Visualizzazione e analisi del flusso ematico e consumo di ossigeno nella microcircolazione epatica: Applicazione di un modello di epatite acuta

È stato sviluppato un sistema ottico per visualizzare la microcircolazione epatica mediante eritrociti marcati con fluorescenza e per misurare la pressione parziale di ossigeno nei microvasi attraverso l’immagine laser-assistita della fosforescenza. Questo metodo può essere utilizzato per studiare meccanismi fisiologici e patologici analizzando la struttura microvascolare, il diametro, la velocità del flusso ematico e la tensione di ossigeno. Nella microcircolazione epatica, il sangue fluisce dagli ES portali agli ES centrali, creando un gradiente di ossigeno tra i due.

La concentrazione di ossigeno nel fegato influisce sia sull'espressione enzimatica che sulla patologia, rendendo l'analisi del flusso sanguigno e la misurazione dell'ossigeno argomenti importanti della ricerca. Il nostro metodo sperimentale prevede la somministrazione endovenosa di globuli rossi marcati con fluorescenza.

Per visualizzare la microcircolazione utilizzando la fluorescenza per la misurazione della pressione parziale di ossigeno, somministriamo per via endovenosa un porfirina al palladio, che emette fosforescenza nel flusso sanguigno quando eccitata da un laser in misura dipendente dalla concentrazione di ossigeno circostante. Questo processo consente un'analisi quantitativa dell'ossigeno; la misurazione della pressione parziale di ossigeno nella microcircolazione epatica ha mostrato valori di 59,8 e 38,9 millimetri di mercurio a livello portale e centrale, rispettivamente, dimostrando un efficace rilevamento della concentrazione di ossigeno. Successivamente, abbiamo applicato questa metodologia a un modello di epatite.

Abbiamo riscontrato un aumento della pressione parziale di ossigeno nei sinusoidi delle zone portali e nelle zone centrali, ma una riduzione del gradiente pressorio tra le zone portali e quelle centrali. Ciò è probabilmente dovuto a una diminuzione del consumo di ossigeno nella zona venosa centrale a causa della necrosi degli epatociti. Questi risultati dimostrano che la nostra metodologia, che utilizza un sistema ottico per misurare l'emodinamica epatica e il consumo di ossigeno, è in grado di chiarire i meccanismi di varie malattie epatiche nella microcircolazione epatica.

Il gradiente di ossigeno è un parametro essenziale che coinvolge l'espressione di enzimi nelle regioni periportali e paracentrali, nonché tipi di malattie epatiche correlate a distribuzioni microscopiche; pertanto, è importante quantificare il flusso sanguigno e il consumo di ossigeno. Per chiarire i meccanismi, il vantaggio del nostro metodo consiste nella misurazione ottica non invasiva e continua, in grado di quantificare il flusso ematico, i diametri dei vasi sanguigni e il gradiente di ossigeno nella microcircolazione epatica. Il sangue intero è stato prelevato da un topo donatore e i globuli rossi sono stati lavati due volte con PBS mediante centrifugazione a 400 G per cinque minuti.

Successivamente, sciogliere due milligrammi di FITC in un millilitro di fosfato monosodico di sodio desionizzato 100 millimolari, prima di filtrare attraverso una membrana con pori di 0,2 micron. Successivamente, aggiungere un millilitro di soluzione di FITC in un tubo da prova insieme a 0,15 millilitri di soluzione di destrano 3 millimolare, 0,25 millilitri di fosfato monosodico di sodio desionizzato 180 millimolare e 1,5 millilitri di fosfato monosodico di sodio desionizzato 100 millimolare, quindi agitare leggermente per mescolare. Lasciare a temperatura ambiente per due ore prima di lavare due volte i globuli rossi colorati con PBS.

Successivamente, posizionare una piccola quantità di sospensione di globuli rossi su un vetrino e verificare sia l'aspetto normale dei globuli rossi sia una fluorescenza adeguata. Sospendere 0,1 millilitro di globuli rossi in 0,9 millilitri di PBS e mantenere a quattro gradi Celsius fino all'uso. Successivamente, sciogliere 500 milligrammi di BSA in 10 millilitri di PBS. Aggiungere quindi 30 milligrammi di porfirina di palladio e agitare per tutta la notte. Centrifugare la soluzione per rimuovere qualsiasi porfirina di palladio non disciolta e filtrare il sopranatante attraverso una membrana con pori di 0,2 micron. Aliquotare un millilitro di filtrato in provette e conservare a meno 20 gradi Celsius. Prestare attenzione a evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento.

Per visualizzare microscopicamente la microcircolazione, praticare un foro del diametro di 20 millimetri in una piastra di plastica e coprire il foro con un vetrino quadrato di 30 millimetri di lato. Disporre il lobo epatico principale su una piastra di plastica in posizione prona dopo aver cannulato una vena della coda. Successivamente, utilizzare diverse sezioni di pellicola di plastica per alimenti di dimensioni 3 millimetri per 8 millimetri per coprire l'area circostante il lobo, al fine di prevenire movimenti dovuti alla respirazione e l'essiccamento.

Visualizzare la circolazione epatica con un microscopio a trasmissione e confermare l'assenza di stasi del flusso ematico nel campo visivo per almeno 15 minuti. Per osservare il flusso ematico, iniettare gradualmente 0,2 mL di globuli rossi marcati con fluorescenza.

Per misurare la pressione parziale di ossigeno, iniettare 0,2 millilitri di soluzione di porfirina al palladio. I globuli rossi marcati con FITC rappresenteranno un cinquantesimo di tutti i globuli rossi in circolazione nella regione visualizzata; eccitare il FITC irradiandolo con una lampada a mercurio filtrata attraverso un filtro passa-banda da 450 a 490 nanometri e registrare la fluorescenza con una telecamera CCD. La fosforescenza della porfirina al palladio è relativamente debole e richiede un rivelatore ad alta sensibilità e un ambiente buio.

I picchi di assorbimento della porfirina di palladio si trovano intorno a 410 e 532 nanometri, e si raccomanda la lunghezza d'onda armonica secondaria di 532 nanometri. Questa lunghezza d'onda è prodotta da un laser a impulsi neodimio YAG; collegare il fascio laser a un microscopio invertito e regolare in modo che il fascio illumini il centro del piano focale. La risoluzione spaziale del laser dipende dalle dimensioni del punto, che possono essere regolate facendo passare il fascio attraverso un foro stenopeico.

Collegare al microscopio anche un filtro passa-lungo e un tubo fotomoltiplicatore per rilevare la fosforescenza. Il fotomoltiplicatore (PMT) deve essere sensibile alle lunghezze d'onda rosse, in particolare intorno ai 700 nanometri. Campionare il segnale fosforescente e calcolare la costante di tempo di decadimento applicando una funzione esponenziale.

In questo esperimento, abbiamo campionato 500 punti a 200 chilohertz. Per la calibrazione, preparare due soluzioni di porfirina di palladio con una pressione parziale di ossigeno rispettivamente di 150 e zero millimetri di mercurio. Per la soluzione a zero millimetri di mercurio, aggiungere il 1% di diidrossina sodica ai campioni per creare la condizione in cui l'ossigeno è assente durante la calibrazione.

Mantenere un pH del campione di 7,4 e una temperatura di 37 gradi Celsius. Posizionare il topo sul palchetto del microscopio e regolare i microvasi per i quali si desidera visualizzare la microcircolazione epatica in corrispondenza del punto del fascio laser. Dopo aver lasciato ai topi libero accesso all'acqua per tutta la notte, somministrare acetaminofene a 200 milligrammi per chilogrammo per via intraperitoneale. Dopo 24 ore dall'iniezione, anestetizzare il topo ed esporre il fegato mediante un'incisione mediana. In caso di epatite, questa sarà facilmente visibile ad occhio nudo attraverso la necrosi nella regione paracentrale.

La nostra misurazione della pressione parziale di ossigeno e dei microvasi epatici nei topi ha mostrato valori medi di pressione di ossigeno per i setti portali, i senoidi e le vene centrali rispettivamente di 59,8, 48,2 e 38,9 millimetri di mercurio. In altre parole, il gradiente di ossigeno dai setti portali a quelli centrali indica un rilascio sufficiente di ossigeno dai globuli rossi mentre attraversano i senoidi. Abbiamo preparato topi con epatite indotta da acetaminofene per misurare i microvasi epatici.

Come modello di patologia, abbiamo riscontrato che le pressioni parziali di ossigeno nelle vene portali, nei senoidi e nelle vene centrali erano più elevate nel gruppo trattato con acetaminofene rispetto ai topi normali. La differenza di pressione parziale di ossigeno tra le vene portali e quelle centrali era di 20,9 millimetri di mercurio nei topi normali e di 16,9 millimetri di mercurio nei topi con modello di epatite. La differenza di pressione parziale di ossigeno tra le vene portali e quelle centrali era di 20,9 millimetri di mercurio nei topi normali e di 16,9 millimetri di mercurio nei topi con modello di epatite.

Il gradiente di ossigeno nella microcircolazione epatica sorge principalmente dal rifornimento di ossigeno proveniente dalla vena porta che viene consumato dagli epatociti; la necrosi degli epatociti nell'area centrale causata dal paracetamolo determina una riduzione del consumo di ossigeno, alterando la microcircolazione a valle e provocando quindi problemi legati all'emodinamica. L'apporto e il consumo di ossigeno sono coinvolti in molte forme di malattia epatica. Abbiamo realizzato un modello di epatite acuta e osservato un aumento della tensione di ossigeno nei microvasi.

Il nostro sistema ottico può essere utilizzato per studiare meccanismi fisiologici e patologici analizzando la struttura microvascolare, piuttosto che la distribuzione del flusso e il consumo di ossigeno.