La α-test: Rapid cell-free CD4 Enumeration Uso Saliva Whole

Esiste un'urgente necessità di un conteggio accessibile dei CD4 per monitorare la malattia da HIV nelle regioni con risorse limitate. Questo video dimostra un test di screening a basso costo da effettuare al punto di cura, in cui i conteggi dei CD4 vengono determinati in base alla presenza dell'inibitore della proteinasi Alfa-1 PI nella saliva. A tal fine, al soggetto o paziente viene inizialmente somministrata una caramella al limone per stimolare l'esudazione del liquido sieroso nella saliva.

La saliva viene raccolta in un contenitore per campioni e trasferita in una piastra saggio a 96 pozzetti. Successivamente, viene aggiunta una quantità saturante della proteinasi elastasi pancreatica porcina, che si lega e inibisce l'alfa uno pi. Poi si aggiunge il substrato colorimetrico per l'elastasi.

Qualsiasi elastasi rimanente non legata scinde il substrato, provocando un cambiamento di colore da limpido a giallo. Viene aggiunta la colorazione blu di Kumasi nei pozzetti per evidenziare le proteine totali ed effettuare misurazioni colorimetriche mediante un lettore di micropiastre. Infine, si determina il rapporto tra alfa-1 PI e proteine totali, che viene utilizzato per valutare con precisione i conteggi CD4 in base a un valore indice.

Questo metodo presenta diversi vantaggi rispetto al metodo esistente, ovvero la citometria a flusso. Il saggio può essere eseguito sul campo senza prelievo di sangue, che è traumatico ed economicamente oneroso, senza l'uso di anticorpi monoclonali, anch'essi costosi, senza necessità di formazione tecnica e senza bisogno di refrigerazione o trasporto dei campioni. Questo metodo supera una barriera critica per l'intervento contro l'AIDS e dovrebbe avere un impatto significativo sui costi, sugli esiti sanitari dei pazienti e sulla frequenza della trasmissione dell'HIV, tutti fattori che influiscono profondamente sull'economia globale.

Questo metodo può fornire informazioni su come l'Alpha e la PI regolano il numero di cellule T CD4 attraverso l'adesione e la migrazione, ma può anche essere applicato ad altri sistemi, ad esempio per studiare come altri inibitori proteici regolano l'adesione e la migrazione cellulare di altri tipi cellulari. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo scoperto che l'Alpha 1 PI era così bassa nei pazienti infetti da HIV da limitare effettivamente il numero di cellule T CD4 che raggiungono il sangue. Iniziare questo protocollo preparando le soluzioni operative necessarie per ciascuna micropiastra che verrà utilizzata.

Preparare 60 millilitri di tris tampone salino 0,05 molare o TBS a un pH di 7,8. Inoltre, per ogni micropiatto, preparare sei millilitri di elastasi pancreatica suina di tipo uno o PPE. Agitare bene la sospensione di PPE, quindi diluirla in TBS fino a una concentrazione di circa 0,01 unità per millilitro.

Successivamente, preparare una soluzione stock di 0,1 molare del substrato colorimetrico SA three NA in DMSO; questa soluzione stock deve essere utilizzata immediatamente o conservata a meno 20 gradi Celsius se verrà utilizzata subito. Preparare sei millilitri di una soluzione di lavoro per ogni micropiastra diluendo la soluzione stock di un fattore 1:100 in TBS. Infine, preparare una soluzione stock al 10% di kumasi brilliant blue R two 50 in TBS e utilizzarla immediatamente o conservarla a meno 20 gradi Celsius se verrà utilizzata subito.

Preparare sei millilitri per ogni micropiastra diluendo il campione in rapporto 1:1000 in TBS. Quando si manipola la saliva, è importante adottare adeguate precauzioni, come indossare guanti e camice da laboratorio, con il soggetto di ricerca o il paziente in posizione eretta. Posizionare un SGO in bocca per stimolare l’esudazione del siero.

Il ruolo del paziente con HIV in questa dimostrazione è svolto da un assistente di ricerca. Una caramella al limone senza zucchero è pratica per i pazienti con HIV, che spesso sono edentuli e non in grado di masticare la gomma, deglutire secondo necessità per i primi tre minuti e raccogliere la saliva orale totale in un contenitore per campioni per i successivi tre minuti. Ciò fornirà circa due millilitri di saliva.

Se la saliva non verrà utilizzata immediatamente, conservarla a meno 80 gradi Celsius nel giorno della lavorazione e scongelare il campione a 37 gradi Celsius. Una volta scongelata, la saliva può essere conservata da due a quattro gradi Celsius per un massimo di tre giorni. Ogni campione e controllo verrà seminato in triplice replicato in una piastra da 96 pozzetti con fondo piatto per impostare il saggio, aggiungendo 130 microlitri di TBS in ciascun pozzetto del campione e dei controlli.

Quindi evitare la mucina, che è viscosa e non contiene essudato sieroso. Trasferire 20 microlitri di saliva in ciascuno di tre pozzetti di test e tre pozzetti di controllo negativo. Aggiungere quindi 20 microlitri di TBS ai pozzetti di controllo positivo, mescolando mediante pipettaggio.

In questa fase, è importante evitare di agitare con il vortice in modo da non formare bolle durante il pipettaggio della saliva e di non pipettare particelle solide e muco. Successivamente, agitare delicatamente la soluzione di lavoro dell'elastasi pancreatica PO o PPE per miscelarla bene, quindi aggiungere 50 microlitri della soluzione ai pozzetti del campione e ai pozzetti di controllo positivo, nonché ai pozzetti di controllo negativo.

Aggiungere 50 microlitri di TBS. Non è necessario mescolare poiché il volume aggiunto è sufficientemente elevato da consentire una distribuzione uniforme nella miscela di saliva. Incubare la piastra per 10 minuti a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione, aggiungere 50 microlitri della soluzione lavorativa del substrato della elastasi SA three NA a ciascun pozzetto. Quindi incubare per ulteriori 45 minuti a 23 gradi Celsius. Trascorsi 45 minuti, aggiungere 50 microlitri della soluzione lavorativa di Kumasi blue a ciascun pozzetto.

Quindi leggere l'assorbanza con un lettore per micropiastre a 405 nanometri per rilevare il taglio di SA tre NA e a 595 nanometri per rilevare il blu di Kumasi, che rappresenta il contenuto totale di proteine. Per calcolare l'indice alfa uno PI, utilizzare innanzitutto la formula seguente per ottenere l'assorbanza normalizzata per ciascuna lunghezza d'onda, dividendo la differenza tra la media del campione e la media del controllo negativo per la differenza tra la media del controllo positivo e la media del controllo negativo. Successivamente, per ottenere l'indice alfa uno PI, dividere l'assorbanza normalizzata a 405 nanometri per l'assorbanza normalizzata a 595 nanometri, come mostrato qui, al fine di determinare se il test alfa possa essere adatto all'uso come test di screening rapido per il monitoraggio dei conteggi CD quattro in regioni endemiche con risorse limitate.

La saliva stimolata è stata raccolta da 20 soggetti di sesso femminile e 11 di sesso maschile sieropositivi per l'HIV-1 in visita ambulatoriale per cure di routine nel Camerun. In linea con osservazioni preliminari effettuate durante lo sviluppo del test alfa mediante saliva raccolta a New York City, l'indice alfa uno PI e la saliva raccolta nel Camerun hanno mostrato una correlazione con i conteggi di CD4 con un valore di R quadro pari a 0,91 e un valore di P inferiore a 0,0001. La relazione è stata definita da una curva sigmoidea a tre parametri, coerente con una relazione dose-risposta. Gli intervalli di confidenza e di previsione al 95% sono rappresentati rispettivamente con linee blu e rosse.

In uno studio precedente, abbiamo determinato che le cellule T CD4 positive mostrano un'oscillazione sinusoidale con un periodo di 23 ± 3,5 giorni nei soggetti con HIV-1 e nei soggetti con la forma ereditaria di deficit di alfa-1 PI, PIZZ. Qui viene mostrato un esempio rappresentativo dell'analisi computerizzata della curva sinusoidale del ciclo del CD4 in un controllo sano non affetto da HIV, che presenta un'oscillazione con periodo di 27 giorni. L'analisi computerizzata della curva sinusoidale delle variazioni delle cellule T CD4 positive in sei soggetti ha fornito valori relativi all'ampiezza picco-picco e all'asse di oscillazione, come previsto. L'asse di oscillazione era correlato con l'ampiezza, con un valore R² di 0,96 e un valore p di 0,009.

In pazienti con bassi livelli di conteggio di linfociti T CD4 positivi, le variazioni cicliche del conteggio dei linfociti T CD4 erano ridotte, mentre in pazienti con elevati livelli di conteggio di linfociti T CD4 positivi le variazioni cicliche erano ampie, poiché la retta di regressione rappresentata qui stima l'asse di oscillazione e l'asse di oscillazione è correlato all'ampiezza. L'ampiezza può essere calcolata sulla retta di regressione per stimare quanto al di sopra e al di sotto della retta di regressione ci si aspetterebbe che i linfociti T CD4 positivi variassero a causa del ciclo. Sovrapponendo l'ampiezza calcolata e l'intervallo di confidenza, si è osservato che l'ampiezza indicata dalla linea verde si trova all'interno dell'intervallo di confidenza al 95% indicato dalla linea blu.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 90 minuti, dal prelievo della saliva all'ottenimento del valore del conteggio delle cellule CD4 per il paziente. Questa procedura è destinata a essere utilizzata come test di screening per monitorare i conteggi di CD4. Se un paziente mostra cambiamenti significativi nei conteggi di CD4, allora lo stesso dovrebbe essere sottoposto a un follow-up mediante citometria a flusso per verificare la validità delle misurazioni dei conteggi di CD4 e per supportare le decisioni terapeutiche.

Nella fase successiva dello sviluppo, il saggio in micropiastre verrà trasformato in una tecnologia a striscette reattive, che permetterà di eseguire i test senza l'uso di strumenti o corrente elettrica. È poco probabile che l'HIV venga trasmesso attraverso la saliva, ma i pazienti affetti da HIV spesso presentano altre malattie infettive come la tubercolosi e l'epatite C; pertanto, bisogna ricordare che lavorare con la saliva, così come con il sangue, può essere estremamente pericoloso a causa della possibile presenza di agenti infettivi sconosciuti. È sempre necessario adottare precauzioni, come indossare guanti e altri dispositivi di protezione individuale durante l'esecuzione di questa procedura.