Name: In Elettroporazione vitro del labbro inferiore Rombico di embrioni di topo Midgestation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Scopri l'elettroporazione in vitro del labbro inferiore rombico in embrioni di topo a metà gestazione. Questo metodo consente la manipolazione mirata dell'espressione genica nei progenitori del tronco encefalico embrionale.

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Gli autori desiderano ringraziare Jane Johnson per il Math1, Ngn1, e gli anticorpi Ptf1a e Connie Cepko per la pCAG :: GFP plasmide. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH 1R15HD059922 R15-01.

1. La preparazione prima Elettroporazione <ol><li> Amplificare il DNA per l&#39;elettroporazione di un maxi prep (Prime-It or Qiagen). La concentrazione del DNA dovrebbe essere un minimo di 1 mg / ml per l&#39;assorbimento efficiente. </li><li> Rimuovere 495 pl di DNA e mescolare con 5 pl di 0,01% verde veloce in 1 x PBS (tampone fosfato salino) in una provetta da microcentrifuga. </li></ol> 2. Harvest embrionali <ol><li> Stabilire accoppiamenti cronometrati di topi CD-1 (Harlan). Verificare la presenza di tappi vaginali e considerano la data si osserva un tappo vaginale come il giorno embrionale (E) 0.5. Gli embrioni saranno raccolte 11 giorni dopo la visualizzazione spina (E11.5). </li><li> Posizionare strumenti sterilizzati in etanolo 70%. Trattare una cappa a flusso laminare con luce UV per almeno un&#39;ora prima dell&#39;uso. Spray hood, vassoio di dissezione, e dissezione portata con il 70% di etanolo. Pre-calore 1 X PBS a 37 ° C. </li><li> Sul E11.5 l&#39;eutanasia della femmina in base alle condizioni approvate dal InstitutComitato ionale per la cura e l&#39;uso degli animali (ICCUA). Mettere nel cassetto dissezione cappa a flusso laminare. Spruzzare verso il basso l&#39;addome della femmina con il 70% di etanolo. </li><li> Aprire la cavità peritoneale e appuntare le pareti al vassoio dissezione. Estrarre le corna uterine in modo che appoggi all&#39;interno della cavità peritoneale. </li><li> Tagliare con cautela aprire la parete della tromba uterina. Utilizzare un cucchiaio 20 mm (Belle Strumenti Scientifici) per rimuovere delicatamente l&#39;embrione nel sacco vitellino lontano dalla placenta. Embrioni luogo in un piatto di coltura tissutale 100 millimetri pre-riempite con 10 ml di PBS sterile 1 X che è stato preriscaldato in 2.2. </li><li> Ripetere l&#39;operazione per tutti gli embrioni presenti. </li></ol> 3. Elettroporazione di embrioni E11.5 (figura 1) <ol><li> Utilizzo di un cucchiaio 20 mm, trasferire il primo embrione in un piatto 100 millimetri preriempita con 10 ml di 1XPBS sterili che è stato preriscaldato a 37 ° C. </li><li> Utilizzare pinze cm 11 x 0,05 con una punta di 0,02 mm (Belle Strumenti Scientifici) di ri attenzionespostare ed eliminare il sacco vitellino. </li><li> Embrione di posizione in modo che il suo lato dorsale è rivolto verso l&#39;alto in modo che assomigli il cartone in Figura 1A. Utilizzare 7 pale elettrodi mm (Harvard Apparatus) a tenere delicatamente l&#39;embrione. Gli elettrodi devono essere posizionati su entrambi i lati del tubo neurale a livello del ventricolo rombencefalo quarto. Il ventricolo è visibile ad occhio nudo, ma utilizzando un microscopio di dissezione può facilitare il posizionamento accurato paddle. Posizionamento delle palette è fondamentale per determinare la regione che riceve il DNA elettroporata. Se il labbro inferiore romboidale (LRL) del rombencefalo dorsale embrionale si desidera, pale deve essere posto in modo tale che essi sono direttamente fiancheggia la parte più larga dell&#39;apertura quarto ventricolo. </li><li> Utilizzare una siringa da 1 cc a redigere il DNA plasmidico miscelato con 0,01% Verde Fast. 500 pl della miscela deve essere sufficiente per l&#39;elettroporazione di almeno 8-10 embrioni (cfr. 3.5). </li><li> Delicatamente perforare la ov roofplateerlying quarto ventricolo con un ago 25G tubercolina 5/8 attaccato alla siringa 1 cc e iniettare il DNA-colorante miscela nel ventricolo. Iniezioni successo sono caratterizzate dal DNA-colorante miscela riempimento dell&#39;intero sistema ventricolare (Figura 1C). La quantità di DNA-colorante miscela tipicamente iniettato è inferiore a 50 pl. Importi esatti sono variabili tra embrioni come una porzione della miscela tende a fuoriuscire dal ventricolo nel PBS che circonda l&#39;embrione. Un mezzo alternativo di consegna del DNA-dye miscela sarebbe attraverso l&#39;accesso al sistema ventricolare perforando il velo che ricopre il mesencefalo. Ancora, iniezioni di successo sono caratterizzati dal DNA-colorante miscela riempimento dell&#39;intero sistema ventricolare. </li><li> Consegnare cinque impulsi quadrati utilizzando un generatore di impulso elettrico (BTX) e 7 pale elettrodi mm. Ogni impulso è 50 V della durata di 5 ms per impulso con 500 ms tra ogni impulso. Il tessuto più vicino all&#39;elettrodo caricata positivamente quindi take il plasmide. </li></ol> 4. Cultura di embrioni <ol><li> In una cappa a flusso laminare, riempire i pozzetti esterne di un 12-ben piatto di coltura con 2 mL di DMEM/F12 mezzo supplementato con 10% siero fetale bovino, 5% siero equino, 1% glutammina, 1% di penicillina / streptomicina che è stato preriscaldato a 37 ° C. Le condizioni di coltura sono stati adattati da de Diego e colleghi 15. </li><li> In embrioni cappa a flusso laminare pizzico di midsection (sotto il cuore) con una pinza e rimuovere parte posteriore dell&#39;embrione. Posizionare la porzione anteriore in uno dei pozzetti riempiti del 12-ben piatto di coltura. </li><li> Ripetere l&#39;operazione per tutti gli embrioni. Riempire solo i pozzi esterni del 12 pozzetti per evitare la contaminazione delle culture. </li><li> Cultura embrioni in un incubatore a 37 ° C al 5% di CO 2. Espressione del plasmide elettroporate dovrebbe essere osservabile entro 24 ore. </li><li> In caso di tempi più lunghi la cultura essere desiderata, riempire i pozzetti su un nuovo piatto ben 12 con 2 ml dii supporti utilizzati in 4.1. Con un cucchiaio sterilizzato trasferire gli embrioni a un pozzo nella nuova piastra. Mettere di nuovo nel 37 ° C incubatore. La cultura per un massimo di 48 ore è possibile. </li><li> Quando il tempo di coltura desiderato viene raggiunto, fissare embrioni per analisi (vedi sotto). </li></ol> 5. Preparazione di embrioni per l&#39;analisi <ol><li> Risciacquare embrioni in 1 x PBS a 4 ° C per cinque minuti. Ripeti. </li><li> Fix embrioni per analisi in 2% paraformaldeide (PFA) in 1XPBS per 2 ore a 4 ° C. </li><li> Risciacquare embrioni in 1 x PBS a 4 ° C per cinque minuti. Ripeti. </li><li> Equilibrare embrioni in 30% saccarosio in 1 x PBS notte a 4 ° C. </li><li> Incorpora embrioni in temperatura ottimale di taglio (OCT) composto con un ghiaccio secco / etanolo bagno. Gli embrioni possono essere conservati a -20 ° C. </li><li> Embrioni sezione in un criostato (Leica), in 30 sezioni micron e montare su vetrini (VWR, Superfrost Plus). Conservare a -20 ° C. </li></ol> 6. ImmuAnalisi nohistochemistry <ol><li> L&#39;immunoistochimica è stata eseguita come descritto in 16. Diluizioni degli anticorpi primari utilizzati per questo studio includono coniglio α-GFP (Invitrogen) 1:2500; del mouse α-Mash1 (BD Biosciences) 1:100; coniglio α-Ngn1 (Jane Johnson) 1:5000; coniglio α-Ptf1a (Jane Johnson ) 1:2500; coniglio Math1 (Jane Johnson) 1:100. Incubare guida piatta, lato campione su un vassoio di colorazione a 4 ° C per una notte. </li><li> I vetrini sono stati analizzati su un microscopio composto (Olympus BX51). </li></ol> 7. Risultati rappresentativi Uno schema in figura 1A mostra l&#39;esperimento elettroporazione. Figura 1B mostra una vista sagittale di un embrione E11.5 prima della manipolazione. L&#39;embrione stesso dopo l&#39;iniezione del CAG plasmide contenente :: GFP in 0,01% verde rapido viene mostrato nella Figura 1C e rappresentante un embrione non fissata espositiva GFP unilateraleespressione nella dorsale rombencefalo 24 ore cultura seguente è mostrato nella figura 1D. L&#39;estensione della zona del LRL che viene correttamente elettroporata è variabile e sembra essere fortemente dipendente posizionamento degli elettrodi. Nei nostri studi è stato trovato che 52 su 65 (80%) degli embrioni elettroporate espressi con successo GFP. Tessuto è stato considerato essere correttamente elettroporata se era positivo per GFP nelle regioni localizzate su varie sezioni successivo fissaggio e l&#39;analisi immunoistochimica (vedi sotto). Gli embrioni che non hanno rispettato questi criteri sono stati segnati come tentativi falliti di elettroporazione. Ulteriore valutazione dell&#39;efficienza elettroporazione può essere accertata eseguendo immunoistochimica contro GFP su sezioni trasversali di embrioni elettroporate a livello del quarto ventricolo. Figura 2 mostra rappresentativi sezioni seriali da un embrione visualizzazione unilateraleEspressione di GFP. Figura 2A mostra uno schema idealizzato che illustra che il lato sinistro dell&#39;embrione era verso l&#39;elettrodo positivo. Sezioni trasversali (a livelli rappresentati dalla metà cartone di figura 2A) rivelare l&#39;espressione localizzata GFP esclusivamente sul lato sinistro del tessuto rombencefalo (figure 2C e 2D). L&#39;area elettroporata del LRL non estendere l&#39;intero asse anteriore-posteriore del tubo neurale come esame di sezioni 300 um rostrali o superiore a quella mostrata in Figura 2C non esprime GFP (Figura 2B). L&#39;utilità di questo test di manipolazione genica dipende dalla stabilità dei domini di espressione per le proteine ​​endogene. Il LRL è stato caratterizzato come in possesso di domini unico progenitore caratterizzate dalla espressione differenziale di fattori di trascrizione proneural (recensione in 1).Un sottoinsieme di questi fattori (Mash1, Math1, Ngn1 e Ptf1a) sono stati scelti per l&#39;analisi a causa della loro proposta e / o ruoli caratterizzati nel disciplinare di precerebellar sottotipi neurali nel LRL, oggetto di studi futuri 16-18. Tutte e quattro le proteine ​​hanno domini di espressione altamente caratteristici della rombencefalo caudale a E11.5 16-18. Abbiamo osservato che gli embrioni che sono stati collocati culture riuscito ad aumentare di dimensioni e inoltre non riesce a iniziare la produzione di epitelio plesso coroideo e invaginazione delle LRL e roofplate, eventi morfologici che si verificano tra E11.5 e E12.5 5. Sulla base di queste osservazioni è stato stabilito che il normale sviluppo di questi embrioni è stata interrotta o gravemente ritardata e il controllo comparabile per gli embrioni devono essere colte incolte embrioni a E11.5. Per garantire che la cultura ed elettroporazione non disturbare i livelli di proteine ​​endogene, abbiamo analizzato quattro diverse proteine ​​da immunohistochemistry (IHC) in 34 embrioni differenti che sono state elettroporate e quindi coltivate per almeno 24 ore. Tabella I mostra il numero di embrioni analizzati per ciascun marcatore e la percentuale degli embrioni analizzato che mantiene livelli normali proteine. Figura 3 mostra i dati rappresentativi IHC da due delle proteine ​​analizzati, Mash1 (Figure 3A e 3B) e Math1 (figure 3C e 3D). Abbiamo osservato che la maggior parte degli embrioni mantiene livelli normali di elettroporazione seguente espressione e cultura (figure 3b e 3d) rispetto agli embrioni di controllo a E11.5 (Figure 3A e 3C). È importante sottolineare che i domini di espressione caratteristici di queste proteine ​​non sono stati perturbato. <img src="/files/ftp_upload/3983/3983fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Elettroporazione di embrioni a E11.5. (A) Schema di The elettroporazione esperimento. Un embrione E11.5 è isolato e il plasmide di espressione in 0,01% verde rapido viene iniettato nel quarto ventricolo. L&#39;embrione viene affiancata da pale elettrodi e sottoposto ad un impulso V 50 prima di essere messi in coltura (B) sagittale di un embrione E11.5 prima dell&#39;iniezione. (C) L&#39;embrione stesso E11.5 dopo l&#39;iniezione del plasmide di 0,01% verde Fast. (D) espressione rombencefalo unilaterale della GFP osservato in embrioni E11.5 dopo 24 ore di cultura. mb-mesencefalo; 4V quarto ventricolo. <img src="/files/ftp_upload/3983/3983fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. L&#39;espressione di GFP in Tissue elettroporata. (A) Il cartone sulla sinistra rappresenta il posizionamento degli elettrodi attorno a un embrione E11.5. Cartone mediana mostra l&#39;assorbimento e l&#39;espressione di GFP plasmide codificante sul lato sinistro dell&#39;embrione. Cartoon sulla destra è schematica di una sezione trasversale idealizzata presa attraverso l&#39;embrione in levels contrassegnata da linee nere in mezzo fumetto. (B-D) per la GFP immunoistochimica su sezioni trasversali attraverso un embrione elettroporate E11.5 dopo 24 ore di cultura. Le frecce indicano la (rp) roofplate che intrappola l&#39;anticorpo secondario. Le immagini sono prese a ingrandimento 10X. I livelli relativi delle sezioni mostrate sono rappresentati dalle linee orizzontali attraverso il cartone centrale in (A). mb-mesencefalo; l 4V quarto ventricolo; rp-roofplate. <img src="/files/ftp_upload/3983/3983fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Espressione di proteine ​​endogene nel labbro inferiore rombico immunoistochimica per Mash1 (A e B) o Math1 (C e D) confrontare sezioni trasversali di embrioni E11.5 che non erano coltivate (A, C) con embrioni sono state elettroporate con CAG.: : GFP e coltivate per 24 ore (B e D). Immagini prese con ingrandimento 10X. <table border="1"><tbody><tr><td> Proneural Transcriptisu fattori analizzati </td><td> Numero di embrioni analizzati </td><td> Percentuale ritenuta Patterns normale espressione </td></tr><tr><td> Math1 </td><td> 15 </td><td> 86,7% </td></tr><tr><td> Mash1 </td><td> 12 </td><td> 83,3% </td></tr><tr><td> Ngn1 </td><td> 7 </td><td> 71,4% </td></tr><tr><td> Ptf1a </td><td> 6 </td><td> 100% </td></tr></tbody></table> Tabella I. Percentuale di embrioni elettroporate e colto di contenimento normali Proneural Domini fattore di trascrizione nel LRL.

<ol><li>Ray, R. S., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rautenlippe+Redux+--+toward+a+unified+view+of+the+precerebellar+rhombic+lip%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Rautenlippe Redux -- toward a unified view of the precerebellar rhombic lip.</a> Current opinion in cell biology. 21, 741-747 (2009).</li>
<li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48, 17-24 (2005).</li>
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<li>de Diego, I., Kyriakopoulou, K., Karagogeos, D., Wassef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+influences+on+the+migration+of+precerebellar+neurons+in+the+caudal+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Multiple influences on the migration of precerebellar neurons in the caudal medulla.</a> Development (Cambridge, England). 129, 297-306 (2002).</li>
<li>Landsberg, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hindbrain+rhombic+lip+is+comprised+of+discrete+progenitor+cell+populations+allocated+by+Pax6%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hindbrain rhombic lip is comprised of discrete progenitor cell populations allocated by Pax6.</a> Neuron. 48, 933-947 (2005).</li>
<li>Hoshino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ptf1a%2C+a+bHLH+transcriptional+gene%2C+defines+GABAergic+neuronal+fates+in+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum.</a> Neuron. 47, 201-213 (2005).</li>
<li>Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+climbing+fiber+neurons+and+their+developmental+dependence+on%5BTitle%5D)+AND+%22Ptf1a.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origin of climbing fiber neurons and their developmental dependence on.</a> Ptf1a. J. Neurosci. 27, 10924-10934 (2007).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

La tecnica di elettroporazione in vitro presentato in questo studio è una nuova metodologia che può essere efficacemente utilizzata per manipolare l&#39;espressione genica in embrioni di età inferiore ai 12 giorni di gestazione. Posizionamento degli embrioni in cultura permette l&#39;espressione del gene introdotto e aggira la letalità osservata quando embrioni elettroporate possono rimanere in vivo. Questa tecnica permette la manipolazione di espressione genica in progenitori embrionali precedentement...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Leica </td><td> CM-1850 </td><td></td></tr><tr><td> Biologie punta Dumoxel trattati DUMONT forcipe </td><td> Belle Strumenti Scientifici </td><td> 11252-30 </td><td></td></tr><tr><td> 20 millimetri MORIA cucchiaio forato </td><td> Belle Strumenti Scientifici </td><td> 10370-17 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 Onda quadra Generator Elettroporazione </td><td> BTX (VWR) </td><td> 47745-928 </td><td></td></tr><tr><td> Harvard Apparatus Tweezertrodes 7 mm * Elettrodi </td><td> BTX (Fisher) </td><td> BTX450165 </td><td></td></tr><tr><td> Fisher Isotemp CO 2 Incubator </td><td> Pescatore </td><td> 1325525 </td><td></td></tr><tr><td> NAPCO CO 2 Gas Regulator </td><td> Pescatore </td><td> 15497020 </td><td></td></tr><tr><td> 12 Bene piastre di coltura dei tessuti </td><td> BD Falcon (Fisher) </td><td> 877229 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone Liquid media DMEM/F-12 (1:1), con L-glutammina e HEPES; 500mL </td><td> Thermo Scientific (Fisher) </td><td> SH3002301 </td><td></td></tr><tr><td> HyClone * Donor siero equino </td><td> Thermo Scientific (Fisher) </td><td> SH3007402 </td><td></td></tr><tr><td> Siero fetale bovino, qualificato, inattivato al calore </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-063 </td><td></td></tr><tr><td> Cellgro * 10.000 UI di penicillina, 10.000 mg / ml di streptomicina </td><td> Mediatech (Fisher) </td><td> MT-30-002-CI </td><td></td></tr><tr><td> HyClone * L-Glutamina L-Glutammina; 200 mm in NaCl 0,85% </td><td> Thermo Scientific (Fisher) </td><td> SH3003401 </td><td></td></tr><tr><td> Fast-verde </td><td> Pescatore </td><td> AC41053-0250 </td><td> 0,01% </td></tr></tbody></table>

in elettroporazione vitro del labbro inferiore rombico di embrioni di topo midgestation

In vitro Electroporation of the Lower Rhombic Lip of Midgestation Mouse Embryos

Il labbro rombico è uno neuroepitelio embrionale situato nel rombencefalo alla giunzione tra il tubo neurale e la roofplate del quarto ventricolo (recensione in 1). Il labbro rombico può essere suddiviso nel labbro superiore romboidale (URL) che comprende rhombomere 1 (R1) e genera neuroni del cervelletto e il labbro inferiore romboidale (LRL) che dà luogo a diversi lignaggi tronco neuronali 2-4. LRL derivati ​​comprendono i neuroni uditivi dei nuclei cocleari e quelle dei nuclei precerebellar che sono coinvolti nella regolazione dell&#39;equilibrio e il controllo motorio 5-8. Neurogenesi dalla LRL si verifica su una grande finestra temporale che abbraccia giorni embrionali (E) 9,5-16,5 5, 9. Differenti linee neuronali emergono dal LRL come cellule postmitotico (o sono nati) durante il giorno di sviluppo distinti durante questa finestra neurogena. Elettroporazione di costrutti di espressione genica può essere utilizzato permanipolare l&#39;espressione genica in progenitori LRL e potenzialmente in grado di cambiare il destino dei neuroni ottenuti da questa regione 10-12. Alterare l&#39;espressione genica dei progenitori LRL nel topo mediante elettroporazione in utero ha avuto molto successo per la manipolazione di lignaggi nati il giorno embrionale E12.5 o poi 10, 12-14. In elettroporazioni utero prima E12.5 non hanno avuto successo dovuto principalmente al mortalità associato con la puntura del roofplate quarto ventricolo, un passo necessario nella realizzazione di DNA esogeno che viene elettroporate nel LRL. Tuttavia, molti lignaggi LRL derivati ​​nascono dalla LRL prima di E12.5 9. Questi lignaggi anteriore nati includono i neuroni che compongono il reticolare laterale, cuneate esterna e inferiore nuclei olivare del sistema precerebellar che funzionano per collegare gli ingressi dal midollo spinale e corteccia al cervelletto 5. Per manipolare espressione nel LRLdi embrioni con meno di E12.5, abbiamo sviluppato un sistema in vitro in cui si trovano gli embrioni nella cultura dopo l&#39;elettroporazione. Questo studio presenta un metodo efficiente ed efficace per manipolare l&#39;espressione genica di progenitori LRL a E11.5. Gli embrioni elettroporate con la proteina fluorescente verde (GFP) guidato dal promotore CAG ampiamente attiva riproducibile espresso GFP dopo 24 ore di coltura. Un aspetto critico di questo saggio è che l&#39;espressione genica è alterata solo per l&#39;espressione del gene esogeno e non a causa di effetti secondari che derivano dalla elettroporazione e tecniche di coltura. E &#39;stato stabilito che i pattern di espressione dei geni endogeni restano indisturbati negli embrioni elettroporate e colta. Questo test può essere utilizzato per modificare il destino delle cellule che emergono dalla LRL di embrioni di età inferiore ai E12.5 attraverso l&#39;introduzione di plasmidi per la sovraespressione o abbattere (tramite RNAi) di diverse pro-fattori di trascrizione neurali.

Questo studio descrive lo sviluppo di uno<em&gt; In vitro</emElettroporazione&gt; tecnica che permette la manipolazione di espressione genica nel labbro inferiore rombica di embrioni midgestation.

In Elettroporazione vitro del labbro inferiore Rombico di embrioni di topo Midgestation

Il labbro rombico è un neuroepitelio embrionale situato nel rombencefalo, alla giunzione tra il tubo neurale e la placca del tetto del quarto ventricolo...

L'obiettivo generale di questa procedura è manipolare l'espressione genica nei progenitori del romboencefalo embrionale mediante l'introduzione di DNA plasmidico tramite elettroporazione in fasi precoci della gestazione. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto gli embrioni a 11,5 giorni di gestazione e posizionandoli con la faccia dorsale rivolta verso l'alto in soluzione salina tamponata al fosfato sterile. Il secondo passaggio consiste nell'iniettare circa 50 microlitri del plasmide di espressione in 0,01% di verde fast. In un'iniezione riuscita, l'intero sistema ventricolare sarà riempito dalla miscela di DNA e verde brillante. Successivamente, l'embrione viene sottoposto a un impulso elettrico. Il lato dell'embrione più vicino all'elettrodo carico positivamente assorbirà il DNA plasmidico.L'altro lato fungerà da controllo negativo interno. L'ultimo passaggio consiste nel posizionare gli embrioni in coltura tessutale per almeno 24 ore. Alla fine, il gene elettroporato verrà espresso dopo 24 ore di coltura e potrà essere valutato mediante immunohistochemia.Il vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti consiste nella possibilità di manipolare i progenitori del romboencefalo embrionale in fasi gestazionali precedenti. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali del settore, come ad esempio in che modo diversi geni ural possano influenzare il destino dei progenitori embrionali. Iniziare questa procedura sterilizzando gli strumenti da dissezione e la cappa a flusso laminare secondo il manoscritto allegato.Per raccogliere gli embrioni, posizionare un topo femmina eutanasizzato, gravido di piccoli, al giorno di gestazione E 11,5 su un vassoio da dissezione all'interno della cappa. Successivamente, spruzzare l'addome del topo con etanolo al 70%. Aprire la cavità peritoneale e fissare le pareti al vassoio da dissezione.Estrarre quindi i corni uterini in modo che si trovino all'interno della cavità peritoneale. Utilizzando pinzette, aprire con cura la parete del corno uterino. Usare un cucchiaino da 20 millimetri per rimuovere delicatamente gli embrioni nel sacco vitellino dalla placenta.Successivamente, posizionare gli embrioni in una piastra per colture cellulari da 100 millimetri, precedentemente riempita con 10 millilitri di PBS sterile pre-riscaldato una volta. In questo passaggio, trasferire il primo embrione in una nuova piastra da 100 millimetri precedentemente riempita con 10 millilitri di PBS sterile una volta, pre-riscaldato a 37 gradi Celsius.Successivamente, rimuovere con attenzione e scartare la vescica vitellina. Poi posizionare l'embrione in modo che il lato dorsale sia rivolto verso l'alto. Trattenere delicatamente l'embrione con le palette degli elettrodi da sette millimetri sotto un microscopio stereoscopico.Posizionare gli elettrodi uno su ciascun lato del tubo neurale al livello del quarto ventricolo del romboencefalo. Successivamente, utilizzare una siringa da un cc per aspirare la miscela di DNA plasmidico e Fast screen allo 0,01%; in generale, 500 microlitri della miscela sono sufficienti per l'elettroporazione di almeno otto-dieci embrioni. Quindi, perforare delicatamente la lamina tetto sovrastante il quarto ventricolo con un ago da tubercolina da 25 gauge, lungo cinque ottavi, collegato alla siringa da un CC.Quindi iniettare circa 50 microlitri della miscela DNA DI nel ventricolo. Le iniezioni riuscite si caratterizzano per il riempimento dell'intero sistema ventricolare da parte della miscela DNA DI. Un metodo alternativo per somministrare la miscela DNA DI prevede l'accesso al sistema ventricolare tramite la perforazione del velo, sovrastante il mesencefalo, l'accensione del generatore di impulsi e la somministrazione di cinque impulsi quadrati mediante un generatore di impulsi elettrodici e le palette elettrode da sette millimetri, con il tessuto più vicino all'elettrodo positivo.Successivamente, in un'area di flusso laminare, prendere il plasmide e riempire i pozzetti di una piastra da coltura a 12 pozzetti con due millilitri di terreno DME MF 12 integrato con 10% di siero fetale bovino, 5% di siero equino, 1% di glutammina e 1% di penicillina-streptomicina, pre-riscaldato a 37 gradi Celsius. Poi afferrare l'embrione nella sua parte centrale con una pinzetta. Rimuovere la porzione posteriore dell'embrione e successivamente posizionare la porzione anteriore in uno dei pozzetti riempiti della piastra di coltura.Ripetere la procedura per tutti gli embrioni e riempire solo le pozzette esterne della piastra a 12 pozzette. Per evitare contaminazioni delle colture, coltivare gli embrioni in un incubatore a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per 24 ore al fine di esprimere il plasmide elettroporato. Se si desidera un tempo di coltura più lungo, riempire le pozzette centrali di una nuova piastra a 12 pozzette con due millilitri di mezzo D-M-E-M-F 12.Trasferire gli embrioni con un cucchiaio sterilizzato nelle pozzette di una nuova piastra. Quindi riposizionarli nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e coltivarli per un massimo di 48 ore per fissare gli embrioni prima dell'analisi. Riempire una piastra a 12 pozzette con PBS 1x, quindi trasferire gli embrioni e lavarli a 4 gradi Celsius per cinque minuti.Successivamente, fissare gli embrioni in paraformaldeide al 2% in PBS 1x per due ore a quattro gradi Celsius. Quindi lavarli tre volte in PBS 1x a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Ancora, dopo aver riempito una nuova piastra a 12 pozzetti con saccarosio al 30% in PBS 1x.Trasferire gli embrioni in quelle pozzette ed equilibrare durante la notte a quattro gradi Celsius. Successivamente, incorporare gli embrioni nel composto ottimale per il taglio criostatico utilizzando un bagno di etanolo e anidride carbonica solida oppure conservarli a meno 20 gradi Celsius. Alla fine, sezionare gli embrioni in sezioni da 30 micron mediante un criostato.Montarli su vetrini e conservarli a meno 20 gradi Celsius da uni istochimico. I risultati rappresentativi mostrati qui di seguito riguardano l'immunohistochimica per GFP su sezioni trasversali di un embrione elettroporato a E 11,5 dopo 24 ore di coltura. Le frecce mostrate qui indicano la lamina dorsale che intrappola l'anticorpo secondario.I risultati mostrano che l'area elettroporata del labbro ROIC inferiore era limitata e non si estendeva lungo tutto l'asse anteroposteriore del tubo neurale. Qui vengono mostrati i risultati relativi a due delle proteine analizzate: MASH1 e Math1. Abbiamo osservato che la maggior parte degli embrioni mantiene livelli normali di espressione dopo l'elettroporazione e la coltura, rispetto agli embrioni di controllo a 11,5. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in uno-due ore se eseguita correttamente.Dopo aver visionato questo video, ora dovreste avere una buona comprensione di come utilizzare il saggio di elettroporazione in vitro per manipolare l'espressione genica nei progenitori della membrana embrionale del topo.

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