Name: Oct4GiP Reporter Assay per studiare i geni che regolano il mouse sulle cellule staminali embrionali di manutenzione e di auto-rinnovamento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Scopri l'assay reporter Oct4GiP per studiare la regolazione genica nel mantenimento e nell'auto-rinnovamento delle cellule staminali embrionali di topo. Questo metodo rapido utilizza la citometria a flusso per valutare la funzione genica.

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Ringraziamo Brad Lackford per la lettura e la modifica del manoscritto. Questa ricerca è stata finanziata dal National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health Research Programma intramurale Z01ES102745 (a GH).

1. Oct4GiP mouse cellule ES di manutenzione Cellule Oct4GiP sono stati gentilmente forniti dal Dr. Austin Smith. Essi sono stati ricavati dai topi portatori di una 129/Ola Oct4-GFPiresPac transgene 4,5. Essi sono mantenuti in piastre rivestite con tessuti gelatina coltura nella più completa clonale ESGRO grado medio (Millipore), o nel mezzo M15: DMEM (Invitrogen) supplementato con 15% FBS, 1000 U / ml ESGRO (Millipore), 1x non aminoacidi essenziali (Invitrogen), 1x Nucleasides EmbryoMax (Millipore), e 10 pM β-mercaptoetanolo. <ol><li> Ricoprire piastre con 0,1% di gelatina (Sigma) a temperatura ambiente per 30 minuti (0,1 ml soluzione di gelatina / cm 2). </li><li> Oct4GiP cellule a piastre rivestite di gelatina in piastre a ~ 2 x 10 4 / cm 2. </li><li> Dividere le celle ogni due giorni con tripsina 0,05%. </li></ol> 2. Transfection siRNA in cellule Oct4GiP Il saggio giornalista Oct4GiP è più convenienTLY effettuata in gelatina rivestita con fondo piatto 96 - o 384 pozzetti (Corning o BD) in mezzo M15. La procedura generale è illustrato nella figura 1. <ol><li> siRNA-lipidi complessi assembly: <ol><li> Per la trasfezione in piastre da 96 pozzetti, assemblare siRNA-lipidi complessi a U-bottom piastre a 96 pozzetti. </li><li> In ogni pozzetto, miscelare 10 microlitri OptiMEM (Invitrogen) e 0,3 pl Lipofectamine 2000 (Invitrogen) e incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Aggiungere 5 pmol siRNA al lipide-OptiMEM miscela e incubare per altri 15 minuti. Il siRNA: rapporto di lipidi è 100 pmol: 6UL. </li><li> Trasferire i siRNA-lipidi complessi in OptiMEM dalla U-piastra inferiore alla gelatina-rivestito a fondo piatto piatto con una pipetta multicanale. </li><li> Per la trasfezione in piastre da 384 pozzetti, preparare i siRNA-lipidi complessi che utilizzano 0,1 microlitri Lipofectamine 2000 e del 2 siRNA pmol OptiMEM in 10 microlitri. </li></ol></li></ol> Nota: la concentrazione finale di siRNAle trasfezioni è di 50 nM. Effettuare biologica 3-4 repliche per ogni trasfezione siRNA. Impostare miscele master dei siRNA-lipidi complessi della U-piastra inferiore e aliquota nel fondo piatto rivestito di gelatina piatto. <ol start="2"><li> Oct4GiP placcatura cella e trasfezione: <ol><li> Per la trasfezione in piastre da 96 pozzetti, raccogliere le cellule Oct4GiP e risospendere in mezzo fresco M15 a 9 x 10 4 cellule / ml. </li><li> Aggiungere 100 pl della sospensione cellulare a ciascun pozzetto usando una pipetta multicanale. </li><li> Mescolare la sospensione cellulare con le pre-aliquotati siRNA di lipidi complessi nel bene Pipette su e giù per 3-5 volte. Modificare suggerimenti per trasfezioni diversi siRNA. </li><li> Per la trasfezione in piastre a 384 pozzetti, le cellule Oct4GiP risospendere a 6 x 10 4 cellule / ml e la sospensione cellulare aliquota 30 microlitri in ciascun pozzetto. </li></ol></li></ol> Nota: La densità ottimale placcatura cellulare è di solito 3 x 10 5 cellule / cm 2, ma may richiedono ulteriore ottimizzazione per i siRNA che drammaticamente influenzano la crescita delle cellule o la vitalità. Bassa densità di placcatura porterà alla sopravvivenza delle cellule poveri durante trasfezione. Alta densità di placcatura porterà a sfondo elevato a causa di elevata differenziazione confluenza cellulare indotta. Se necessario, placcatura densità prova tra 2-4 x 10 5 cellule / cm 2. <ol start="3"><li> Cambio medio: <ol><li> Rimuovere vecchio mezzo con multi-canale aspiratore (Corning) o il vuoto bacchetta (VP-scientifico). Fare attenzione a non graffiare le cellule nella parte inferiore delle piastre. </li><li> Alimentare le cellule con mezzo fresco cellule ES (100 microlitri per piastra a 96 pozzetti e 30 microlitri per piastra a 384 pozzetti) usando pipetta multicanale ogni giorno. </li></ol></li></ol> 3. FACS analisi <ol><li> Dissociazione cellulare: <ol><li> Quattro giorni dopo la transfezione, rimuovere media multi-canale con aspiratore (Corning) o il vuoto bacchetta (VP-scientifico). </li><li> Per piastre a 96 pozzetti, lavare una volta con cellule 100μl PBS. </li><li> Aggiungere 25 microlitri tripsina 0,25% ad ogni pozzetto utilizzando una pipetta multicanale. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti con agitazione occasionale, e ispezionare visivamente per garantire il completo distacco delle cellule. </li><li> Aggiungere 90 microlitri di PBS con 10% FBS per inattivare la tripsina e dissociare cellule in una sospensione singola cella pipettando ripetuta. </li><li> Per piastre a 384 pozzetti, dissociare le cellule con 10 microlitri tripsina e quench con 30 pl PBS con 10% FBS. </li></ol></li><li> FACS analisi: <ol><li> Analizzare la fluorescenza GFP sull&#39;analizzatore BD LSRII FACS dotata dell&#39;unità HTS o altro analizzatore analogamente dotato FACS (come Accuri o Intellicyt). </li><li> Utilizzare la modalità high-throughput sul HTS e analizzare 10 microlitri di sospensione cellulare. Impostare la soglia conteggio a 1.0 x 10 4 cellule. </li><li> Regolare la tensione di PMT e la soglia di catturare le cellule nella trama in avanti rispetto al side-scatter. Porta per la popolazione di cellule dal vivo nel DeviazioneARD vs side-scatter plot. </li><li> Creare un grafico a istogramma per il canale GFP. Impostare la porta nel canale GFP in modo che circa il 10% delle cellule risultano GFP-negativi nelle cellule di controllo o finti-siRNA transfettate. </li><li> Determinare sulla GFP-negativi cellule provenienti da ogni trattamento: le cellule differenziate sulla =% GFP-negativi cellule. Confronta le cellule sulla differenziate tra sperimentali-e control-siRNA trasfezioni con due code t-test, e segnare i successi positivi con valori di p &lt;0.01. </li></ol></li></ol> 4. Risultati rappresentativi Oct4, Nanog, Sox2 e sono tre geni che giocano un ruolo critico nel mantenimento delle cellule ES auto-rinnovamento 6,7,9-11. La figura 2 mostra che il saggio giornalista Oct4GiP può facilmente rilevare la differenziazione causato da mettere a tacere questi fattori nel Oct4GiP cellule ES. La figura 2A mostra le cellule staminali embrionali sono Oct4GiP GFP-positive quando mantenuti ES<html> cellule. Figura 2B mostra la dispersione in avanti contro lato e l&#39;istogramma del canale GFP delle cellule Oct4GiP trasfettate con il controllo o Oct4 di siRNA. E &#39;necessario cancello per le cellule vive nel grafico a dispersione in avanti rispetto a lato, come le cellule morte e detriti sono GFP-negativi e aumenterà sfondo. D&#39;altra parte, doppietto discriminazione di escludere possibili grumi di cellule non è sempre necessaria. Nelle controllo siRNA cellule trasfettate, la stragrande maggioranza delle cellule deve essere GFP-positive. Se ovvie GFP-negativi popolazioni sono presenti nei pozzi di controllo siRNA trasfettate, le cellule Oct4GiP di partenza o la procedura di trasfezione può essere stata compromessa e il risultato non può essere interpretabile. La figura 2C mostra il grafico a barre delle cellule sulla differenziate (cellule differenziate sulla =% cellule GFP-negativi) dal controllo-,-Oct4, Nanog-e Sox2-siRNA cellule trasfettate. <html> d/3987/3987fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Schema del saggio giornalista Oct4GiP. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3987/3987fig2.jpg" /> Figura 2. Saggio giornalista Oct4GiP in grado di rilevare la differenziazione delle cellule ES causato da Nanog, Oct4, Sox2 e silenziamento. A) E14Tg2a (wild-type, linea nera) e Oct4GiP (linea verde), le cellule sono stati analizzati mediante FACS. Istogramma della GFP-canale dimostra che le cellule sono Oct4GiP GFP-positivi. B) Oct4GiP cellule sono state trasfettate in piastre da 96 pozzetti con il controllo-o-Oct4 siRNA e FACS analizzati 4 giorni dopo la trasfezione. Forward vs grafici a dispersione laterali e istogrammi della GFP-canale delle cellule trasfettate sono mostrate. C) Oct4GiP cellule sono state trasfettate con il controllo-,-Nanog, Oct4-, o-Sox2 siRNA. Le celle sulla dissociati è stata determinata dalla% GFP-negativo celle 4 giorni dopo la transfezione, ed è stata tracciata come media + / - errore standard della media (n = 4).f = target &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg&quot; = &quot;_blank&quot;&gt; Clicca qui per ingrandire la figura.

<ol><li>Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+differentiation%3A+emergence+of+a+new+era+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine.</a> Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132, 661-680 (2008).</li>
<li>Hu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+a+new+transcriptional+module+required+for+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal.</a> Genes Dev. 23, 837-848 (2009).</li>
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<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Rodda, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+nanog+by+OCT4+and+SOX2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2.</a> J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).</li>
<li>Schaniel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+short+hairpin+RNAs--triggers+of+gene+silencing--into+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).</li>
<li>Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+subpopulations+in+undifferentiated+ES+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture.</a> Development. 135, 909-918 (2008).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Il saggio giornalista Oct4GiP abbiamo descritto sopra può misurare quantitativamente il grado di auto-rinnovamento vs differenziazione. Rispetto ad altri metodi disponibili, come la morfologia a base 12 e la proliferazione / vitalità saggi basati, offre maggiore sensibilità e velocità, nonché una misura più diretta dello stato della cellula ES. E &#39;quindi adatto per i grandi schermi e analisi epistasi genetica. In effetti, noi e altri hanno utilizzato con successo il saggio giornalista Oct4GiP per la genom...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> ESGRO medio grado completa e clonale </td><td> Millipore </td><td> SF001-500P </td></tr><tr><td> DMEM (High glucosio 1X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> 0,25% tripsina-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 1001817 </td></tr><tr><td> OPTI-MEM (riduzione media del siero) </td><td> Invitrogen </td><td> 31985 </td></tr><tr><td> ESGRO MLIF (10 7 units/1ml) </td><td> Millipore </td><td> DAM1776540 </td></tr><tr><td> MEM NEAA (aminoacidi non essenziali) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> Nucleosidi 100x di cellule ES </td><td> Millipore </td><td> 10620-1 </td&gt; </tr><tr><td> 2-mercaptoetanolo </td><td> Sigma </td><td> M7522-100ml </td></tr><tr><td> ES-qualificato siero fetale bovino </td><td> Invitrogen </td><td> 10437 </td></tr><tr><td> Nanog siRNA </td><td> Invitrogen </td><td> MSS231181 </td></tr><tr><td> Oct4 siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> D-046.256-02 </td></tr><tr><td> Sox2 siRNA </td><td> Dharmacon </td><td> M-058.489-01 </td></tr></tbody></table> SiRNA di controllo: duplex siRNA mira lucciola luciferasi (5&#39;-CGTACGCGGAATACTTCGA) sintetizzato Dharamcon.

oct4gip reporter assay per studiare i geni che regolano il mouse sulle cellule staminali embrionali di manutenzione e di auto-rinnovamento

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Pluripotenza e di auto-rinnovamento sono due caratteristiche che definiscono le cellule staminali embrionali (cellule ES). Comprendere il meccanismo molecolare agevolerà notevolmente l&#39;uso di cellule staminali embrionali per gli studi di biologia dello sviluppo, modelli di malattia, scoperta di farmaci, e la medicina rigenerativa (recensione in 1,2). Per velocizzare l&#39;identificazione e la caratterizzazione di nuovi regolatori di manutenzione delle cellule ES e di auto-rinnovamento, abbiamo sviluppato una fluorescenza giornalista-based test per misurare quantitativamente il self-renewal stato in cellule staminali embrionali di topo usando le cellule Oct4GiP 3. Le cellule Oct4GiP esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo della regione del promotore del gene Oct4 4,5. Oct4 è necessaria per cellule ES auto-rinnovamento, ed è altamente espressa nelle cellule ES e rapidamente down-regolato durante la differenziazione 6,7. Come risultato, l&#39;espressione della GFP e fluorescenza nelle cellule del reporter correla fedelmentecon l&#39;identità della cellula ES 5, e fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS) analisi può essere utilizzato per monitorare attentamente la auto-rinnovamento stato delle celle a livello di singola cellula 3,8. Accoppiato con RNAi, il saggio giornalista Oct4GiP può essere utilizzato per identificare rapidamente e studiare regolatori di manutenzione cellule ES e auto-rinnovamento 3,8. Rispetto ad altri metodi per saggiare auto-rinnovamento, è più conveniente, sensibile, quantitativa, e di costo inferiore. Essa può essere effettuata in 96 - o 384 pozzetti per studi su larga scala, quali ad alto rendimento schermi o analisi epistasi genetica. Infine, utilizzando altri lineage-specifici reporter di linee cellulari ES, il saggio qui descritte possono anche essere modificato per studiare il destino specifica durante la differenziazione delle cellule ES.

Descriviamo un saggio di fluorescenza giornalista per identificare rapidamente e caratterizzare i geni che regolano il mouse sulle cellule staminali embrionali di manutenzione e di auto-rinnovamento.

Oct4GiP Reporter Assay per studiare i geni che regolano il mouse sulle cellule staminali embrionali di manutenzione e di auto-rinnovamento

La pluripotenza e l'autorinnovamento sono due caratteristiche distintive delle cellule staminali embrionali (cellule ES). La comprensione dei meccanismi molecolari sottostanti permetterà di...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare rapidamente il ruolo del gene di interesse nel mantenimento dell'auto-rinnovamento delle cellule staminali embrionali murine o cellule ES. Questo viene ottenuto innanzitutto assemblando la miscela maestra di trasfezione che verrà utilizzata per silenziare i geni di interesse. Come secondo passaggio.Il mix maestro di trasfezione viene trasferito in una piastra rivestita di gelatina e vi vengono aggiunte le cellule T 4G IP. Le cellule vengono quindi coltivate in condizioni normali di coltura per cellule ES, consentendo all'effetto del silenziamento genico di manifestarsi. Dopo quattro giorni di coltura, le cellule vengono staccate dalla piastra e il loro stato di auto-rinnovamento viene determinato mediante citometria a flusso. Infine, le differenze nella percentuale di cellule negative per GFP tra le cellule T 4G IP transfettate con siRNA di controllo e quelle sperimentali possono essere valutate mediante analisi.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'analisi della morfologia cellulare o dei marcatori di linea, è che offre una sensibilità e una produttività più elevate e risulta quindi più adatta per schermate genetiche su media o larga scala o per analisi di epistasi genetica. Questo metodo può facilitare notevolmente lo studio del gene importante per il mantenimento e l'auto-rinnovamento dell'ESL. Può inoltre essere adattato agli eventi di auto-specificazione che si verificano durante la differenziazione dell'ESL.Le cellule T 4G IP sono mantenute in piastre rivestite con gelatina. Vengono seminate a una densità di circa due volte 10 alla quarta per centimetro quadrato e passate ogni due o tre giorni per la trasfezione. In piastre da 96 pozzetti con fondo piatto, iniziare codificando la piastra con gelatina allo 0,1%, quindi preparare il mix master di Optum e Lipectomy 2000 e aliquotarlo in una piastra da 96 pozzetti con fondo a U.Incubare la piastra per cinque minuti a temperatura ambiente, quindi aggiungere cinque picomoli di I a alla miscela lipidica in ottimo rapporto e incubare per altri 15 minuti. Successivamente, rimuovere la gelatina dalla piastra a 96 pozzetti con fondo piatto ed utilizzare una pipetta multicanale per trasferire i complessi lipidici di i a in ottimo rapporto dalla piastra a fondo rotondo alle piastre a fondo piatto. Ora raccogliere le cellule OC 4G IP e risospendere in M 15 fresco, fino a raggiungere una concentrazione di nove volte 10 alla quarta cellule per millilitro.Quindi utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 100 microlitri della sospensione cellulare in ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo piatto, aspirando e dispensando da tre a cinque volte per mescolare la sospensione cellulare con i complessi pre-Eloqua Sir a lipidi; sostituire le pun­tte per ogni diverso Sir a lipidi. Successivamente, posizionare le piastre in un incubatore a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica e coltivare le cellule per quattro giorni. Ogni giorno di coltura, utilizzare un aspiratore multicanale per rimuovere il mezzo vecchio, avendo cura di non graffiare le cellule sul fondo delle piastre.Quindi, utilizzare una pipetta multicanale per fornire alle cellule 100 microlitri di mezzo fresco per cellule ES quattro giorni dopo la trasfezione. Rimuovere il mezzo utilizzando un aspiratore multicanale e risciacquare le cellule una volta con 100 microlitri di PBS. Quindi, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 25 microlitri di tripsina al 0,25% a ciascuna.Incubare bene le cellule per cinque minuti a temperatura ambiente con agitazione occasionale. Successivamente ispezionare visivamente la piastra per assicurarsi del completo distacco delle cellule dopo che queste si sono staccate. Aggiungere 90 microlitri di PBS con il 10% di FBS per inattivare la tripsina, quindi pipettare la soluzione cellulare su e giù diverse volte per dissociare le cellule in una sospensione monocellulare.Infine, utilizzare la modalità ad alto rendimento sull'unità HTS di un analizzatore fax per analizzare 10 microlitri della sospensione cellulare. Impostare la soglia di conteggio a 1,0 × 10⁴ cellule e regolare la tensione del PMT per acquisire le cellule nel grafico di dispersione anterograde rispetto a quello laterale. Avviare la finestra di analisi per la popolazione di cellule vitali nel grafico di dispersione anterograde rispetto a quello laterale, quindi creare un istogramma per il canale GFP.Impostare la soglia nel canale GFP in modo che circa il 10% delle cellule risulti negativo per GFP nelle cellule trasfettate con SINA di controllo o mock, per determinare la percentuale di cellule differenziate in base alla percentuale di cellule negative per GFP. Per ogni trattamento, confrontare la percentuale di cellule differenziate tra i campioni sperimentali e i controlli trasfettati con irna.Questa prima figura mostra che le cellule di tipo selvatico E 14 TG two A, rappresentate dall'istogramma nero, sono negative per GFP, mentre le cellule T 4G IP, rappresentate dall'istogramma verde, sono positive per GFP quando mantenute come cellule staminali embrionali. Nelle prossime due figure sono riportati i grafici di scattering anteriore rispetto a quello laterale e gli istogrammi del canale GFP delle cellule T 4G IP quattro giorni dopo il transfezionamento con siRNA di controllo o con siRNA T four. Le cellule vive vengono innanzitutto selezionate nel grafico di scattering anteriore rispetto a quello laterale, poiché le cellule morte e i detriti sono negative per GFP e mostrano un aumento del rumore di fondo, come osservabile nei dati degli istogrammi. Nelle cellule transfezionate con irna di controllo, la stragrande maggioranza delle cellule è positiva per GFP.Questi istogrammi mostrano la percentuale di cellule differenziate ottenute da cellule controllo nano OCT4 e SOX2, transfettate con siRNA, e da cellule OCT4-GFP quattro giorni dopo la transfezione. In tutti i casi, come previsto, le cellule transfettate con siRNA hanno mostrato livelli di differenziamento superiori rispetto ai controlli. Una volta acquisita, questa tecnica richiede circa un'ora di lavoro manuale per ogni piastra a 96 pozzetti.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il saggio con reporter GIP di Oxford per determinare rapidamente il ruolo del tuo gene di interesse nel mantenimento dell'ESL murino.

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Questo video mostra la procedura per la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte con lentivirus inducibile che esprimono Oct4, Sox2, c-Myc e Klf4.

Generare cellule iPS dal MEF attraverso l&#39;espressione forzata di Sox-2, Oct-4, c-Myc e Klf4

Il Stemgent inducibile Dox Mouse Set TF Lentivirus possibile riprogrammare i fibroblasti embrionali di topo (MEF) per pluripotenti indotte staminali (iPS), cellule. Qui mostriamo il protocollo per DOX-inducibile espressione di fattori di trascrizione del mouse riprogrammazione Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc di generare colonie iPS che esprimono i marcatori comune MES pluripotenza.

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da Riprogrammazione fibroblasti embrionali di topo con un fattore quattro trascrizione, Doxiciclina inducibile lentivirali sistema di trasduzione

SC1 funzioni attraverso la doppia inibizione di Ras-GAP e ERK1. Abbiamo testato la funzione di SC1 nel sostenere ES cellule del mouse di auto-rinnovamento, in assenza di LIF e ha dimostrato che SC1 è in grado di mantenere auto-rinnovamento delle colture di cellule ES topo.

L&#39;uso di SC1 (Pluripotin) a supporto Mesc auto-rinnovamento in assenza di LIF

Questo video mostra una tecnica per valutare l'attività dell'acido retinoico negli embrioni di topo. Dopo aver isolato le cellule dagli embrioni di topo, le cellule vengono co-coltivate con cellule reporter di acido retinoico (RA). Le cellule embrionali producono RA, che induce l'espressione della beta-galattosidasi nelle cellule reporter, indicando l'attività dell'AR nelle cellule embrionali.

Impiego di cellule reporter in una co-coltura per studiare la produzione di acido retinoico da parte di cellule embrionali di topo

Singolo gene delle cellule saggio di espressione è necessaria per comprendere eterogeneità di cellule staminali.

Profiling cellule staminali embrionali umane individuale mediante RT-PCR

In questo studio, generiamo cellule staminali pluripotenti indotte da cellule di liquido amniotico di topo, utilizzando un sistema di trasposoni non virale.

La produzione di cellule staminali pluripotenti da mouse amniotico cellule del liquido Utilizzando un sistema di trasposoni

Qui presentiamo un protocollo quantitativo e scalabile per eseguire schermate di piccole molecole mirate per i regolatori di chinasi della transizione pluripotente con primato naïve.

Un metodo semplice per identificare le cinasi che regolano la pluripotenza delle cellule staminali embrionali mediante screening di inibitori ad alta percentuale

Abbiamo descritto in dettaglio due protocolli basati su sostanze chimiche per la coltura di cellule staminali embrionali di topo. Questo nuovo metodo utilizza meccanismi sinergici di promuovere ossidazione Tet-mediata (da vitamina C) e reprimendo la sintesi de novo di 5-metilcitosina (da PD0325901) per mantenere l'ipometilazione del DNA e la pluripotenza delle cellule staminali embrionali di topo.

Un metodo di cultura alternativa per mantenere l'ipometilazione genomica delle cellule staminali embrionali del Mouse utilizzando PD0325901 inibitore MEK e vitamina C

Questo protocollo misura quantitativamente la stabilità e l'emivita degli RNA potenziatori intergenici e intragenici nelle cellule staminali embrionali di topo utilizzando il trattamento con Actinomicina D, RT-qPCR e analisi di regressione non lineare. Strategie di normalizzazione specifiche per posizione sono incorporate per modellare accuratamente la dinamica del decadimento dell'eRNA in modo dipendente dal contesto.

Valutazione Quantitativa Ottimizzata della Stabilità dell'RNA Potenziatore nelle Cellule Staminali Embrionali di Topo

Questo protocollo fornisce una pipeline computazionale semplificata per quantificare le trascrizioni dei potenziatori nascenti. Integrando l'accessibilità della cromatina, le caratteristiche della cromatina e i dati trascrizionali, consente un rilevamento accurato e un'analisi specifica del filamento dell'attività dell'enhancer in regioni intrageniche complesse, pur rimanendo accessibile ai ricercatori senza un'ampia formazione in bioinformatica.

Una pipeline computazionale per la quantificazione dell'RNA dell'enhancer intergenico/intragenico nelle cellule staminali embrionali di topo

Scopri l'assay reporter Oct4GiP per studiare la regolazione genica nel mantenimento e nell'auto-rinnovamento delle cellule staminali embrionali di topo. Questo metodo rapido utilizza la citometria a flusso per valutare la funzione genica.

Oct4GiP Reporter Assay per studiare i geni che regolano il mouse sulle cellule staminali embrionali di manutenzione e di auto-rinnovamento (Video) | JoVE Journal

Oct4GiP Reporter Assay per studiare i geni che regolano il mouse sulle cellule staminali embrionali di manutenzione e di auto-rinnovamento

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