negozio di artigianato locale) o Silicil collante viene aggiunto al bordo del foro per fornire una posizione sollevata, superficie liscia. Prima di contatto con il tessuto, la fase dovrà essere adeguatamente lavate con soluzione fisiologica sterile. </li><li> Per questo modello di angiogenesi, si utilizzano in genere ratti maschi adulti Wistar (350 ± 25 g). Altri ceppi di ratto ed età possono essere utilizzati. Nel nostro laboratorio, i ratti vengono anestetizzati mediante iniezione intramuscolare di ketamina (80 mg / kg di peso corporeo), xilazina (8 mg / kg di peso corporeo) e atropina (0,08 mg / kg di peso corporeo). Dopo circa 5 minuti, l&#39;effetto di anestesia è confermata e la pelle addominale del ratto viene rasato. </li></ol> 2. Rat mesentere Modello Esteriorizzazione <ol><li> Posizionare il ratto anestetizzato sulla sua schiena su un tappetino di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea. Tecniche asettiche vengono utilizzati durante la procedura chirurgica. Indossare guanti sterili e non consentono di strumenti e forniture a contatto con superfici diverse da quelle dei tessuti di ratto non sterili. </li><li> Pulire zona addominale con un&#39;alternanza di salviette USIng la garza sterile imbevuta nel 70% isopropilico e iodio. </li><li> Usando il bisturi, fare un piccolo (circa 0,75 cm) incisione longitudinale lungo la pelle e poi la linea alba di circa 1 cm sotto lo sterno. </li><li> Posizionare il pre-taglio telo sul tratto addominale in modo che l&#39;apertura si allinea con l&#39;incisione. </li><li> Esercitare una leggera pressione attorno l&#39;incisione. Ciò solitamente comporta l&#39;esposizione del piccolo intestino abbastanza per essere facilmente identificato. </li><li> Utilizzando gli applicatori di cotone punta, estrarre delicatamente una sezione dell&#39;intestino tenue e individuare l&#39;ileo. Poiché il mesentere viene estratta, esso dovrebbe essere leggermente spiegate in fase plastica (Figura 2). </li><li> Identificare 6-8 finestre mesenteriche vascolarizzati. Una finestra mesenterica è definita come la membrana sottile trasparente tra le dell&#39;arteria / vena coppie di alimentazione del piccolo intestino (Figura 2). </li><li> Registrare l&#39;ora di inizio del esteriorizzazione. Lasciare la mesenteRy sezione esteriorizzato per 20 minuti. Durante il periodo esteriorizzazione, utilizzare una siringa sterile (5 mL) per ricostituire la soluzione salina in modo intermittente nella capsula Petri per garantire che il tessuto rimanga immersa e non si secca. </li><li> Durante i 20 minuti di tempo di esposizione, segnano le 2 finestre mesenterici situati in posizione centrale con sutura sterile 7-0. I segni dovrebbero essere nella zona grasso vicino l&#39;intestino. </li><li> Ritorna la regione esteriorizzato del mesentere alla cavità addominale. </li><li> Chiudere il muscolo addominale con 5-0 sutura monofilamento in pattern interrotto. </li><li> Chiudere la pelle con sutura monofilamento 4-0 nel modello interrotto. </li><li> Pulire l&#39;area suturata con alternanza di salviette con la garza sterile imbevuta nel 70% isopropoyl e iodio. </li><li> Stendere gel lubrificante occhio entrambi gli occhi del ratto. Lo scopo di lubrificare l&#39;occhio è per prevenire l&#39;essiccamento della cornea durante la procedura chirurgica e il recupero. L&#39;applicazione di lubrificante oculare deve essere applicatoprima dell&#39;inizio di un intervento chirurgico. Se necessario, ri-applicare il lubrificante occhi prima di restituire il ratto alla sua gabbia per il recupero. </li></ol> 3. Tissue Raccolta e Fixation <ol><li> Il giorno dopo stimolazione interesse, anestetizzare e euthanize il ratto. Nel nostro laboratorio, i ratti vengono anestetizzati mediante iniezione intramuscolare di ketamina (80 mg / kg di peso corporeo), xilazina (8 mg / kg di peso corporeo) e atropina (0,8 mg / kg di peso corporeo) e poi l&#39;eutanasia mediante iniezione intracardiaca di beuthanasia. Beuthanasia è un pentobarbital di sodio / fenitoina soluzione che può essere utilizzato per l&#39;eutanasia rapida e indolore. Per ratto nostro laboratorio inietta in genere 0,1 - 0,2 ml. </li><li> Riaprire la cavità addominale e rimuovere delicatamente l&#39;intestino tenue e individuare i due segnalati finestre. </li><li> Tagliare ciascuna delle finestre mesenterici esteriorizzato con una pinzetta e micro-forbici. Compreso un bordo di grasso per ogni finestra è vantaggioso per il tessuto dopo la diffusione su vetrini da microscopio. Immediatamente, Immergere ogni finestra in PBS. Durante il taglio, cercare di evitare di tagliare attraverso l&#39;arteria / vena coppie all&#39;interno del bordo grasso delle finestre per ridurre al minimo il potenziale sangue riempimento delle finestre. Inoltre, minimizzare il taglio attraverso l&#39;intestino che risulta in contatto con il contenuto intestinale finestre. </li><li> Utilizzare pinze per diffondere tessuti su vetrini con carica positiva. Due tessuti possono essere montati per vetrino. </li><li> Lasciare asciugare i tessuti parzialmente e con una lama da bisturi rimuovere il grasso in eccesso. </li><li> I tessuti sono ora pronta per essere fissata. Tipici metodi di fissaggio possono essere usati. Nel nostro laboratorio, che comunemente fissare gli scivoli in metanolo (-20 ° C) per 30 min. L&#39;etichettatura di successo è stato eseguito anche con i tessuti non fissati. Metodi di fissaggio potrebbe dipendere il tuo preferito anticorpi. </li></ol> 4. Tissue immunomarcatura <ol><li> I tessuti in genere possono ora essere etichettati secondo le istruzioni per anticorpi per immunoistochimica. Dato il nostro interesse per identificare i ruolidi periciti vascolari durante l&#39;angiogenesi, il nostro laboratorio etichetta comunemente per le cellule endoteliali e perivascolari 10, 12, 13. Etichette utili per identificare le cellule endoteliali lungo la gerarchia delle reti microvascolari sono un anti-anticorpo o BSI PECAM-lectina. Marcatori cellulari perivascolari utilizzati in questo tessuto sono NG2, desmina, SM-α actina, PDFGRβ, e la classe III β-tubulina. Sotto, nella sezione 3.3, abbiamo elencato i protocolli per i protocolli PECAM colorimetriche e fluorescenti immunomarcatura. </li><li> Prima della prima incubazione anticorpo primario, vetrini sono essiccato sotto vuoto per rimuovere l&#39;eccesso di soluzione tampone. Inoltre, i tessuti sono inizialmente descritto con una penna cera per impedire flusso incontrollato di soluzioni anticorpo lontano dal tessuto. Infine, tutte le fasi di etichettatura sono seguiti da fasi di lavaggio. Per le fasi di lavaggio, i vetrini sono collocati all&#39;interno di contenitori per i lavaggi. La soluzione tampone viene scambiato 3 volte durante la durata di lavaggio. </li><li> Anticorpi delle cellule endoteliali delle procedure in materia di etichettatura: &lt;p class = &quot;jove_step&quot;&gt; PECAM colorimetrico Lableing <ol><li> Incubazione primaria: Drip circa 100-200 mL soluzione di anticorpo primario (1:200 monoclonale di topo biotinilato CD31 anticorpo diluito in un tampone di anticorpi (saponina 0,1% in PBS + 2% BSA)) sulla parte superiore per ogni tessuto, assicurarsi che il tessuto intero è coperto con soluzione di anticorpo. Incubazione per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare tessuti con saponina PBS 0,1% per 30 minuti. </li><li> Incubazione anticorpo secondario: soluzione di anticorpi Drip secondario (Vectastain Elite soluzione ABC da Vector Laboratories, una streptavidina perossidasi secondaria soluzione di anticorpi) sulla parte superiore dei tessuti. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Lavare tessuti con saponina PBS 0,1% per 30 minuti. </li><li> Incubare tessuti con Vector Red Nova per 15 minuti. Poi salire i tessuti con acqua. </li><li> Diapositive Mount: Immergere i vetrini in etanolo al 95% 10 volte. Immergere i vetrini in etanolo al 100% per 2 minuti. Immergere i vetrini in un altro modo di etanolo al 100%luzione per 2 minuti. Poi Immergere i vetrini in soluzioni consecutivi xilene 100% per 2 minuti ciascuno. Lasciare asciugare e coprire i tessuti con uno strato sottile di VectaMount e un coprioggetto. </li></ol> PECAM fluorescente Labeling <ol><li> Incubazione primaria: Drip circa 100-200 mL soluzione di anticorpo primario (1:200 monoclonale di topo biotinilato CD31 anticorpo diluito in un tampone di anticorpi (saponina 0,1% in PBS + 2% BSA)) sulla parte superiore per ogni tessuto, assicurarsi che il tessuto intero è coperto con soluzione di anticorpo. Incubazione per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare tessuti con saponina PBS 0,1% per 30 minuti. </li><li> Incubazione anticorpo secondario:. Soluzione di anticorpo secondario Drip ((1:100 streptavidina-CY3 diluito in tampone di anticorpo (0,1 saponina% in PBS + 2% BSA)) sulla sommità di tessuti Incubare a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Lavare tessuti con saponina PBS 0,1% per 30 minuti. </li><li> Diapositive: Mount Drip 50:50 PBS con glicerolo in cima dei tessuti. Coprirecon polizza di copertura. Quindi, utilizzare smalto per sigillare il divario tra coprioggetto e scivolo. </li></ol></li></ol> 5. Risultati rappresentativi Immagini rappresentative di tessuti mesentere ratto immunoistochimicamente etichettati per PECAM sono mostrati in Figura 3. PECAM etichettatura identifica tutti i tipi di navi lungo la gerarchia di rimodellamento reti microvascolari e può essere usato per quantificare metriche angiogenici al momento specifico dopo stimolazione punti. PECAM etichettatura permette inoltre per la determinazione delle arteriole rispetto delle venule. Arteriole di alimentazione tipicamente presentano diametri più piccoli e di forma allungata morfologia delle cellule endoteliali rispetto a venule coppie (Figura 4). Capillari e germogli capillari possono essere identificati in base alla loro diametro del vaso e posizione relativa all&#39;interno di una rete. Caratteristiche tipiche delle reti rimodellamento comprendono un aumento capillare germinazione, la densità di navi, per zona vascolarizzata e tortuoso venularelità. Quantificazione di vari parametri angiogenici identifica l&#39;andamento nel tempo di crescita di rete (Figura 5). Capillare spuntano da vasi preesistenti, picchi tra il giorno 3 e il 5 ° giorno e ritorna al livello non stimolato dal 10 ° giorno. Questo aumento transitorio della germinazione è seguita da un aumento della densità vascolare e zona vascolarizzata. Come prova per il rimodellamento dei grandi vasi in questo modello, il numero di segmenti arteriole e venule aumenta anche nel corso del tempo. Nel nostro laboratorio, questo modello è stato utilizzato per identificare cellulari variazioni fenotipiche al punto nel tempo specifico durante questo processo di rimodellamento 10, 11. Ad esempio, classe III β-tubulina identifica periciti lungo vasi angiogenici (Figura 6). In tessuti non stimolate, classe III β-tubulina espressione è specifica del nervo. Al contrario, durante il picco di germinazione capillare, classe III β-tubulina è espresso da cellule perivascolari. Questo tipodel risultato evidenzia l&#39;uso di questo modello semplice e robusto angiogenico di identificare nuovi tipi di cellule coinvolte nel processo angiogenico. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig1.jpg" /> Figura 1. Immagini della fase plastica pre-e post-modifica. La fase di pre-modificato è un piatto di 100 millimetri Petri. Le modifiche comprendono un taglio ellittica foro al centro e la successiva aggiunta di creta o colla silicio al bordo del foro per la creazione di una sollevata, superficie liscia. Questa superficie fornisce un limite interno che facilita superfusione delle finestre mesenteriche esteriorizzato. Bar La scala è 1 cm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig2.jpg" /> Figura 2. Immagine della regione mesenterica esteriorizzato. Finestre mesenteriche sono definite come le membrane sottili traslucide tra l&#39;arteria / vena coppie alimentano il piccolo intestino. Durante l&#39;esteriorizzazionedurata, la regione mesenterici è disposto e immersa in soluzione salina all&#39;interno di una capsula Petri modificato. Inerte plastilina giallo fornisce una superficie liscia per il mesentere per essere tirato attraverso il foro pretagliato. Bar La scala è 1 cm. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig3.jpg" /> Figura 3. Immagini rappresentative dei mesenterici reti microvascolari non stimolate dai tessuti e tessuti a 3 e 10 giorni dopo l&#39;esteriorizzazione del mesentere. PECAM etichettatura individuato la gerarchia delle reti microvascolari compreso, arteriole (A), venule (V) e capillari (C). Stimolazione Post, reti microvascolari visualizzato un aumento della germinazione capillare (punte di freccia) e la densità nave. Barra della scala è di 100 micron. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig4.jpg" /> Immagini rappresentative Figura 4. Di arteriole / venule coppie di adulti all&#39;interno della rete microvascolare mesenterica di rattos. In entrambe le immagini, arteriole (A) può essere differenziata da venule (V) basato su un diametro minore rispetto allungata e la morfologia delle cellule endoteliali. Barre di scala sono 20 micron. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig5.jpg" /> Figura 5. Quantificazione Rappresentante di metriche angiogenici nel corso del tempo microvascolare esteriorizzazione mesentere messaggio crescita. A) nell&#39;area vascolare per area di tessuto. B) Numero di germogli di capillari per area vascolare. C) Lunghezza totale vascolare per area vascolare. * Rappresenta una differenza significativa rispetto al gruppo non stimolato. Confronti statistici sono stati realizzati con un One-Way ANOVA seguita dal test di Dunn. (P &lt;0,05). Delle Nazioni Unite rappresenta non stimolato. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig6.jpg" /> Figura 6. Rappresentativi immagini fluorescenti di mesenterici reti microvascolari non stimolate dai tessuti e tessuti a 3 e 10giorni dopo l&#39;esteriorizzazione del mesentere. Immunofluorescenza PECAM etichettatura (rosso) identifica le cellule endoteliali, e la classe III β-tubulina etichettatura (verde) identifica i nervi (punte di freccia) e cellule perivascolari (frecce). Cellule perivascolari transitoriamente upregulate classe III β-tubulina durante la germinazione capillare. In stimolate reti microvascolari, classe III β-tubulina è nervo specifico e non identificare le cellule perivascolari. 3 giorni dopo la stimolazione, classe III β-tubulina etichetta positivamente cellule perivascolari lungo microvasi. Di giorno 10, classe III β-tubulina modello di espressione inizia a ritornare allo scenario non stimolato. Barra della scala è di 50 micron. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig7.jpg" /> Figura 7. Immagini che sostengono la fattibilità di monitoraggio pre-etichettati cellule localmente applicati durante la crescita della rete microvascolare stimolata dalla esteriorizzazione mesentere. Le cellule sono state superfuso sopra mesenteric finestre durante il periodo di 20 minuti l&#39;esteriorizzazione. 1 giorno post-operatorio, Dii cellule marcate (rosso) sono stati osservati nel piano focale con dame PECAM positivo microvasi (verde). A, B) Esempi di cellule del midollo osseo Dii marcate esporre arrotondata e allungata morfologie. In alcuni casi (frecce) le cellule sono state allungata lungo microvasi. C) Esempio di un cluster di DII marcato cellule staminali mesenchimali in prossimità della punta di un capillare germoglio (freccia). Barre di scala sono 50 micron (A), e 20 micron (B, C).

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Il modello di esteriorizzazione è stato segnalato nel 2006 e adattato da precedenti modelli meccanici mesentere ratto lesioni dell&#39;angiogenesi 4-7 e produce risultati simili a quelli già consolidati modelli ad iniezione ip che sfruttano il ratto mesentere 9. Il tempo di esteriorizzazione 20 minuti è stato determinato sperimentalmente per produrre una robusta risposta angiogenica. Durante questo periodo di tempo può essere variata, lo fa permettere l&#39;applicazione locale di inibitori angiogenici 4 per studi meccanicistici e l&#39;applicazione diretta di cellule esogene per gli studi linea cellulare. Fattibilità di incorporazione cella in rimodellamento tissutale mesenterica è supportata da studi preliminari nel nostro laboratorio utilizzando pre-etichettati cellule del midollo osseo e cellule staminali mesenchimali (figura 7), e dal successo di indagare il destino dell&#39;essere umano derivate da tessuto adiposo cellule stromali iniezione ip 14 . Nel nostro laboratorio, abbiamo usato questo modello per identificare Phen pericitiotypic modifiche nel corso del tempo di risposta angiogenica 10 e valutare il potenziale angiogenico in condizioni patologiche, quali ipertensione 12. La risposta angiogenica e le modifiche fenotipo delle cellule associate a questo modello può essere osservato anche in altri modelli mesenteriche del ratto angiogenici tra cui l&#39;esposizione cronica ipossia 10, 11. Un limite del modello di esteriorizzazione è che l&#39;esatto meccanismo di innesco di angiogenesi sono sconosciuti. Esteriorizzazione del mesentere è stato collegato a degranulazione dei mastociti e aumento dei livelli di istamina 6, ma sono necessarie ulteriori ricerche per ottenere un quadro più chiaro. Lo stimolo angiogenico è indubbiamente multi-fattoriale, producendo una risposta forte rimodellamento attraverso la gerarchia di una rete microvascolare. Mentre i meccanismi sconosciuti rimangono una critica importante di questo modello, la sua riproducibilità e la semplicità lo rendono interessante per l&#39;identificazione dinamica del cellulare coinved nel intrinsecamente complesso processo di germinazione capillare. La riproducibilità del modello è supportato da comparabili metriche angiogenici nel corso tempo di crescita di rete microvascolare in ceppi multipli di ratto (Wistar maschi e femmina Sprague-Dawley) in studi pubblicati in precedenza dal nostro laboratorio 10, 12. Poiché, la maggior parte dei tessuti adulti mesenterici ratto sono vascolarizzati, il modello consente anche per diversi tessuti da esaminare per animale. Purtroppo, questo modello non è ovviamente applicabile ai modelli murini genetici come finestre mesenterici mouse hanno meno vascolarizzazione nativa e, nella nostra esperienza, comunemente osservabili mancano reti ramificate. Le applicazioni future includono l&#39;indagine di funzionalità nave durante l&#39;angiogenesi con intra-vital microscopia in punti temporali specifici e l&#39;indagine delle relative dinamiche cellulari coinvolti in linfoangiogenesi e neurogenesi. Anche se il grado di vascolarizzazione nativa per finestra mesenterica sembra essere roughly proporzionale con l&#39;età, abbiamo osservato ramificazione reti microvascolari in ratti maschi Wistar di appena 4-5 settimane di età. Queste osservazioni suggeriscono che il modello esteriorizzazione potrebbe essere applicata anche per confrontare le differenze angiogeniche attraverso età.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Ulteriori commenti </td></tr><tr><td> Drappo </td><td> Cardinal Health </td><td> 4012 </td><td> 12 &quot;x12&quot; Bio-Shield Sterilizzazione Regular Wraps </td></tr><tr><td> Noyes Micro Scissor </td><td> Roboz strumento chirurgico </td><td> RS-5677 </td><td> Noyes Micro Forbici per dissezione di primavera; Diritti, Sharp-Blunt punti; tagliente 13 millimetri, larghezza Tip 0.25mm, 4 1/2 &quot;Lunghezza totale </td></tr><tr><td> Graefe Pinza </td><td> Roboz strumento chirurgico </td><td> RS-5135 </td><td> Micro Pinza dissezione, seghettato, leggera curva; Larghezza Tip 0.8mm; 4 &quot;Length </td></tr><tr><td> Graefe Pinza </td><td> Roboz strumento chirurgico </td><td> RS-5130 </td><td> Micro dissettore; dentellate, diritte, larghezza Tip 0.8mm; 4 &quot;Lunghezza </td></tr&gt; <tr><td> Filo di sutura 4-0 </td><td> ETHICON </td><td> 699G </td><td> (1,5 metrico) ETHILON sutura monofilamento in nylon nero </td></tr><tr><td> 5-0 sutura </td><td> ETHICON </td><td> 8556 </td><td> (1,0 metrico) PROLENE Polyprolene Blu sutura monofilamento </td></tr><tr><td> 7-0 sutura </td><td> ETHICON </td><td> 1647G </td><td> (0,5 metrico) ETHILON sutura monofilamento in nylon nero </td></tr><tr><td> Porta aghi Castroviejo Micro </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 12060-02 </td><td> Suggerimento Larghezza: 0,6 millimetri Lunghezza di serraggio: 5mm Lunghezza: 9cm Punta dritta </td></tr><tr><td> Porta aghi Castroviejo </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 12565-14 </td><td> Forma punta: Etero Suggerimento Larghezza: 1,5 mm Lunghezza di serraggio: 10mm Forbici: No Blocco: Sì Lunghezza: 14cm Seghettato: Sì </td></tr><tr><td> Manico bisturi </td><td> Roboz strumento chirurgico </td><td> RS-9843 </td><td> Scalpel Handle, # 3; Solid, 4 &quot;Length </td></tr><tr><td> Sterile lama chirurgica </td><td> Cincinnati chirurgico </td><td> 0110 </td><td> Acciaio; Size 10 </td></tr><tr><td> Petri Dish </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-13 </td><td> Ridge smussata, Slippable </td></tr></tbody></table> Tabella di specifici materiali e strumenti chirurgici. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Ulteriori commenti </td></tr><tr><td> Beuthanasia </td><td> Schering-Plough Animal Health Corp. Union (ordinati da alimentazione MWI Veterinaria) </td><td> MWI #: 011168 </td><td> Ingrediente attivo: Per 100 ml, 390 mg di sodio pentobarbital, sodio 50mg fenitoina </td></tr><tr><td> Ketamina </td><td> Fort Dodge Animal Health (ordinati da alimentazione MWI Veterinaria) </td><td> MWI #: 000680 </td><td> Kateset 100 mg / ml </td></tr><tr><td> Xilazina </td><td> LLOYD. Inc. (Ordinati da alimentazione MWI Veterinaria) </td><td> MWI #: 009307 </td><td> Anased 100 mg / ml </td></tr><tr><td> Salino </td><td> Hospira Inc. </td><td> 94-217-JT </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> SIGMA </td><td> 011M8207 </td><td></td></tr><tr><td> Saponina </td><td> Sigma </td><td> BCBB4080 </td><td></td></tr><tr><td> PECAM (CD31) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553371 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidina-CY3 </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 016-160-084 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 096555 </td><td></td></tr><tr><td> Vectastain Elite ABC </td><td> Vector Laboratories </td><td> PK-6100 </td><td></td></tr><tr><td> Vector Nova Red </td><td> Vector Laboratories </td><td> SK-4800 </td><td></td></tr><tr><td> VectaMount </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-500 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella di reagenti specifici

rat esteriorizzazione mesentere: un modello per indagare le dinamiche cellulari coinvolti nell&#39;angiogenesi

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Crescita della rete Microvacular e il rimodellamento sono aspetti critici di guarigione delle ferite, l&#39;infiammazione, retinopatia diabetica, la crescita del tumore e le condizioni di altre malattie 1, 2. Crescita di rete è comunemente attribuito angiogenesi, definita come la crescita di nuovi vasi da vasi preesistenti. L&#39;angiogenesi è inoltre direttamente collegata arteriogenesi, definito come l&#39;acquisizione capillare di un rivestimento cellula perivascolare e allargamento vaso. Inutile dire, l&#39;angiogenesi è complessa e coinvolge più giocatori a livello cellulare e molecolare 3. La comprensione di come una rete microvascolare cresce richiede identificare le dinamiche spaziali e temporali lungo la gerarchia di una rete nel corso del tempo angiogenesi. Queste informazioni sono importanti per lo sviluppo di terapie mirate a manipolare crescita dei vasi. Il modello esteriorizzazione descritto in questo articolo rappresenta un modello semplice e riproducibile per stimolarelante angiogenesi nel mesentere ratto. E &#39;stato adattato da modelli di guarigione delle ferite nel ratto mesentere 4-7, ed è una alternativa per stimolare l&#39;angiogenesi nel mesentere tramite iniezioni ip di pro-angiogenici agenti 8, 9. Il modello esteriorizzazione è interessante perché richiede un minimo intervento chirurgico e produce drammatiche, aumenti riproducibili in germogli capillari, zona vascolare e la densità vascolare in un corso di tempo relativamente breve in un tessuto che permette la visualizzazione bidimensionale di reti microvascolari interi fino a singola Level Cell. La crescita riflette naturali stimolato risposte angiogenici in un ambiente fisiologico, senza interferenza di stranieri molecole angiogenici. Utilizzando i metodi immunoistochimici etichettatura, questo modello è stato dimostrato estremamente utile per identificare nuovi eventi cellulari coinvolti nell&#39;angiogenesi. Gli investigatori può facilmente correlare le metriche angiogenici nel corso del tempo rimodellamento con tempo specific dinamiche, quali cellulari modificazioni fenotipiche o interazioni cellulari 4, 5, 7, 10, 11.

Questo articolo descrive un semplice modello per stimolare l&#39;angiogenesi nel mesentere ratto. Il modello produce aumenti drammatici nel capillare germinazione, zona vascolare e densità vascolare in un corso di tempo relativamente breve in un tessuto che permette la visualizzazione en faccia di intere reti microvascolari fino al livello di singola cellula.

Rat Esteriorizzazione mesentere: un modello per indagare le dinamiche cellulari coinvolti nell&#39;angiogenesi

La crescita e il rimodellamento della rete microvascolare sono aspetti critici della guarigione delle ferite, dell'infiammazione, della retinopatia diabetica, della crescita tumorale e di altre patologie...

Lo scopo del seguente esperimento è identificare la dinamica cellulare spaziale e temporale coinvolta nell'angiogenesi, definita come la formazione di nuovi vasi sanguigni a partire da quelli preesistenti. Utilizzando un modello semplice e riproducibile, si induce inizialmente l'angiogenesi mediante l'esteriorizzazione temporanea del mesentere del ratto e si prelevano tessuti mesenterici in diversi momenti successivi alla stimolazione. Successivamente, si etichettano immunoistochimicamente le sezioni di tessuto.Ad esempio, utilizzare un marcatore per cellule endoteliali per visualizzare l'intera vascolarizzazione rimodellata all'interno di un tessuto e creare una visualizzazione bidimensionale essenziale delle reti microvascolari in crescita. Questo modello è attraente perché produce un aumento significativo di molteplici parametri angiogenici nel complesso in un periodo di tempo relativamente breve. La visualizzazione delle reti a livello di singola cellula e la correlazione di questi parametri con l'etichettatura multicellulare si sono rivelate estremamente utili nell'identificazione di nuovi fenotipi cellulari coinvolti nella formazione di nuovi capillari.Questo metodo potrebbe contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo la dinamica cellulare coinvolta nella crescita della rete microvascolare. Tali domande includono il momento e il luogo in cui specifiche cellule sono presenti durante il processo di formazione dei capillari. I principali vantaggi di questo metodo sono la sua semplicità, il ridotto intervento chirurgico richiesto e la capacità di generare una risposta angiogenica robusta in un periodo di tempo relativamente breve.Inoltre, sfrutta il mesentere di ratto, un tessuto che consente l'osservazione di una rete intatta fino al livello della singola cellula. Nella nostra esperienza, è molto facile da apprendere e quindi riproducibile da un ricercatore all'altro, come dimostrato dalla procedura. Oggi Peter Stapler, uno studente laureato del nostro laboratorio, si preparerà per l'intervento chirurgico secondo quanto descritto nel testo allegato.Dopo aver rasato la zona addominale del ratto, posizionare l'animale anestetizzato in posizione supina su un tappetino riscaldante per mantenere la temperatura corporea; pulire la zona addominale alternando passate di tamponi sterili imbevuti di alcol al 70% e iodio, circa un pollice al di sotto dello sterno. Praticare una piccola incisione longitudinale lungo la cute e quindi lungo la linea alba. Posizionare il campo operatorio pre-tagliato sulla sezione addominale in modo che l'apertura sia allineata con l'incisione. Applicare delicatamente pressione attorno all'incisione per esporre l'intestino tenue. Con applicatori di cotone, estrarre delicatamente un tratto dell'intestino tenue, appoggiando il mesentere sulla piastra di plastica contenente soluzione salina sterile, e individuare l'ileo.Individuare da sei a otto finestre mesenteriche vascolarizzate, la sottile membrana traslucida situata tra le coppie arterovenose, che irrora l'intestino tenue. Registrare l'ora di inizio dell'esteriorizzazione e impostare un timer di 20 minuti. Contrassegnare con un punto di sutura sterile numero 7-0 le due finestre mesenteriche situate più centralmente, nell'area adiposa vicina all'intestino.Ricaricare intermittente la soluzione salina nella piastra di Petri utilizzando una siringa sterile da cinque millilitri per garantire che il tessuto rimanga immerso e umido. Trascorso il periodo di esteriorizzazione, riposizionare il mesentere all'interno della cavità addominale. Chiudere il muscolo addominale con una sutura monofilamento cinque zero in un pattern interrotto.Quindi chiudere la cute con quattro punti di sutura monofilamentosa zero in un modello interrotto, pulire l'area di sutura con tamponi alternati utilizzando garza sterile imbevuta di alcol al 70% e iodio per disinfettare, applicare un gel lubrificante su entrambi gli occhi del ratto e restituirlo alla gabbia per il recupero. Nel giorno di interesse, dopo la stimolazione, anestetizzare ed eutanasia il ratto seguendo le linee guida istituzionali. Riaprire quindi la cavità addominale e coprire la zona addominale con un pezzo di pellicola di plastica. Ora estrarre delicatamente l'intestino tenue e localizzare le due finestre marcate utilizzando pinzette e micro forbici.Rimuovere ciascuna delle finestre mesenteriche esteriorizzate, includendo un margine di tessuto adiposo. Evitare di tagliare le coppie arteria-vena presenti nel margine adiposo delle finestre, al fine di ridurre al minimo il possibile riempimento ematico delle stesse. Inoltre, limitare al minimo i tagli attraverso l'intestino che potrebbero causare fuoriuscita di contenuto intestinale.Il contatto con le finestre richiede di immergere immediatamente ciascuna finestra in PBS. Successivamente, utilizzare pinzette per stendere i tessuti su vetrini carichi positivamente. Montare due tessuti per vetrino. Dopo che i tessuti si sono parzialmente asciugati, rimuovere il grasso in eccesso con una lama di bisturi.Fissare i campioni in metanolo per 30 minuti a meno 20 gradi Celsius ponendoli nel congelatore. Asciugare sotto vuoto i vetrini per rimuovere la soluzione tampone in eccesso. Inoltre, delimitare i tessuti con una penna al paraffina per evitare il flusso incontrollato delle soluzioni anticorpali lontano dal tessuto.Ora aggiungere per gocciolamento circa 200 microlitri di soluzione dell'anticorpo primario diluito per coprire completamente il tessuto. Incubare per un'ora a temperatura ambiente, quindi lavare i tessuti con PBS contenente lo 0,1% di sapina con tre ricambi di tampone. Successivamente, aggiungere la soluzione dell'anticorpo secondario streptavidina perossidasi e incubare a temperatura ambiente per un'ora; dopo tre lavaggi, incubare i campioni nel reattivo Vector Nova Red per 15 minuti.Sciacquare con acqua per montare i vetrini. Immergere nell'etanolo al 95% dieci volte, seguito da passaggi successivi di disidratazione. Lasciare asciugare i vetrini, coprendo i tessuti con uno strato sottile; regolare la quantità e la posizione dei coprioggetti dopo l'essiccazione a vuoto e la marcatura.I vetrini. Coprire i campioni di tessuto con soluzione diluita di anticorpo primario. Incubare per un'ora a temperatura ambiente.Lavare tre volte con PBS contenente 0,1% di saponina, per 10 minuti ogni lavaggio. Quindi aggiungere l'anticorpo secondario e incubare per un'ora. Eseguire i lavaggi in PBS con 0,1% di saponina, montare i vetrini in PBS con glicerolo e sigillare con smalto per unghie.Qui illustriamo la modifica di una comune piastra di Petri per utilizzarla come campo operatorio. È stata usata argilla modellabile gialla per fornire una superficie liscia attraverso la quale far passare il mesentere dal foro pre-tagliato. Ancora una volta, le finestre mesenteriche mostrate qui nel campo operatorio durante il periodo di esternazione sono definite come le sottili membrane traslucide poste tra le coppie arteria-vena che irriganano l'intestino in questa sede.L'etichettatura con PCAM identifica tutti i tipi di vasi lungo la gerarchia delle reti microvascolari in rimodellamento in specifici momenti temporali successivi all'esternalizzazione. Queste immagini possono essere utilizzate per quantificare parametri angiogenetici in determinati punti temporali. Dopo la stimolazione.L'etichettatura con PCAM permette di distinguere tra arteriole e vene. Si noti che le arteriole di alimentazione presentano tipicamente diametri più piccoli e una morfologia allungata delle cellule endoteliali rispetto alle vene associate. Le caratteristiche tipiche delle reti rimodellate includono l'area vascolarizzata, la formazione di nuovi capillari (sprouting) e la densità vascolare.La quantificazione di queste diverse metriche angiogeniche caratterizza l'andamento temporale della crescita della rete. La formazione di nuovi capillari da vasi preesistenti raggiunge il picco tra il terzo e il quinto giorno e ritorna al livello non stimolato entro il decimo giorno. Questo aumento transitorio nella formazione di nuovi capillari è seguito, nel nostro laboratorio, da un incremento dell'area vascolarizzata e della densità vascolare.Questo sistema modello è stato utilizzato per identificare nuovi cambiamenti fenotipici cellulari in specifici punti temporali durante questo processo di rimodellamento. La colorazione con etichettatura PCA immunofluorescente evidenzia le cellule endoteliali, mentre l'etichettatura della tubulina beta di classe tre colora di verde i nervi e i parassiti lungo i vasi angiogenetici. In modo interessante, nei tessuti non stimolati, l'espressione della tubulina beta di classe tre è specifica per i nervi.Al contrario, durante il picco della formazione di nuovi capillari, le cellule perivascolari esprimono la tubulina beta di classe tre. Questo tipo di risultato evidenzia l'utilizzo di questo modello angiogenico semplice e robusto per identificare nuovi tipi cellulari coinvolti nel processo angiogenico. Entro il giorno 10, il profilo di espressione della tubulina beta di classe tre inizia a ripristinare lo scenario osservato in condizioni non stimolate.Questo modello potrebbe inoltre essere potenzialmente utilizzato per studi sulla linea cellulare. La fattibilità dell'incorporazione cellulare nei tessuti mesenterici in rimodellamento è supportata da questi studi preliminari, nei quali cellule del midollo osseo pre-etichettate o cellule staminali mesenchimali sono state sovrafuse su finestre mesenteriche durante il periodo di esposizione esterna di 20 minuti. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare il nostro modello di interiorizzazione del mesentere del ratto per indagare la dinamica cellulare coinvolta nella crescita della rete microvascolare.Questa semplice tecnica può essere eseguita in circa 45 minuti fino a un'ora. Ricordare che è fondamentale manipolare con delicatezza il mesentere ed evitare di perforare qualsiasi vaso dopo un intervento chirurgico. L'etichettatura immunoistochimica può essere eseguita per identificare diversi tipi cellulari lungo i vasi sanguigni.È inoltre possibile effettuare la marcatura per i vasi linfatici e i nervi. Questo ci consente di studiare non solo le modifiche fenotipiche cellulari coinvolte nell'angiogenesi, ma anche la coordinazione tra angiogenesi, neurogenesi e linfangiogenesi.

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Biologia

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