Visualizzazione e analisi del flusso ematico e consumo di ossigeno nella microcircolazione epatica: Applicazione di un modello di epatite acuta

È stato sviluppato un sistema ottico per visualizzare la microcircolazione epatica con eritrociti marcati in fluorescenza e per misurare la pressione parziale dell'ossigeno nei microvasi con immagini fosfoscopiche laser assistite. Questo metodo può essere utilizzato per studiare i meccanismi fisiologici e patologici analizzando la struttura microvascolare, il diametro, la velocità del flusso sanguigno e la tensione dell'ossigeno. Nella microcircolazione epatica, il sangue scorre dall'ES portale all'Es centrale, creando un gradiente di ossigeno tra i due.

La concentrazione di ossigeno nel fegato influenza sia l'espressione enzimatica che la patologia, rendendo l'analisi del flusso sanguigno e la misurazione dell'ossigeno. Importanti temi di ricerca. Il nostro metodo sperimentale prevede la somministrazione endovenosa di globuli rossi marcati con fluorescenza.

Al fine di visualizzare la microcircolazione utilizzando la fluorescenza per la misurazione della pressione parziale dell'ossigeno, somministriamo per via endovenosa porfirina di palladio, che emette fosforescente nel flusso sanguigno quando viene eccitato da un laser in una misura dipendente dalla concentrazione di ossigeno circostante. Questo processo consente l'analisi quantitativa dell'ossigeno, la misurazione della pressione parziale, la microcircolazione epatica ha mostrato una pressione parziale dell'ossigeno portale e venale centrale rispettivamente di 59,8 e 38,9 millimetri di mercurio, dimostrando un'efficace misurazione della concentrazione di ossigeno. Successivamente, abbiamo applicato questa metodologia a un modello di epatite.

Abbiamo riscontrato un'elevata pressione parziale dell'ossigeno nell'es portale sinusoidale e centrale, ma un differenziale di pressione diminuito tra l'es portale e quello centrale. Ciò è probabilmente dovuto alla diminuzione del consumo di ossigeno nell'area centrale del Ven a causa della necrosi degli epatociti. Questi risultati mostrano che la nostra metodologia di utilizzo di un sistema ottico per misurare l'emodinamica epatica e il consumo di ossigeno è in grado di chiarire i meccanismi di varie malattie del fegato nella microcircolazione epatica.

Il gradiente di ossigeno è un parametro essenziale che coinvolge l'espressione di enzimi nelle regioni periportale e paracentrale, tipi di malattie epatiche legate alle micro distribuzioni, quindi è importante quantificare il flusso sanguigno e il consumo di ossigeno. Per chiarire i meccanismi, il vantaggio del nostro metodo è che la misurazione ottica continua e senza contatto può quantificare il flusso sanguigno, i diametri dei vasi blastici e il gradiente di ossigeno nella microcircolazione epatica. Il sangue intero è stato prelevato da un topo donatore e gli eritrociti sono stati lavati due volte con PBS mediante centrifugazione a 400 G per cinque minuti.

Quindi, sciogliere due milligrammi di FITC in un millilitro, 100 millimolari di idrogenofosfato di sodio DI prima di filtrare attraverso una membrana porosa da 0,2 micron. Quindi posizionare una soluzione FITC da un millilitro in una provetta insieme a una soluzione abile da tre millimolari da 0,15 millilitri, un idrogenofosfato di sodio DI da 180 millimolari da 0,25 millilitri e un idrogenofosfato di sodio DI da 1,5 millilitri e picchiettare per mescolare. Mantenerlo a temperatura ambiente per due ore prima di lavare due volte i globuli rossi macchiati con PBS.

Quindi, posizionare una piccola quantità di sospensione di globuli rossi su un vetrino e confermare sia l'aspetto normale dei globuli rossi che una fluorescenza sufficiente sospendere 0,1 millilitri di globuli rossi in 0,9 millilitri di PBS e mantenerlo a quattro gradi Celsius fino all'uso successivo, sciogliere 500 milligrammi di BSA in 10 millilitri di PBS. Quindi aggiungere 30 milligrammi di porfirina di palladio e agitare la centrifuga durante la notte, la soluzione per rimuovere qualsiasi porfirina di palladio irrisolta e filtrare la natina SUP attraverso una membrana po eloquente da 0,2 micron, un millilitro di filtrato in provette e conservare a meno 20 gradi Celsius. Fare attenzione a evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti.

Per visualizzare la microcircolazione al microscopio, praticare un foro di 20 millimetri di diametro in una lastra di plastica e coprire il foro con un vetro di copertura quadrato di 30 millimetri di lato. Stendere il lobo epatico principale su una placca di plastica in posizione prona dopo aver incannulato una vena caudale . Quindi, utilizzare più sezioni di pellicola per alimenti di tre millimetri per otto millimetri per coprire l'area circostante il lobo per evitare il movimento della respirazione e dell'essiccazione.

Visualizzare la circolazione epatica con un microscopio a trasmissione e verificare che non vi sia stasi del flusso sanguigno nel campo visivo per almeno 15 minuti. Per osservare il flusso sanguigno iniettare gradualmente. Puntano due millilitri di globuli rossi marcati in fluorescenza.

Per misurare la pressione parziale dell'ossigeno, iniettare 0,2 millilitri di soluzione di porfirina di palladio. I globuli rossi marcati con FITC rappresenteranno un 50° di tutti i globuli rossi in circolazione nella regione visualizzata, ecciteranno il FITC irradiandolo con una lampada al mercurio passata attraverso un filtro passa banda da 450 a 490 nanometri e registreranno la fluorescenza con una telecamera CCD. La fosforescenza della porfirina di palladio è relativamente debole e richiede un rivelatore ad alta sensibilità e una stanza buia.

I picchi di assorbimento della porfirina di palladio sono di circa 410 e 532 nanometri e si consiglia la seconda lunghezza d'onda armonica di 532 nanometri. Questa lunghezza d'onda è prodotta da un laser a impulsi YAG al neodimio che collega il raggio laser a un microscopio invertito e si regola in modo tale che il raggio illumini il centro del piano focale. La risoluzione spaziale del laser dipende dalla dimensione dello spot, che può essere regolata facendo passare il raggio attraverso un foro stenopeico.

Collegare anche un filtro passa-lungo e un tubo fotomoltiplicatore al microscopio per rilevare la fosforescenza. Il PMT dovrebbe essere sensibile alle lunghezze d'onda rosse, in particolare intorno ai 700 nanometri. Campionare il segnale fosforescente e calcolare la costante di tempo di decadimento applicando una funzione esponenziale.

In questo esperimento, abbiamo campionato 500 punti a 200 kilohertz. Per la calibrazione, preparare due soluzioni di porfirina di palladio con una pressione parziale di ossigeno di 150 e zero millimetri di mercurio ciascuna. Per la soluzione di zero millimetri di mercurio, aggiungere l'1% di dihi sodio ai campioni per creare la condizione in cui l'ossigeno è assente durante la calibrazione.

Mantenere un pH del campione di 7,4 e una temperatura di 37 gradi Celsius. Posizionare il mouse sul tavolino del microscopio e regolare i microvasi per i quali si desidera visualizzare la microcircolazione epatica fino al punto del laser topi veloci con libero accesso all'acqua durante la notte, iniettare paracetamolo a 200 milligrammi per chilogrammo intraperitoneale 24 ore dall'iniezione, anestetizzare il topo ed esporre il fegato con un'incisione mediana. Se c'è l'epatite, sarà facilmente visibile ad occhio nudo attraverso la necrosi nella regione paracentrale.

La nostra misurazione della pressione parziale dell'ossigeno e dei microvasi epatici nei topi ha mostrato pressioni medie di ossigeno per portali, suoli sinusali e vene centrali rispettivamente di 59,8, 48,2 e 38,9 millimetri di mercurio. In altre parole, il gradiente di ossigeno dal portale all'ES centrale indica un rilascio sufficiente di ossigeno dai globuli rossi mentre passano attraverso i sinusoidi. Abbiamo preparato topi con epatite indotta da paracetamolo per misurare i microvasi epatici.

Come esempio di modello patologico, abbiamo scoperto che le pressioni parziali dell'ossigeno nelle V portali, nelle E sinusoidali e centrali erano più alte nel gruppo paracetamolo rispetto ai topi normali. La differenza di pressione parziale dell'ossigeno tra le vene portale e centrale era di 20,9 millimetri di mercurio per i topi normali e di 16,9 millimetri di mercurio per i topi modello di epatite. La differenza di pressione parziale dell'ossigeno tra le vene portale e centrale era di 20,9 millimetri di mercurio per i topi normali e di 16,9 millimetri di mercurio per i topi modello di epatite.

Il gradiente di ossigeno nella microcircolazione epatica si verifica principalmente a causa dell'apporto di ossigeno dal ven portale che viene consumato dagli epatociti, la necrosi degli epatociti nell'area venale centrale causata dal paracetamolo provoca una diminuzione del consumo di ossigeno, della microcircolazione a valle e quindi di problemi legati all'emodinamica. L'apporto e il consumo di ossigeno sono coinvolti in molte forme di malattia epatica. Abbiamo realizzato un modello di epatite acuta e abbiamo riscontrato un aumento della tensione dell'ossigeno nei micro vasi.

Il nostro sistema ottico può essere utilizzato per studiare i meccanismi fisiologici e patologici analizzando la struttura microvascolare, piuttosto che la distribuzione del flusso e il consumo di ossigeno.