In Elettroporazione vitro del labbro inferiore Rombico di embrioni di topo Midgestation

L'obiettivo generale di questa procedura è manipolare l'espressione genica nei progenitori del romboencefalo embrionale mediante l'introduzione di DNA plasmidico tramite elettroporazione in fasi precoci della gestazione. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto gli embrioni a 11,5 giorni di gestazione e posizionandoli con la faccia dorsale rivolta verso l'alto in soluzione salina tamponata al fosfato sterile. Il secondo passaggio consiste nell'iniettare circa 50 microlitri del plasmide di espressione in 0,01% di verde fast.

In un'iniezione riuscita, l'intero sistema ventricolare sarà riempito dalla miscela di DNA e verde brillante. Successivamente, l'embrione viene sottoposto a un impulso elettrico. Il lato dell'embrione più vicino all'elettrodo carico positivamente assorbirà il DNA plasmidico.

L'altro lato fungerà da controllo negativo interno. L'ultimo passaggio consiste nel posizionare gli embrioni in coltura tessutale per almeno 24 ore. Alla fine, il gene elettroporato verrà espresso dopo 24 ore di coltura e potrà essere valutato mediante immunohistochemia.

Il vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti consiste nella possibilità di manipolare i progenitori del romboencefalo embrionale in fasi gestazionali precedenti. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali del settore, ad esempio in che modo diversi geni ural possano influenzare il destino dei progenitori embrionali. Iniziare questa procedura sterilizzando gli strumenti da dissezione e la cappa a flusso laminare secondo il manoscritto allegato.

Per raccogliere gli embrioni, posizionare un topo femmina eutanasizzato, gravido di piccoli, al giorno di gestazione E 11,5 su un vassoio da dissezione all'interno della cappa. Successivamente, spruzzare l'addome del topo con etanolo al 70%. Aprire la cavità peritoneale e fissare le pareti al vassoio da dissezione.

Quindi estrarre i corni uterini in modo che si trovino all'interno della cavità peritoneale. Utilizzando pinzette, aprire con attenzione la parete del corno uterino. Usare un cucchiaino da 20 millimetri per rimuovere delicatamente gli embrioni nel sacco vitellino dalla placenta.

Successivamente, posizionare gli embrioni in una piastra per colture cellulari da 100 millimetri, riempita in precedenza con 10 millilitri di PBS sterile pre-riscaldato una volta. In questo passaggio, trasferire il primo embrione in una nuova piastra da 100 millimetri, riempita in precedenza con 10 millilitri di PBS sterile una volta, pre-riscaldato a 37 gradi Celsius.

Successivamente, rimuovere con attenzione e scartare la vescica vitellina. Quindi posizionare l'embrione in modo che il lato dorsale sia rivolto verso l'alto. Trattenere delicatamente l'embrione con le palette dell'elettrodo da sette millimetri sotto un microscopio stereoscopico.

Posizionare gli elettrodi uno su ciascun lato del tubo neurale al livello del quarto ventricolo del romboencefalo. Successivamente, utilizzare una siringa da un cc per aspirare la miscela di DNA plasmidico e Fast screen allo 0,01%; in generale, 500 microlitri della miscela sono sufficienti per l'elettroporazione di almeno otto-dieci embrioni. Poi, perforare delicatamente la lamina tetto sovrastante il quarto ventricolo con un ago da tubercolina da 25 gauge, lungo cinque ottavi di pollice, collegato alla siringa da un CC.

Quindi iniettare circa 50 microlitri della miscela DNA DI nel ventricolo. Le iniezioni di successo si caratterizzano per il riempimento dell'intero sistema ventricolare da parte della miscela DNA DI. Un metodo alternativo per somministrare la miscela DNA DI prevede l'accesso al sistema ventricolare attraverso la perforazione del velo, sovrastante il mesencefalo, l'accensione del generatore di impulsi e la somministrazione di cinque impulsi quadrati mediante un generatore di impulsi elettrodici e le palette elettrode di sette millimetri, posizionate in prossimità del tessuto più vicino all'elettrodo positivo.

Successivamente, dopo aver prelevato il plasmide in una cappa a flusso laminare, riempire i pozzetti di una piastra da coltura a 12 pozzetti con due millilitri di terreno DME MF 12 integrato con 10% di siero fetale bovino, 5% di siero equino, 1% di glutammina e 1% di penicillina-streptomicina, precedentemente riscaldato a 37 gradi Celsius. Poi afferrare l'embrione nella sua parte centrale con un paio di pinzette. Rimuovere la porzione posteriore dell'embrione e successivamente posizionare la porzione anteriore in uno dei pozzetti riempiti della piastra di coltura.

Ripetere la procedura per tutti gli embrioni e riempire solo le pozzette esterne della piastra a 12 pozzette. Per evitare contaminazioni delle colture, coltivare gli embrioni in un incubatore a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per 24 ore al fine di esprimere il plasmide elettroporato. Se si desidera un tempo di coltura più lungo, riempire le pozzette centrali di una nuova piastra a 12 pozzette con due millilitri di mezzo D-M-E-M-F 12.

Trasferire gli embrioni con un cucchiaio sterilizzato nelle pozzette di una nuova piastra. Quindi riposizionarli nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e coltivarli per un massimo di 48 ore per fissare gli embrioni prima dell'analisi. Riempire una piastra a 12 pozzette con PBS 1x, quindi trasferire gli embrioni e lavarli a 4 gradi Celsius per cinque minuti.

Successivamente, fissare gli embrioni in paraformaldeide al 2% in PBS 1x per due ore a quattro gradi Celsius. Quindi lavarli tre volte in PBS 1x a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Ancora, dopo aver riempito una nuova piastra a 12 pozzetti con saccarosio al 30% in PBS 1x.

Trasferire gli embrioni in quelle pozzette ed equilibrarli durante la notte a quattro gradi Celsius. Successivamente, incorporare gli embrioni nel composto ottimale per il taglio criostatico utilizzando un bagno di etanolo e anidride carbonica solida oppure conservarli a meno 20 gradi Celsius. Alla fine, sezionare gli embrioni in sezioni da 30 micron mediante criostato.

Montarli su vetrini e conservarli a meno 20 gradi Celsius da uni istochimico. I risultati rappresentativi mostrati di seguito riguardano l'immunohistochimica per GFP su sezioni trasversali di un embrione elettroporato a E 11,5 dopo 24 ore di coltura. Le frecce indicate qui mostrano la piastra del tetto che intrappola l'anticorpo secondario.

I risultati mostrano che l'area elettroporata del labbro ROIC inferiore era limitata e non si estendeva lungo tutto l'asse anteroposteriore del tubo neurale. Qui vengono mostrati i risultati relativi a due delle proteine analizzate: MASH1 e Math1. Abbiamo osservato che la maggior parte degli embrioni mantiene livelli normali di espressione dopo l'elettroporazione e la coltura, rispetto agli embrioni di controllo a 11,5. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in uno o due ore se eseguita correttamente.

Dopo aver visto questo video, ora dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il saggio di elettroporazione in vitro per manipolare l'espressione genica nei progenitori della membrana embrionale del topo.