Solubilizzazione e Bio-coniugazione dei punti quantici e test di tossicità batterica curva di crescita e conta in piastra

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire uno screening ad alto rendimento degli effetti antibatterici di nanoparticelle, con o senza coniugazione ad antibiotici. In questo caso, vengono testati gli effetti antibatterici di polimixina B e di punti quantici al cadmio tellururo coniugati per raggiungere tale scopo. I punti quantici vengono prima solubilizzati nell'acido mercaptopropionico.

Successivamente, i punti quantici vengono coniugati con la miscela poli B; i batteri piastrati con antibiotici vengono quindi trattati sia con punti quantici coniugati che non coniugati all'antibiotico, e metà dei campioni viene sottoposta a irradiazione con luce blu a 440 nanometri per 30 minuti, inducendo così la generazione di eccitoni e specie reattive dell'ossigeno al fine di valutare l'effetto dei trattamenti con punti quantici sulla crescita e sulla sopravvivenza batterica. Vengono effettuate letture della densità ottica e conteggi delle colonie. I dati ottenuti indicano che l'applicazione di punti quantici al cadmio tellururo coniugati con antibiotico, seguita da irradiazione, produce gli effetti tidali maggiori tra tutte le condizioni testate.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'effetto dei punti quantici di tellururo di cadmio e della loro coniugazione con polix in B sulla crescita di E coli, può essere applicato anche ad altri tipi di nanoparticelle e antibiotici su diverse ceppi batterici. In generale, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà, poiché qualsiasi eccesso di MPA provocherà l'aggregazione dei punti quantici e, se ne verrà aspirata anche una piccola quantità, si distruggerà il filtro.

Sebbene oggi dimostreremo un metodo per valutare gli effetti antibatterici dei punti quantici KE IDE coniugati con antibiotico, un metodo simile potrebbe essere utilizzato con altri tipi di punti quantici, come il fosfato di indio, il solfato di zinco e il solfato di cadmio e zinco. Iniziare questa procedura preparando una soluzione di punti quantici di tellururo di cadmio o CDTE nel toluene a 15 micromolare in un vial di vetro; misurare la densità ottica o OD mediante spettroscopia di assorbimento, trasferendo con una pipetta 200 microlitri di questa soluzione madre in un vial di vetro.

Non utilizzare plastica. Aggiungere quindi 800 microlitri di toluene, un millilitro di tampone borato 200 millimolare e due microlitri di acido mercaptopropionico 11,5 molare o MPA, chiudere il flacone e agitare vigorosamente per 30-60 secondi. Dopo l'agitazione, le fasi acquosa e organica si separeranno spontaneamente.

La fase acquosa assumerà il colore dei punti quantici. Per evitare lo strato di tiling, rimuoverlo, quindi rimuovere la fase dei punti quantici e trasferirla in un vial pulito. Per purificare i punti quantici solubilizzati, trasferirli in un filtro centrifugo da 500 microlitri.

Aggiungere 100 microlitri di tampone bore otto 50 millimolare e centrifugare a 3000 ×g per 13 minuti. Eseguire questo lavaggio quattro volte; dopo l'ultimo lavaggio, sospendere i punti quantici lavati in 500 microlitri di tampone bore e conservare a quattro gradi Celsius.

Risulteranno stabili per una o due settimane. Per stimare la concentrazione dei punti quantici, misurare gli spettri di assorbanza e di emissione. Questa figura mostra punti quantici di CDTE sotto illuminazione con lampada UV e gli spettri di emissione prima e dopo la solubilizzazione in acqua, che evidenziano una variazione trascurabile nelle proprietà ottiche dovuta allo scambio di ligandi.

Questa parte del protocollo è applicabile a qualsiasi nanoparticella solare attivata dall'acqua con carica negativa, inclusi muschi, punti quantici commerciali, particelle metalliche e altri. In questo esempio, l'antibiotico polimixina B o PMB verrà coniugato ai punti quantici in un rapporto molare di 30 a 1. La PMB è positivamente carica e si autoassembla senza necessità di coniugazione. Reagenti: sciogliere la PMB in acqua.

A 60 micromolar. Per una piastra a 96 pozzetti con 0,3 millilitri di batteri per pozzetto in quadruplicato, 0,5 millilitri di coniugato a 200 nanomolar sono sufficienti per preparare questa soluzione aggiungendo 100 microlitri di punti quantici a un micromolar in 50 millimolar di tampone borico in un tubo da microcentrifuga.

Successivamente, aggiungere 50 microlitri della soluzione antibiotica di PMB 10 x o 60 micromolare in acqua nel tubo del coniugato. Aggiungere 50 microlitri di acqua nel tubo di controllo. Portare il volume a 0,5 millilitri con tampone ate 50 millimolare, schermare i tubi dalla luce con della carta d'alluminio e posizionarli su un agitatore rotante per un'ora.

Se si verifica aggregazione, ripetere la coniugazione utilizzando concentrazioni più basse di antibiotico. Aumentare progressivamente la concentrazione fino a quando le particelle non si aggregano, per poter lavare i coniugati. Versare le soluzioni attraverso un filtro con cutoff di peso molecolare di 10.000, che è efficace per la maggior parte degli antibiotici ma non per proteine o anticorpi.

Infine, stimare il numero di molecole di antibiotico per quantum dot mediante spettroscopia di assorbanza o fluorescenza, elettroforesi su gel oppure spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier. Questa figura mostra gli spettri tipici di assorbanza ed emissione dei quantum dot prima della coniugazione con PMB e l'emissione dopo l'aggiunta di 160 equivalenti molari di PMB.

Qui viene mostrata la relazione tra il rapporto tra PMB e intensità di emissione dei punti quantici, indicato dai quadrati, e la posizione della lunghezza d'onda del picco, indicata dai triangoli. All'aumentare della concentrazione di PMB, l'intensità di emissione dei punti quantici diminuisce, provocando uno spostamento della lunghezza d'onda di emissione massima. La successiva parte del protocollo viene eseguita per determinare la concentrazione inibitoria al 50% o IC 50 dell'antibiotico e della tossicità dei punti quantici la sera di due giorni prima dell'esperimento di coniugazione.

Sei 10 millilitri di mezzo LB da una colonia fresca di e coli. Il giorno successivo, da una a due ore prima dell'esperimento, riempi ciascun pozzetto di una piastra trasparente a 96 pozzetti con mezzo di crescita. La piastra per il saggio deve essere disposta come mostrato qui.

I campioni devono essere seminati in triplice replicato e le concentrazioni degli antibiotici devono coprire un intervallo sufficientemente ampio da includere una concentrazione che inibisce lievemente i batteri e una che li uccide completamente. Anche i pozzetti contenenti punti quantici alle concentrazioni da utilizzare negli esperimenti coniugati devono essere inclusi in triplice replicato. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere nei rispettivi pozzetti da 1 a 50 microlitri di coltura batterica.

La concentrazione dipenderà dalla velocità di crescita della specifica ceppo e dovrà essere calibrata di conseguenza. Per monitorare la crescita, posizionare la piastra su un lettore di piastre e impostarlo in modo da effettuare una lettura ogni 10 minuti per due ore a 600 nanometri. Quando tutte le cellule raggiungono un OD compreso tra 0,1 e 0,15, rimuovere la piastra dal lettore e interrompere la registrazione.

Successivamente, aggiungere il PMB nei punti quantici alle pozzette appropriate e triplicare la schermatura della metà della piastra con foglio di alluminio. Quindi posizionare la piastra sotto una lampada personalizzata da 440 nanometri realizzata con LED da 2,4 milliwatt per 30 minuti per esporre il lato illuminato della piastra. Dopo l'esposizione alla luce, inserire la piastra nel lettore di piastre e registrare l'OD a 600 nm ogni 10 minuti per cinque fino a dodici ore, a seconda della velocità di crescita. Mantenere la temperatura inferiore a 32 gradi Celsius, se possibile, per evitare l'essiccazione delle colture utilizzando un software.

Tracciare le curve di crescita in un punto temporale selezionato rispetto al logaritmo della concentrazione e determinare la IC50 dell'antibiotico utilizzando l'equazione di Hill mostrata a schermo, in cui H è il coefficiente di Hill. Ymax è il punto più alto di crescita e Ymin è un punto zero, idealmente situato su una plateau. Al termine del periodo di registrazione, i pozzetti trasparenti indicheranno la morte cellulare completa e si dovrebbe osservare un gradiente di densità cellulare lungo l'aumento delle concentrazioni del farmaco.

I batteri dovrebbero mostrare curve di crescita a forma di S come mostrato qui. La posizione del plateau massimo varierà notevolmente da ceppo a ceppo e dipende anche dalla temperatura. Un determinato punto temporale può essere scelto come rappresentativo e i valori riportati in grafico in funzione del logaritmo dell'antibiotico per ottenere la IC 50 al fine di valutare i punti quantici.

La sopravvivenza in funzione della tossicità può essere rappresentata anche rispetto al logaritmo della concentrazione dei punti quantici, ma è raro ottenere un'uccisione batterica significativa con i soli punti quantici alla concentrazione utilizzata. Una volta determinata la tossicità dei punti quantici e degli antibiotici singolarmente, lo stesso protocollo può essere applicato per determinare la tossicità dell'antibiotico. Punti quantici coniugati mostrati.

Di seguito è riportato un esempio di disposizione per il saggio. Si noti che i coniugati vengono testati a concentrazioni crescenti in quadruplicato; va incluso un controllo con soli batteri, uno con soli farmaci e pozzetti campione con soli punti quantici. Le letture di OD 600 possono quindi essere utilizzate per generare curve di crescita e calcolare i valori di IC50 come in precedenza.

Questa figura mostra un esempio di coniugati tossici quanto l'antibiotico da solo e un esempio di coniugati più tossici. Per determinare il numero di unità formanti colonie o UFC per ciascuna condizione, selezionare una o più pozzette della piastra trattata a 96 pozzette da utilizzare per eseguire i conteggi su piastra. Eseguire una diluizione seriale di ciascun campione batterico selezionato con soluzione salina.

Per eseguire questa operazione, pipettare 180 microlitri di soluzione salina nelle colonne appropriate. Trasferire 20 microlitri della soluzione batterica e diluire con 180 microlitri di soluzione salina. Cambiare la punta della pipetta, mescolare e trasferire 20 microlitri della soluzione batterica diluita in 180 microlitri di soluzione salina.

Ripetere questo processo sei volte. Successivamente, prelevare 10 microlitri ciascuno dalle ultime sei diluizioni e depositarli sotto forma di spot su una piastra rettangolare con terreno Agar. Su una piastra rettangolare possono essere depositati 36 spot.

Lasciare asciugare la piastra per 15 minuti sul banco; trascorsi 15 minuti, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 16 ore dopo l'incubazione. Contare le colonie per determinare le unità formanti colonie per millilitro. Moltiplicare il numero di colonie per il fattore di diluizione e dividere per il volume inoculato per determinare l'effetto dei trattamenti sulla crescita batterica.

La densità cellulare di e coli è stata misurata a OD 600. Qui sono mostrate curve rappresentative della crescita batterica con diverse concentrazioni di farmaco, da zero fino alla morte cellulare completa. I simboli aperti indicano PMB soltanto, con le concentrazioni indicate.

I simboli pieni rappresentano C-D-T-E-P-M-B senza irradiazione e i simboli semipieni rappresentano C-D-T-E-P-M-B con irradiazione. L'irradiazione non ha avuto alcun effetto sui campioni contenenti solo PMB, pertanto queste curve sono state omesse per maggiore chiarezza. Di seguito sono riportati i grafici dei valori della curva di crescita a 200 minuti in funzione del logaritmo di PMB e i relativi adattamenti a questa equazione, utilizzati per determinare i valori di IC50 al fine di controllare gli effetti della luce.

Viene effettuata una curva solo con l'antibiotico e 30 minuti di esposizione alla luce. Questa figura indica la sopravvivenza batterica a 200 minuti in funzione della concentrazione dei QD, utilizzando QD di CDTE. Si osserva una certa tossicità con l'esposizione alla luce, ma troppo scarsa per determinare un valore di IC 50.

Ciò indica che la tossicità del CDTE da solo alle concentrazioni utilizzate nell'esperimento di coniugazione è trascurabile. Per confrontare gli effetti di diversi trattamenti sulla crescita cellulare, i valori della curva di crescita a 200 minuti sono stati riportati in grafico e adattati all'equazione mostrata in precedenza, come illustrato qui. I coniugati C-D-T-E-P-M-B erano più tossici rispetto al PMB da solo. Per confronto, i coniugati di nanoparticelle d'oro A-U-P-M-B non mostrano un aumento della tossicità rispetto al PMB da solo, al fine di determinare l'effetto dei trattamenti sulla sopravvivenza batterica.

Il numero di unità formanti colonie è stato determinato per E. coli coltivati in una piastra a 96 pozzetti trattata con P-M-B-Q-D-P-M-B o con QD da solo, in presenza o assenza di radiazione I per 30 minuti, seguita da incubazione a 32 gradi Celsius per quattro ore. Sono state effettuate diluizioni seriali di ogni campione batterico con soluzione salina e 10 microlitri di soluzioni da 100 x a 10 alla settima x sono stati seminati su piastre di agar. Le piastre sono state incubate a 37 gradi Celsius e le colonie sono state contate dopo 16 ore.

In questo esempio, le colonne della piastra da A a C contengono batteri trattati con concentrazioni crescenti di CDTE. I coniugati senza irradiazione e quelli dalle colonne D a F contengono batteri trattati con concentrazioni crescenti di coniugati. Insieme a 30 minuti di irradiazione, le diluizioni sono mostrate lungo le righe.

I dati indicano che, a seguito dell'irradiazione, i coniugati inibiscono maggiormente la crescita batterica rispetto ai coniugati senza irradiazione. Non dimenticare che i reagenti ca sono estremamente tossici e che è sempre necessario adottare precauzioni, come indossare guanti, camici da laboratorio e occhiali protettivi, durante l'esecuzione di questa procedura. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire il screening ad alto rendimento dell'effetto antibatterico di nanoparticelle coniugate o non coniugate con antibiotici.