Rat Esteriorizzazione mesentere: un modello per indagare le dinamiche cellulari coinvolti nell'angiogenesi

Lo scopo del seguente esperimento è identificare la dinamica cellulare spaziale e temporale coinvolta nell'angiogenesi, definita come la formazione di nuovi vasi sanguigni a partire da quelli preesistenti. Utilizzando un modello semplice e riproducibile, si induce inizialmente l'angiogenesi mediante una breve esteriorizzazione della mesenterica del ratto e si prelevano tessuti mesenterici in diversi momenti successivi alla stimolazione. Successivamente, si etichettano immunoistochimicamente le sezioni di tessuto.

Ad esempio, utilizzare un marcatore per cellule endoteliali per visualizzare l'intera vascolarizzazione rimodellata all'interno di un tessuto e creare una visualizzazione bidimensionale essenziale delle reti microvascolari in crescita. Questo modello è attraente perché determina un aumento significativo di molteplici parametri angiogenici nel complesso, in un periodo di tempo relativamente breve. La visualizzazione delle reti a livello di singola cellula e la correlazione di questi parametri con l'etichettatura multicellulare si sono rivelate estremamente utili nell'identificare nuovi fenotipi cellulari coinvolti nella formazione di nuovi capillari.

Questo metodo potrebbe aiutare a rispondere a domande fondamentali riguardo la dinamica cellulare coinvolta nella crescita della rete microvascolare. Tra queste, il momento e il luogo in cui cellule specifiche sono presenti durante il processo di gemmazione capillare. I principali vantaggi di questo metodo sono la sua semplicità, il ridotto intervento chirurgico richiesto e la produzione di una risposta angiogenica robusta in un periodo di tempo relativamente breve.

Inoltre, sfrutta il mesentere di ratto, un tessuto che permette l'osservazione di una rete intatta fino al livello della singola cellula. Per la nostra esperienza, è molto facile da imparare e quindi riproducibile da un ricercatore all'altro, come dimostrato dalla procedura. Oggi sarà Peter Stapler, uno studente laureato del nostro laboratorio, a prepararsi per l'intervento chirurgico secondo le indicazioni riportate nel testo allegato.

Dopo aver rasato la zona addominale del ratto, posizionare l'animale anestetizzato in posizione supina su un tappetino riscaldante per mantenere la temperatura corporea; pulire la zona addominale alternando passate con tamponi sterili imbevuti di alcol al 70% e iodio. Approssimativamente un pollice al di sotto dello sterno, effettuare una piccola incisione longitudinale lungo la cute e quindi lungo la linea alba. Posizionare il campo operatorio pre-tagliato sulla sezione addominale in modo che l'apertura sia allineata con l'incisione. Applicare delicatamente pressione intorno all'incisione per far emergere l'intestino tenue. Con applicatori di cotone, estrarre delicatamente un tratto dell'intestino tenue, appoggiando il mesentere sulla piastra di plastica contenente soluzione salina sterile, e individuare l'ileo.

Individuare da sei a otto finestre mesenteriche vascolarizzate, la sottile membrana traslucida situata tra le coppie artero-venose, che irrora l'intestino tenue. Registrare l'ora di inizio dell'intervento ed impostare un timer di 20 minuti. Contrassegnare con un filo di sutura sterile 7-0 due finestre mesenteriche poste in posizione centrale, nell'area adiposa vicina all'intestino.

Riempire periodicamente la soluzione salina nella piastra di Petri utilizzando una siringa sterile da cinque millilitri per assicurare che il tessuto rimanga immerso e umido. Trascorso il periodo di esteriorizzazione, riposizionare il mesentere nella cavità addominale. Chiudere il muscolo addominale con punti di sutura monofilamento numero cinque in un modello interrotto.

Quindi chiudere la cute con quattro punti separati in sutura monofilamento zero, detergere la zona della sutura con tamponi alternati utilizzando garza sterile imbevuta di alcol isopropilico al 70% e iodio per disinfettare; applicare un gel lubrificante su entrambi gli occhi del ratto e riporlo nella gabbia per il recupero. Nel giorno di interesse, dopo la stimolazione, anestetizzare ed eutanasizzare il ratto seguendo le linee guida istituzionali. Riaprire quindi la cavità addominale e coprire la zona addominale con un pezzo di pellicola trasparente. Ora estrarre delicatamente l'intestino tenue e individuare le due finestre marcate utilizzando pinzette e forbici microchirurgiche.

Rimuovere ciascuna delle finestre mesenteriche esteriorizzate, includendo un margine di tessuto adiposo. Evitare di tagliare le coppie arteria-vena presenti nel margine adiposo delle finestre, per minimizzare il rischio di riempimento ematico delle stesse. Inoltre, ridurre al minimo i tagli attraverso l'intestino che potrebbero causare fuoriuscita di contenuto intestinale.

Il contatto con le finestre richiede di immergere immediatamente ogni finestra in PBS. Successivamente, utilizzare pinze per stendere i tessuti su vetrini carichi positivamente. Montare due tessuti per vetrino. Dopo che i tessuti si sono parzialmente asciugati, rimuovere l'eccesso di grasso con una lama di bisturi.

Fissare i campioni in metanolo per 30 minuti a meno 20 gradi Celsius ponendoli nel congelatore. Asciugare sotto vuoto i vetrini per rimuovere la soluzione tampone in eccesso. Inoltre, delimitare i tessuti con una penna a cera per evitare il flusso incontrollato delle soluzioni di anticorpo lontano dal tessuto.

Ora aggiungere per gocciolamento circa 200 microlitri di soluzione diluita dell'anticorpo primario in modo da coprire completamente il tessuto. Incubare per un'ora a temperatura ambiente, quindi lavare i tessuti con PBS contenente 0,1% di sapone con tre cambi di tampone. Successivamente, aggiungere la soluzione dell'anticorpo secondario streptavidina perossidasi e incubare a temperatura ambiente per un'ora; dopo tre lavaggi, incubare i campioni nel reattivo Vector Nova Red per 15 minuti.

Sciacquare con acqua per montare i vetrini. Immergere nell'etanolo al 95% dieci volte, seguito da passaggi successivi di disidratazione. Lasciare asciugare i vetrini, coprire i tessuti con uno strato sottile, regolare la quantità e la posizione dei coverslip dopo l'essiccazione a vuoto e la marcatura.

I vetrini. Coprire i campioni di tessuto con soluzione diluita di anticorpo primario. Incubare per un'ora a temperatura ambiente.

Lavare tre volte con PBS contenente 0,1% di saponina, per 10 minuti ogni lavaggio. Quindi aggiungere l'anticorpo secondario e incubare per un'ora. Eseguire i lavaggi in PBS con 0,1% di saponina, montare i vetrini in PBS con glicerolo e sigillare con smalto per unghie.

Qui descriviamo la modifica di una comune piastra di Petri per utilizzarla come campo operatorio. Dell'argilla modellabile gialla è stata utilizzata per fornire una superficie liscia attraverso la quale far passare il mesentere dal foro pre-tagliato. Ancora una volta, le finestre mesenteriche mostrate qui nel campo operatorio durante il periodo di esternazione sono definite come le membrane sottili e traslucide poste tra le coppie arteria-vena che irrora l'intestino in questa sede.

L'etichettatura con PCAM identifica tutti i tipi di vasi lungo la gerarchia delle reti microvascolari in rimodellamento in specifici punti temporali successivi all'esternalizzazione. Queste immagini possono essere utilizzate per quantificare parametri angiogenetici in specifici punti temporali. Dopo la stimolazione.

L'etichettatura con PCAM consente di distinguere tra arteriole e venule. Si noti che le arteriole di alimentazione tipicamente presentano diametri più piccoli e una morfologia delle cellule endoteliali più allungata rispetto alle venule appaiate. Le caratteristiche tipiche delle reti rimodellate includono l'area vascolarizzata, la formazione di nuovi capillari e la densità vascolare.

La quantificazione di queste diverse metriche angiogeniche caratterizza l'andamento temporale della crescita della rete. La formazione di nuovi capillari da vasi preesistenti raggiunge il picco tra il terzo e il quinto giorno e ritorna al livello non stimolato entro il decimo giorno. Questo aumento transitorio della gemmazione è seguito, nel nostro laboratorio, da un incremento dell'area vascolarizzata e della densità vascolare.

Questo sistema modello è stato utilizzato per identificare nuovi cambiamenti fenotipici cellulari in specifici punti temporali durante questo processo di rimodellamento. La colorazione con etichetta PCA immunofluorescente evidenzia le cellule endoteliali in rosso, mentre l'etichettatura della classe tre della beta tubulina colora in verde i nervi e i parassiti lungo i vasi angiogenetici. In modo interessante, nei tessuti non stimolati, l'espressione della classe tre della beta tubulina è specifica per i nervi.

Al contrario, durante il picco della formazione di nuovi capillari, le cellule perivascolari esprimono la tubulina beta di classe tre. Questo tipo di risultato evidenzia l'utilizzo di questo modello angiogenico semplice e robusto per identificare nuovi tipi cellulari coinvolti nel processo angiogenico. Entro il giorno 10, il profilo di espressione della tubulina beta di classe tre inizia a ripristinare lo scenario non stimolato.

Questo modello potrebbe inoltre essere potenzialmente utilizzato per studi sulla linea cellulare. La fattibilità dell'incorporazione cellulare nei tessuti mesenterici in rimodellamento è supportata da questi studi preliminari, nei quali cellule del midollo osseo pre-etichettate o cellule staminali mesenchimali sono state sovrapponibili alle finestre mesenteriche durante il periodo di esposizione esterna di 20 minuti. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare il nostro modello di interiorizzazione del mesentere di ratto per indagare la dinamica cellulare coinvolta nella crescita della rete microvascolare.

Questa semplice tecnica può essere eseguita in circa 45 minuti fino a un'ora. Ricordare che è fondamentale manipolare con delicatezza il mesentere ed evitare di perforare qualsiasi vaso dopo un intervento chirurgico. L'etichettatura immunoistochimica può essere eseguita per identificare diversi tipi cellulari lungo i vasi sanguigni.

È inoltre possibile effettuare la marcatura per i vasi linfatici e i nervi. Ciò ci consente di studiare non solo le modifiche fenotipiche cellulari coinvolte nell'angiogenesi, ma anche la coordinazione tra angiogenesi, neurogenesi e linfangiogenesi.