Name: Rilevamento di RNA virale per fluorescenza In situ Hybridization (FISH) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Scopri il metodo FISH per visualizzare l'RNA virale nelle cellule infette mediante microscopia a fluorescenza. Questa tecnica consente di studiare la localizzazione intracellulare e il traffico del genoma virale in vivo.

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Gli autori ringraziano i membri passati e presenti del laboratorio per i contributi allo sviluppo della metodologia qui delineato e Alan Cochrane per un consiglio. LA è destinatario di un Canadian Institutes of Health Research (CIHR) dottorato e AJM è supportato da un premio alla carriera Fraser, Monat e MacPherson. Questo lavoro è supportato da un finanziamento della CIHR (sovvenzione # MOP-56974).

1. Preparazione della sonda <ol><li> Digest 1 ug del vettore in trascrizione in vitro, pKS (+) pol 236nt 9 con Kpn1 enzima a 37 ° C per 1 ora ed eseguire il prodotto linearizzato DNA su un gel di agarosio. Il frammento dovrebbe essere di circa 2500 bp. </li><li> Tagliare il frammento dal gel e purificare mediante la Roche Eluire Micro Gel Extraction Kit (tutti i reagenti usati sono elencati nella Tabella 1). Eseguire l&#39;eluizione finale in 30 microlitri tampone di eluizione. Esegui 5 pl del prodotto su un gel di agarosio per verificare la purificazione. </li><li> Mescolare in uno reazione di trascrizione in vitro (vedi ricetta sotto) usando la Roche DIG RNA etichettatura kit e incubare a 37 ° C per 2 ore. </li></ol> In reazione di trascrizione in vitro: <table border="1"><tbody><tr><td> Linearizzato DNA </td><td> 23 microlitri </td></tr><tr><td> 1X DIG RNA etichettatura mix (Roche) </td><td> 4 microlitri </td></tr><tr><td> Tra 1Xnscription tampone </td><td> 8 microlitri </td></tr><tr><td> 20U RNasi OUT </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> 80U T7 RNA polimerasi </td><td> 4 microlitri </td></tr><tr><td> Totale </td><td> 40 microlitri </td></tr></tbody></table><ol start="4"><li> Aggiungere 228 U di DNasi I e incubare a 37 ° C per 15 min. </li><li> Arrestare la reazione aggiungendo EDTA pH 8,0 ad una concentrazione finale di 20 mM. </li><li> Purificare la reazione utilizzando le colonne semplice Spin Roche come specificato dal costruttore. </li><li> Purificare la sonda per precipitazione con 1/10 del volume trattata con DEPC NaOAc 3M pH 5.2 e 2.5 volumi di ghiacciata etanolo al 95%. Mescolare e incubare a -80 ° C per 30 minuti per una notte. </li><li> Centrifugare la sonda per 15 min a 4 ° C a 15.000 x g. </li><li> Rimuovere il surnatante e lavare il pellet in ghiacciato etanolo al 70%. Centrifugare ancora per 5 minuti a 4 ° C a 15.000 x g. </li><li> Rimuovere il supernatante e asciugare il pellet. Risospendere il pellet in 50 microlitri water (DNase / RNase free) contenente 10 U Invitrogen RNasi OUT. </li><li> Stimare la concentrazione di sonda mediante spettrofotometria (RNA misura a 260 nm), e portare a una concentrazione di ng / pl 5. Conservare in aliquote a -20 ° C per uso a breve termine, o -80 ° C per la conservazione a lungo termine. Si raccomanda di eseguire confronti tra l&#39;analisi in modo da conservare una aliquota per questo. </li></ol> 2. Cella Fixation <ol><li> Inizialmente è importante per le cellule di sementi non trattate, aderenti su vetrini sterili in modo che la confluenza finale sulla raccolta è di circa 70-80%. Per le cellule non aderenti, crescere come normale e quando è pronto a raccogliere, loro incubare con vetrini coprioggetto che sono stati trattati con 0,01% w / v poli-L-lisina (Sigma-Aldrich, Inc.) per 1 ora. Per un tipico 12-pozzetti coltura tissutale polistirene (3,8 cm 2), 150.000 cellule HeLa (ad esempio) vengono piastrate a 24 ore prima della trasfezione. Cellule non aderenti possono essere infettate o transfettate come di consueto e lasciata adqui per scivola in vetro di copertura prima di fissaggio 3. </li><li> Eliminare il supporto e lavare le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato 1X preparato in acqua bidistillata (DPBS) per 1 min. Dietilpirocarbonato (DEPC, Sigma-Aldrich, Inc.)-trattati 1X PBS possono anche essere utilizzati, ma non trattata PBS non può in quanto può contenere enzimi RNasi. </li><li> Eliminare il PBS e aggiungere paraformaldeide al 4%, sufficiente a coprire le cellule completamente. Incubare per 15-20 minuti. </li><li> Eliminare il paraformaldeyhyde e lavare le cellule con 1X DPBS per 1 min. </li><li> Eliminare le DPBS e aggiungere 0,1 M glicina (sciolto in DPBS 1X). Incubare per 10 min. </li><li> Eliminare la glicina e lavare le cellule con 1X DPBS per 1 min. </li><li> Eliminare le DPBS e aggiungere 0,2% Triton-X (sciolto in DPBS 1X). Incubare per 5-10 min. Se colorazione per proteine ​​dell&#39;involucro nucleolari o nucleare, permeabile con Triton X-100 per non più di 5 minuti o la localizzazione proteina sarà diffusa. </li><li> Scartare Triton X-100 e lavare una volta in1X DPBS per 1 min. </li><li> Per la conservazione a lungo termine, sostituire PBS con il 70% di etanolo e conservare a 4 ° C per un massimo di quattro mesi. In alternativa, lavare una volta di più con 1X DPBS e procedere alla FISH. </li></ol> 3. Ibridazione fluorescente in situ (FISH) <ol><li> Se i coprioggetti sono stati memorizzati in etanolo, sostituire l&#39;etanolo con 1X DPBS e consentire alle cellule reidratare per 30 min. Reidratazione può essere fatta durante la notte se i coprioggetti sono conservati a 4 ° C. </li><li> Lavare i coprioggetti con 1x DPBS per 1 min. </li><li> Preparare i vetrini per incubare i coprioggetti, avendo cura di pulire ed etichettare bene. </li><li> Per un vetrino 18mm, aggiungere 50 ml di soluzione DNasi (25 unità / coprioggetti, disponibili in commercio) alla diapositiva. Aggiungere il coprioggetti, facendo attenzione a posizionarlo lato della cella verso il basso, ed incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i coprioggetti con 1x DPBS per 1 min. </li><li> Aggiungere 50 microlitri mix di ibridazione (vedi ricetta di seguito) per coprioggetto suuna diapositiva e incubare lato cella coprioggetto basso per 16-18 ore a 42 ° C. L&#39;incubazione dovrebbero essere eseguite in un vassoio contenente un 50% formammide, 2X SSPE miscela (12,5 ml formammide deionizzata, 2,5 ml 20X SSPE, 10 ml di acqua). </li></ol> Ibridazione Mix (per un vetrino, 50 pl): <table border="1"><tbody><tr><td> Quantità di magazzino </td><td> Materiale (a concentrazione finale) </td></tr><tr><td> 25 pl </td><td> Formammide, 50% (deionizzata; qualsiasi fonte) </td></tr><tr><td> 5 microlitri (di 10 mg / ml) </td><td> tRNA, 1 mg / ml (Sigma-Aldrich, Inc) </td></tr><tr><td> 5 microlitri (di 20X) </td><td> SSPE, 2X </td></tr><tr><td> 5 microlitri (di 50X) </td><td> Denharts, 5X </td></tr><tr><td> 0,125 pl (di 5 unità) </td><td> RNasi OUT </td></tr><tr><td> 5 microlitri (25 ng di 5 ng / pl) </td><td> Sonda </td></tr><tr><td> 5 pl </td><td> H 2 O DEPC, per rendere il finalevolume di 50 pl </td></tr></tbody></table><ol start="7"><li> Incubare coprioggetti lato della cella verso il basso in 50 microlitri formammide 50% (diluito in DPBS 1X) per 15 min a 42 ° C. </li><li> Lavare i coprioggetti due volte in 2X SSPE incubando loro lato della cella verso il basso in 50 microlitri 2X SSPE (20X SSPE diluito in DPBS 1X) per 5 minuti ciascuna a 42 ° C. </li><li> Lavare i coprioggetti in 1X DPBS per 1 min. </li></ol> 4. Immunofluorescenza <ol><li> Bloccare i coprioggetti mettendoli lato della cella verso il basso in 50 microlitri soluzione 1X blocco Roche (Roche 10X soluzione diluita in blocco 1X DPBS) per 30 min. </li><li> Incubare lato coprioggetti cella verso il basso in 50 ul di soluzione anticorpo primario per 1 ora a 37 ° C. Anti-DIG anticorpo deve essere diluito in base alla direzione del produttore in 1X soluzione bloccante. Se gli anticorpi altri vengono utilizzati per colorare le proteine, possono essere aggiunte alla concentrazione corretta condizione che tutti gli anticorpi utilizzati sono derivati ​​da spec host differentiIES. </li><li> Lavare i coprioggetti per 10 min in 1X DPBS. </li><li> Incubare il lato coprioggetto cella verso il basso in 50 ul di soluzione anticorpo secondario per 1 ora a 37 ° C. Alexa anticorpi coniugati (Invitrogen) può essere utilizzato per generare una gamma di colori e vengono utilizzati a 1:500 in 1X soluzione bloccante e DPBS 1X. </li><li> Lavare i coprioggetti due volte per 10 minuti in ciascuna DPBS 1X. </li><li> Asciugare il lato della cella coprioggetto su carta Whatman. Assicurarsi di coprire i coprioggetti per evitare l&#39;esposizione alla luce e sbiancamento. </li><li> Una volta che tutto il liquido è evaporato, montare i coprioggetti su vetrini fresche con 8 ImmunoMount microlitri (Thermo Scientific, Inc.). Battere delicatamente lungo il vetrino per eliminare eventuali bolle d&#39;aria. </li><li> Applicare lo smalto ai bordi del coprioggetto per fissarlo in posizione. </li><li> La visualizzazione di RNA e proteine ​​mediante tecniche di microscopia è anche critica per il successo di questa tecnica. Impostazioni sul microscopio utilizzato può aiutare o ostacolare la visualizzazione è quindi fondamentale che ilimpostazioni del microscopio essere impostato correttamente ed essere coerenti da un campione all&#39;altro in un dato esperimento. Per le impostazioni dettagliate microscopia, ottica e combinazioni di anticorpi vedere riferimenti 1,10. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Un esempio di RNA virale colorazione può essere visto in Figura 2. Le RNA virale per HIV-1 è visto in tutto il citoplasma visualizzata diffusamente per la maggior parte, anche se piccola punctae citoplasmatica non sono infrequenti. La specificità può essere visto confrontando cellule positive per cellule circostanti che non esibiscono fluorescenza. Come accennato nell&#39;introduzione, HIV-1 che manca la proteina regolatrice Rev produce RNA che è trattenuta nel nucleo: Questo può essere visualizzato come un segnale luminoso nel nucleo, e una mancanza di segnale RNA fluorescenza nel citoplasma. La sovraespressione di proteine ​​cellulari è anche capace di spostare la distribuzione dei HIV-1 RNA virale. In figura 2 </strong&gt;, l&#39;iperespressione delle proteine ​​coinvolte nel traffico vescicolare endosomal (ad esempio, Rab7-interazione proteina lisosomiale (RILP) 11 o N-terminale cancellato RILP (RILPN) 11, e le proteine ​​che interferiscono con la funzione dineina motore [es p50/dynamitin 1, 12], interferire con il normale regime di localizzazione degli RNA genomici virali come determinato dalle analisi FISH espressione RILP porta alla ri-localizzazione delle RNA genomico virale al microtubulo organizzazione centrale (MTOC) 13;. RILPN disperde endosomi all&#39;interno del citoplasma a causa della incapacità di legarsi a p150 incollata del motore dineina complesso 14 e blocca p50/dynamitin la subunità grande della dineina motore e rilasci endosomi ritardo, ma anche l&#39;RNA genomico virale di HIV-1 e proteine ​​strutturali alla periferia cella 1 (figura 2). La manipolazione della steady-state localizzazione degli RNA genomico virale, un elemento chiave per l&#39;infettività delparticelle virali, sarebbe la chiave per l&#39;eventuale sviluppo di terapie. Nelle nostre mani, di RNA virale viene visualizzato nella cella già 3 ore dopo la trasfezione ed infezione 10 e diventa facilmente osservabile da questa tecnica FISH di 12 ore. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig1.jpg" /> Figura 1. Diagramma di flusso del protocollo per la FISH / se la co-analisi. Le cellule sono coltivate su vetrini coprioggetto e poi fissate con paraformaldeide. Trattamenti di glicina e Triton-X vengono eseguite prima che le cellule vengono utilizzate sia per la FISH / IF o memorizzato in etanolo 70% per lo stoccaggio. Le cellule disidratate per lo stoccaggio vengono reidratati in 1X DPBS (trattata con DEPC PBS) prima di proseguire per FISH / IF. Le cellule vengono trattate con DNasi I e lasciata per una notte per ibridarsi con sonda. Dopo ibridazione è completa, le cellule vengono lavate con formammide, nonché con SSPE, e un risciacquo finale 1X DPBS. Soluzione bloccante è applicata alle celle, seguita da incubazione congli anticorpi primari. Dopo il lavaggio, gli anticorpi secondari sono applicati. Due lavaggi finali in 1X DPBS completare la procedura di colorazione, dove al momento i coprioggetti vengono essiccati e montati su vetrini per l&#39;imaging. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig2.jpg" /> Figura 2. Risultati rappresentativi utilizzando FISH / IF co-analisi. A) HIV-1 viene transfettato in cellule HeLa e in alcuni casi con costrutti che causano la sovraespressione di proteine ​​cellulari (RILP, p50/Dynamitin e RILPΔN (uno ammino-terminale mutante di delezione)) . PESCE / IF co-analisi è stata effettuata: RNA è identificato in verde con uno o G3BP LAMPADA1 (rosso) per differenziare. B) HIV-1 è espresso in cellule HeLa e raccolti in punti temporali diversi. Espressione di RNA virale viene tracciato in verde, mentre la proteina cellulare, hnRNP A1, viene colorato in rosso. Dimensione barre sono 10 micron. Immagini modificate dai riferimenti 1 (dati selezionare dal pannello di A; RILP, p50/Dynamitin e RILP deltaN)e 17 (pannello B).

<ol><li>Lehmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+transport+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+genomic+RNA+and+viral+production+are+dependent+on+dynein+motor+function+and+late+endosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Intracellular transport of human immunodeficiency virus type 1 genomic RNA and viral production are dependent on dynein motor function and late endosome positioning.</a> J. Biol. Chem. 284, 14572-14585 (2009).</li>
<li>Zurla, C., Lifland, A. W., Santangelo, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+mRNA+interactions+with+RNA+granules+during+translation+initiation+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterizing mRNA interactions with RNA granules during translation initiation inhibition.</a> PLoS One. 6, e19727(2011).</li>
<li>Abrahamyan, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Staufen1+ribonucleoproteins+prevent+formation+of+stress+granules+but+favour+encapsidation+of+HIV-1+genomic+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Novel Staufen1 ribonucleoproteins prevent formation of stress granules but favour encapsidation of HIV-1 genomic RNA.</a> J. Cell Sci. 123, 369-383 (2010).</li>
<li>Milev, M. P., Brown, C. M., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+visualization+of+the+interactions+between+HIV-1+Gag+and+the+cellular+RNA-binding+protein+Staufen1%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Live cell visualization of the interactions between HIV-1 Gag and the cellular RNA-binding protein Staufen1.</a> Retrovirology. 7, 41-41 (2010).</li>
<li>Vercruysse, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cooperative+Rev+protein-protein+interactions+on+Rev+responsive+RNA+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring cooperative Rev protein-protein interactions on Rev responsive RNA by fluorescence resonance energy transfer.</a> RNA Biol. 8, 316-324 (2011).</li>
<li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+mRNA+export%3A+insights+from+virology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Nuclear mRNA export: insights from virology.</a> Trends Biochem. Sci. 28, 419-424 (2003).</li>
<li>Cmarko, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev+inhibition+strongly+affects+intracellular+distribution+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Rev inhibition strongly affects intracellular distribution of human immunodeficiency virus type 1 RNAs.</a> J Virol. 76, 10473-10484 (2002).</li>
<li>Ajamian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+roles+for+UPF1+in+HIV-1+RNA+metabolism+and+translation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Unexpected roles for UPF1 in HIV-1 RNA metabolism and translation.</a> RNA. 14, 914-927 (2008).</li>
<li>Beriault, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+late+role+for+the+association+of+hnRNP+A2+with+the+HIV-1+hnRNP+A2+response+elements+in+genomic+RNA%2C+Gag%2C+and+Vpr+localization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A late role for the association of hnRNP A2 with the HIV-1 hnRNP A2 response elements in genomic RNA, Gag, and Vpr localization.</a> J. Biol. Chem. 279, 44141-44153 (2004).</li>
<li>Monette, A., Pante, N., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+remodels+the+nuclear+pore+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 remodels the nuclear pore complex.</a> J. Cell Biol. 193, 619-631 (2011).</li>
<li>Jordens, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rab7+effector+protein+RILP+controls+lysosomal+transport+by+inducing+the+recruitment+of+dynein-dynactin+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Rab7 effector protein RILP controls lysosomal transport by inducing the recruitment of dynein-dynactin motors.</a> Curr. Biol. 11, 1680-1685 (2001).</li>
<li>Schrader, M., King, S. J., Stroh, T. A., Schroer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+imaging+reveals+a+peroxisomal+reticulum+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Real time imaging reveals a peroxisomal reticulum in living cells.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt. 20), 3663-3671 (2000).</li>
<li>Levesque, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+HIV-1+RNA+is+mediated+by+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+A2+expression+and+impacts+on+viral+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Trafficking of HIV-1 RNA is mediated by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2 expression and impacts on viral assembly.</a> Traffic. 7, 1177-1193 (2006).</li>
<li>Rocha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+sensor+ORP1L+contacts+the+ER+protein+VAP+to+control+Rab7-RILP-p150+Glued+and+late+endosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cholesterol sensor ORP1L contacts the ER protein VAP to control Rab7-RILP-p150 Glued and late endosome positioning.</a> J. Cell Biol. 185, 1209-1225 (2009).</li>
<li>Soros, V. B., Carvajal, H. V., Richard, S., Cochrane, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+Rev+function+by+a+dominant-negative+mutant+of+Sam68+through+sequestration+of+unspliced+RNA+at+perinuclear+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 Rev function by a dominant-negative mutant of Sam68 through sequestration of unspliced RNA at perinuclear bundles.</a> J. Virol. 75, 8203-8215 (2001).</li>
<li>Sanchez-Velar, N., Udofia, E. B., Yu, Z., Zapp, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hRIP%2C+a+cellular+cofactor+for+Rev+function%2C+promotes+release+of+HIV+RNAs+from+the+perinuclear+region%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">hRIP, a cellular cofactor for Rev function, promotes release of HIV RNAs from the perinuclear region.</a> Genes Dev. 18, 23-34 (2004).</li>
<li>Monette, A., Ajamian, L., Lopez-Lastra, M., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29+induces+the+cytoplasmic+retention+of+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+A1+by+disrupting+nuclear+import%3A+implications+for+HIV-1+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) induces the cytoplasmic retention of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 by disrupting nuclear import: implications for HIV-1 gene expression.</a> J. Biol. Chem. 284, 31350-31362 (2009).</li>
<li>Malim, M. H., Hauber, J., Le, S. Y., Maizel, J. V., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+rev+trans-activator+acts+through+a+structured+target+sequence+to+activate+nuclear+export+of+unspliced+viral+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 rev trans-activator acts through a structured target sequence to activate nuclear export of unspliced viral mRNA.</a> Nature. 338, 254-257 (1989).</li>
<li>Klein, K. C., Reed, J. C., Lingappa, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+destinies%3A+degradation%2C+targeting%2C+assembly%2C+and+endocytosis+of+HIV+Gag%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Rev%22%5BJournal%5D)">Intracellular destinies: degradation, targeting, assembly, and endocytosis of HIV Gag.</a> AIDS Rev. 9, 150-161 (2007).</li>
<li>Molle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+trafficking+of+HIV-1+gag+and+genomic+RNAs+regulates+viral+egress%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Endosomal trafficking of HIV-1 gag and genomic RNAs regulates viral egress.</a> J. Biol. Chem. 284, 19727-19743 (2009).</li>
<li>Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+biogenesis+of+individual+HIV-1+virions+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells.</a> Nature. 454, 236-240 (2008).</li>
<li>Kemler, I., Meehan, A., Poeschla, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+coimaging+of+the+genomic+RNAs+and+Gag+proteins+of+two+lentiviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Live-cell coimaging of the genomic RNAs and Gag proteins of two lentiviruses.</a> J. Virol. 84, 6352-6366 (2010).</li>
<li>Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333, 642-646 (2011).</li>
<li>Eckhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SNAP-tagged+derivative+of+HIV-1--a+versatile+tool+to+study+virus-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A SNAP-tagged derivative of HIV-1--a versatile tool to study virus-cell interactions.</a> PLoS One. 6, e22007(2011).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

PESCE / IF co-analisi è un metodo affidabile per visualizzare l&#39;RNA virale nelle cellule che ora è stato perfezionato 9,15,16. Nel corso di diversi anni, abbiamo sviluppato un metodo raffinato di colorazione per l&#39;RNA. Questa tecnica può essere usata su una vasta gamma di tipi cellulari purché la sonda è specifico per la RNA bersaglio 17. Per l&#39;etichettatura la sonda con DIG, siamo in grado di visualizzare i RNA mediante colorazione semplice. Quando colorazione per l&#39;RNA e altre proteine ​​si combinano, FISH / se la co-analisi diventare un potente strumento per osservare le strutture cellulari e le proteine ​​/ RNA di localizzazione. La specificità della rivelazione RNA è piuttosto elevato. Questo è illustrato nella figura 2. In una parte del lavoro originale che si è concentrato sulla localizzazione genomico virale RNA, FISH stabilito che la mancanza di Rev intrappolato RNA virale nel nucleo 18. Dal momento che questo, abbondante nuove informazioni sulla localizzazione virale RNA genomico è stato ottenuto utilizzando il technique qui delineato. Con overesprimenti proteine ​​cellulari, specifiche e le popolazioni non tutti, gli RNA virali possono essere costretti a localizzarsi a differenti regioni della cella. Sovraespressione RILP, che ricorda il fenotipo ottenuto quando hnRNP A2 è esaurito da siRNA in HIV-1-cellule che esprimono 13, fa sì che il RNA di accumulare visibilmente al MTOC. Le RNA genomici virali possono essere spinti alla periferia cellulare disabilitando il minus-end proteina motore, dineina: sovraespressione p50/Dynamitin o knockdown delle pesanti catene dineina 1 risultati nel rilascio di RNA genomici virali provenienti da domini intracellulari alla periferia cellulare ( Figura 2). Un mutante di RILP, RILPΔN, che non lega più il motore dineina, si disperde endosomi (contrassegnati da LAMPADA1) nel citoplasma perché non sono più attivo localizzato a domini juxtanuclear. Questi risultati indicano l&#39;idea di una popolazione di plastica di HIV-1 RNA genomici e in particolare, che diversi gruppi di HIV-1 genomicaRNA presenti con ruoli a volte identificabili nel ciclo di replicazione virale. Queste nozioni stesse sono già stati individuati per la proteina codificata da questo mRNA, Gag 19. Ci sono limitazioni agli usi di FISH / se la co-analisi che sono legati alla scelta degli anticorpi e la disponibilità. L&#39;ottimizzazione della migliore combinazione di anticorpi primari e secondari, e le loro concentrazioni, ci vorrà del tempo per ottimizzare (vedi Tabella 1 e 2). Anticorpi a base di ibridomi o prodotte da grandi aziende possono avere concentrazioni che variano ovunque da 1:2 a 1:2000, ma essere sicuri di seguire le linee guida fornite dal produttore per i migliori risultati. L&#39;host in cui si produce l&#39;anticorpo deve essere presa in considerazione. Pecore di miscelazione con anticorpi di capra dovrebbe anche essere evitato in anticorpi primari e secondari, come questo si traduce in combinazione fondo elevato a causa di cross-riconoscimento della specie (dati non riportati). Per Alexa-Fluor Secondaanticorpi Ry, la concentrazione può essere utilizzato a 1:500 per quasi tutte anticorpo nel set. Lo svantaggio a pescare / IF co-analisi, come descritto nella presente relazione è cattura le RNA nella sua posizione allo stato stazionario, dopo che le cellule sono state fissate e permeabilizzate con paraformaldeide e detergente (Figura 1). Tuttavia, RNA di imaging in cellule vive è stato ottenuto attraverso una varietà di mezzi 20-22, principalmente utilizzando varianti di genomi virali RNA che sono contrassegnati da proteine ​​fluorescenti come la GFP. Tuttavia, ulteriori mezzi per identificare la localizzazione di RNA in cellule vive continuano ad emergere. Questi nuovi metodi coinvolgere i tag RNA per mezzo di Spinaci 23, 24, o SNAP MTRIP 2. Queste tecniche soffrono anche di alcuni inconvenienti tra cui il requisito di permeabile cellule prima di aggiungere substrati o una porzione che deve essere progettato per codificare l&#39;mRNA per rilevare l&#39;mRNA da microscopia. Infatti, la maggiore ADVAntage di analisi FISH descritte nella presente relazione risiede nel fatto che l&#39;RNA nativo è inalterata porta ai risultati più fisiologicamente rilevanti.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Coprioggetti 18mm </td><td> VWR </td><td> 48380 046 </td><td></td></tr><tr><td> 16% paraformaldeide </td><td> JT Baker </td><td> S898-07 </td><td> Per fare 4%: sciogliere 20g in 1XDPBS 500ml a 60 ° C con 5 gocce di NaOH. pH a 7,2 dal fuoco e conservare a -20 ° C. Non superare i 70 ° C! </td></tr><tr><td> Triton-X </td><td> OmniPur </td><td> 9400 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Eluire Gel Extraction Kit </td><td> Roche </td><td> D6294-02 </td><td></td></tr><tr><td> DIG RNA Etichettatura Mix </td><td> Roche </td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> T7 polimerasi trascrizione di RNA </td><td> Invitrogen </td><td> 18033-019 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Colonne Spin veloci </td><td> Roche </td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> DNasi I </td><td> Invitrogen </td><td> 18047-019 </td><td></td></tr><tr><td> 1X DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Formammide </td><td> EMD </td><td> FX0420-8 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-021 </td><td></td></tr><tr><td> RNasi OUT </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescent Antibody Enhancer impostate per il rilevamento DIG # 4 (soluzione bloccante) </td><td> Roche </td><td> 1768506 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor anticorpi secondari </td><td> Invitrogen </td><td> Vedere la Tabella 2 </td><td></td></tr><tr><td> Ibridazione Forno </td><td> Boekel Sciscientifica </td><td> Modello 24100 </td><td></td></tr><tr><td> Microslides </td><td> VWR </td><td> 48300-047 </td><td></td></tr><tr><td> Immunomount </td><td> Thermoscientific </td><td> 9990402 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. Identificazione di reagenti e attrezzature specifiche <table border="1"><tbody><tr><td> Specie di anticorpi anti-DIG (diluizione; società, numero di catalogo) </td><td> Colori </td><td> Alexa Fluor usato (1:500) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Mouse (1:500, Sigma, B7405) </td><td> verde </td><td> Alexa Fluor 488 asino anti-topo (Invitrogen, A21202) </td></tr><tr><td> rosso </td><td> Alexa Fluor 594 asino anti-topo (Invitrogen, A21203) </td></tr><tr><td> blu </td><td> Alexa Fluor 647 asino anti-topo (Invitrogen, A31571) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Sheep (1:200; Roche, 11376623) </td><td> verde </td><td> Alexa Fluor 488 asino anti-pecora (Invitrogen, A11015) </td></tr><tr><td> rosso </td><td> Alexa Fluor 594 asino anti-pecora (Invitrogen, A11016) </td></tr><tr><td> blu </td><td> Alexa Fluor 647 asino anti-pecora (Invitrogen, A21448) </td></tr></tbody></table> Combinazioni Tabella 2. Di anticorpi secondari e anti-DIG elencati con numeri di catalogo e le concentrazioni.

rilevamento di rna virale per fluorescenza<em&gt; in situ</em&gt; hybridization (fish)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

I virus che infettano le cellule sollecitare modifiche specifiche funzioni cellulari normali che servono a deviare l&#39;energia e le risorse per la replicazione virale. Molti aspetti della funzione della cellula ospite sono comandati da virus, di solito l&#39;espressione di prodotti genici virali che reclutano le proteine ​​della cellula ospite e macchinari. Inoltre, virus organelli membrana ingegnere tag specifiche o di vescicole su cellulari e proteine ​​motrici a regioni bersaglio della cellula (durante l&#39;infezione de novo, i virus cooptare proteine ​​motore molecolare per colpire il nucleo, poi, durante l&#39;assemblaggio del virus, saranno dirottare cellulare macchinari che aiuteranno nel montaggio di virus). Minore è inteso come il virus, in particolare quelli con genomi di RNA, coordinare il traffico intracellulare di proteine ​​e componenti RNA e come ottenere assemblaggio di particelle infettive in loci specifici nella cellula. Lo studio della localizzazione RNA è iniziato nel lavoro precedente. Sviluppare em eucariotici inferioribryos e cellule neuronali fornito importanti informazioni biologiche, e ha anche sottolineato l&#39;importanza della localizzazione RNA nella programmazione delle cascate di espressione genica. Lo studio in altri organismi e sistemi cellulari ha prodotto simile informazioni importanti. I virus sono parassiti obbligati e devono utilizzare le loro cellule ospiti per replicare. Pertanto, è fondamentale per comprendere come RNA virus dirigere loro genomi RNA dal nucleo, attraverso il poro nucleare, attraverso il citoplasma e su una delle sue destinazioni finali, in particelle di virus progenie 1. FISH serve come uno strumento utile per identificare i cambiamenti a regime localizzazione di RNA virale. Quando combinato con immunofluorescenza (IF) analisi 22, FISH / IF co-analisi fornirà informazioni sulla co-localizzazione delle proteine ​​con l&#39;RNA virale 3. Questa analisi fornisce quindi un buon punto di partenza per verificare le interazioni RNA-proteina da loro o biochimica-biofisicaprove di 4,5, in quanto co-localizzazione di per sé non è una prova sufficiente per essere certi di una interazione. Nello studiare la localizzazione di RNA virale utilizzando un metodo come questo, molte informazioni sono state acquisite da entrambi i virali e cellulari RNA 6 eventi di traffico. Ad esempio, HIV-1 RNA produce nel nucleo delle cellule infette, ma l&#39;RNA viene soltanto tradotta nel citoplasma. Quando una proteina chiave virale manca (Ap) 7, FISH del RNA virale ha rivelato che il blocco di replicazione virale è dovuto alla ritenzione di HIV-1 RNA genomici nel nucleo 8. Qui, presentiamo il metodo per l&#39;analisi visiva di RNA genomico virale in situ. Il metodo fa uso di una sonda marcata RNA. Questa sonda è progettata per essere complementare alle RNA genomico virale. Durante la sintesi in vitro di RNA antisenso sonda, il ribonucleotide che viene modificato con digossigenina (DIG) è incluso in uno in vitro transcription reazione. Una volta che la sonda si è ibridata con il mRNA bersaglio in cellule, successive fasi di etichettatura anticorpo (Figura 1) rivelerà la localizzazione del mRNA e proteine ​​di interesse durante l&#39;esecuzione di FISH / IF.

A fluorescenza<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; (FISH) metodo è stato sviluppato per rilevare visivamente virali RNA genomico mediante microscopia a fluorescenza. Una sonda è fatta con specificità per gli RNA virali che possono poi essere identificati utilizzando una combinazione di tecniche di ibridazione e di immunofluorescenza. Questa tecnica offre il vantaggio di individuare la localizzazione di RNA o DNA virale allo steady-state, fornendo informazioni sul controllo di eventi intracellulari traffico di virus.

Rilevamento di RNA virale per fluorescenza<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

I virus che infettano le cellule inducono cambiamenti specifici nelle normali funzioni cellulari, che servono a dirottare energia e risorse per la replicazione virale. Molti...

L'obiettivo generale di questo procedimento è visualizzare la localizzazione dell'RNA virale in C due all'interno delle cellule. Per raggiungere questo scopo, innanzitutto coltivare le cellule da sottoporre a transfezione o infezione su coprislips di vetro. Il secondo passaggio consiste nel fissare le cellule con paraformaldeide al 4% dopo una transfezione o infezione avvenuta con successo.Successivamente, incubare le cellule con una miscela di ibridazione che etichetta l'RNA. Questo passaggio viene eseguito posizionando il coverslip, con il lato delle cellule rivolto verso il basso, sulla miscela di ibridazione posta su un vetrino. L'ultimo passaggio di questa procedura consiste nell'utilizzare anticorpi per colorare le cellule in corrispondenza dell'etichetta dell'RNA.In definitiva, la localizzazione dell'RNA marcato all'interno della cellula viene visualizzata mediante ibridazione fluorescente in situ o FISH. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come l'imaging dell'RNA in cellule vive mediante l'utilizzo di marcatori, è che consente di rilevare l'RNA nativo anziché l'RNA modificato. Generalmente, chi si approccia per la prima volta a questa tecnica incontra difficoltà poiché richiede pazienza, attenzione nella manipolazione dei vetrini, la standardizzazione del metodo e un tempismo preciso.Durante le incubazioni, la procedura specifica per la coltura delle cellule da fissare dipenderà dal tipo di cellule. Per le cellule aderenti, è inizialmente importante seminarle su coprioggetti di vetro sterili non trattati, in modo che la confluenza finale al momento del raccolto sia approssimativamente del 70-80%. Le cellule non aderenti devono essere coltivate nel modo standard fino a quando non sono pronte per essere raccolte.Quindi incubare le cellule con coprivetrini trattati con poli-L-lisina per una tipica piastra da coltura tissutale in polistirene da 12 pozzetti, utilizzando 150.000 cellule per pozzetto, 24 ore prima dell'infezione o della trasfezione. Incubare le cellule sui coprivetrini per un'ora a 37 gradi Celsius per avviare la procedura di fissazione cellulare. Rimuovere il mezzo mediante aspirazione accurata e aggiungere delicatamente un XPBS preparato in acqua bidistillata.O lavare le cellule con DPBS per un minuto. Si può usare anche Dathyl pyro CARBATE o una XPBS trattata con DEPC. Non utilizzare PBS non trattato poiché potrebbe contenere enzimi R nase.Scartare il DPBS e aggiungere delicatamente una quantità sufficiente di paraformaldeide al 4% per coprire completamente le cellule; incubare per 15-20 minuti. Successivamente, scartare la paraformaldeide e lavare le cellule con DPBS per un minuto. Scartare il DPBS e aggiungere glicina 0,1 M; incubare per 10 minuti.Successivamente, eliminare la glicina e lavare le cellule con DPBS per un minuto. Dopo aver eliminato il DPBS, aggiungere Triton X-100 allo 0,2% e incubare per cinque-dieci minuti. Se si esegue la colorazione per proteine del nucleolo o dell'involucro nucleare, permeabilizzare con Triton X-100 per non più di cinque minuti, altrimenti la localizzazione delle proteine diventerà diffusa.Scartare il Triton X-100 e lavare due volte in DPBS per un minuto ogni volta prima di iniziare la procedura per i pesci. Preparare le superfici su cui incubare le piastrine, avendo cura di pulirle e etichettarle accuratamente. Per una piastrina da 18 millimetri, aggiungere 50 microlitri di soluzione di DNA al vetrino.L'aspetto più difficile di questa procedura è la corretta manipolazione dei coverslip. È importante assicurarsi di incubare il lato corretto del coverslip e di maneggiarli delicatamente. Per evitare rotture, aggiungere il coverslip al vetrino, avendo cura di posizionarlo con il lato delle cellule rivolto verso il basso, e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo 15 minuti, posizionare i coverslip con il lato delle cellule rivolto verso l'alto in una piastra di coltura con un X-D-P-B-S.Lavare le lamelle per un minuto. Questa miscela contiene quanto segue: 50% formammide disionizzata una milligrammo per millilitro, TRNA due X-S-S-P-E cinque X sonda dnar RNAs e acqua DEPC fino a un volume finale di 50 microlitri.La sonda è una sonda a RNA marcata con digenina progettata per essere complementare all'RNA genomico virale. Posizionare ogni coprislitta con il lato delle cellule rivolto verso il basso sulla miscela di ibridazione sul vetrino. L'incubazione deve essere eseguita in un contenitore contenente una soluzione al 50% di FIDE due X-S-S-P-E.Mescolare e incubare per 16-18 ore a 42 gradi Celsius. Successivamente, incubare il vetrino con il lato cellulare rivolto verso il basso in 50 microlitri di 50% fide per 50 minuti a 42 gradi Celsius. Lavare i vetrini due volte in due X-S-S-P-E, incubandoli con il lato rivolto verso il basso in 50 microlitri di due X-S-S-P-E per cinque minuti ciascuno a 42 gradi Celsius.Infine, lavare i coverslip in una X-D-P-P-S per un minuto. Per iniziare questa procedura, bloccare i coverslip posizionando il lato delle cellule verso il basso in 50 microlitri di soluzione bloccante 1X Roche per 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine del bloccaggio, posizionare ogni coverslip con il lato delle cellule verso il basso in 50 microlitri di una soluzione di anticorpi primari contenente tutti gli anticorpi primari dell'esperimento alle rispettive concentrazioni appropriate. Incubare per un'ora a 37 gradi Celsius dopo un'ora.Posizionare il coprioggetto con il lato delle cellule rivolto verso l'alto in una piastra di coltura contenente DPPS e lavare i coprioggetti per 10 minuti. Successivamente, pipettare 50 microlitri di soluzione di anticorpo secondario su un vetrino per ogni coprioggetto. Gli anticorpi coniugati con Alexa floor possono essere utilizzati per generare una gamma di colori e vanno impiegati in una diluizione 1:500 in soluzione bloccante 1x e 1X-D-P-B-S. Posizionare ogni coprioggetto con il lato delle cellule rivolto verso il basso nella soluzione di anticorpo secondario e incubare per un'ora a 37 gradi.Lavare i coprivetri due volte per 10 minuti ciascuno. Asciugare i coprivetri con il lato cellulare rivolto verso l'alto su un pezzo di carta assorbente in DPBS. Accertarsi di coprire i coprivetri per evitare l'esposizione alla luce e il fotodegrado.Una volta che tutto il liquido è evaporato, montare i coprioggetti su nuovi portaogetti. Utilizzando otto microlitri di Immuno Mount, appoggiare delicatamente il coprioggetto per eliminare eventuali bolle d'aria e applicare dello smalto per unghie sui bordi del coprioggetto per fissarlo in posizione. La visualizzazione di RNA e proteine mediante tecniche microscopiche è inoltre fondamentale per il successo di questa procedura.Le impostazioni utilizzate sul microscopio possono facilitare o ostacolare la visualizzazione. È quindi fondamentale che le impostazioni del microscopio siano configurate correttamente e siano coerenti da un campione all'altro all'interno di un determinato esperimento. Un risultato rappresentativo della visualizzazione dell'RNA virale mediante fish e della localizzazione proteica mediante immunofluorescenza è illustrato da questa figura.In questo primo pannello, in cui cellule HeLa sono state trasfettate con HIV-1, l'RNA virale di HIV-1 marcato in verde è visibile diffuso nel citoplasma nella maggior parte dei casi, anche se piccole punteggiature citoplasmatiche non sono infrequenti. La specificità può essere osservata confrontando le cellule positive con le cellule circostanti che non mostrano fluorescenza, come illustrato dall'immagine in bianco e nero che rappresenta esclusivamente la colorazione dell'RNA virale. La colorazione rossa riflette l'immunofluorescenza della proteina legante il dominio G3BP (Ras GTPase-activating protein-binding protein), che marca principalmente il citoplasma. Quando le cellule HeLa sono trasfettate con HIV-1 privo della proteina regolatrice Rev, l'RNA virale prodotto viene trattenuto nel nucleo.Questo può essere visualizzato come un segnale verde brillante nel nucleo e come assenza di segnale fluorescente dell'RNA nel citoplasma. La distribuzione dell'RNA virale di HIV-1 può inoltre essere alterata dalla sovraespressione di alcune proteine cellulari. Ad esempio, la sovraespressione della proteina lisosomiale interagente con RAB7 o REAL, una proteina coinvolta nel traffico delle vescicole endosomiali, provoca il reindirizzamento dell'RNA genomico virale, tracciato in verde, verso il centro di organizzazione dei microtubuli.Qui gli endosomi sono marcati da lamp uno e colorati in rosso. Al contrario, la sovraespressione di una delta N priva del terminale amminico, che non è in grado di legarsi alla P uno 50 della complessa dinamica del motore dine, disperde gli endosomi tardivi nel citoplasma. La sovraespressione della P 50 dine blocca la subunità grande del motore dine e rilascia gli endosomi tardivi, ma anche l'RNA genomico virale e le proteine strutturali HIV V uno, verso la periferia cellulare. Quando HIV uno viene espresso in cellule helo e successivamente le cellule vengono raccolte e analizzate in diversi punti temporali, l'RNA virale appare nella cellula già tre ore dopo la trasfezione e l'infezione e diventa chiaramente osservabile con questa tecnica FISH entro 12 ore.Qui l'espressione dell'RNA virale viene tracciata in verde, mentre la proteina cellulare H-N-R-N-P-A1 è marcata in rosso. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 20 minuti al primo giorno e quattro ore e mezza al secondo giorno, se effettuata correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di maneggiare con delicatezza i coprioggetti per evitare di romperli e di proteggere il campione dalla luce dopo l'applicazione dell'anticorpo secondario. Non dimenticare che quando si lavora con HIV V1 e altri agenti patogeni di livello superiore, la manipolazione è estremamente pericolosa prima della fissazione, e pertanto vanno sempre adottate precauzioni come un'adeguata formazione e il confinamento appropriato durante l'esecuzione della procedura.

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In questo video, le cellule infettate da virioni MCPyV sono state sottoposte a reazione a catena di ibridazione in situ per rilevare genomi specifici di MCPyV. Inoltre, la tecnica DNA-HCR è stata combinata con la FISH per visualizzare il DNA MCPyV nelle cellule della pelle umana infetta.

HCR-DNA FISH: Una tecnica di ibridazione in situ a fluorescenza per rilevare il DNA virale nelle cellule infette

Fonte: Vallery, T. K. &amp; Steitz, J. A. Ibridazione fluorescente in situ quantitativa (FISH) e immunofluorescenza (IF) di prodotti genici specifici in cellule infette da KSHV. J. Vis. Exp. (2019)In questo video viene dimostrata l'ibridazione fluorescente in situ per visualizzare l'RNA virale in cellule infette da virus. Vengono illustrati i passaggi relativi all'ibridazione della sonda, all'amplificazione del segnale e all'analisi mediante microscopia confocale.

Determinazione della distribuzione dell'RNA virale nelle cellule ospiti mediante ibridazione in situ a fluorescenza

Questo video dimostra l'applicazione della reazione a catena di ibridazione (HCR)-Ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) per visualizzare la distribuzione spaziale dell'RNA subgenomico di SARS-CoV-2. La combinazione dell'HCR con le tecniche di immunofluorescenza ha il potenziale per fornire informazioni sulle interazioni ospite-virus a livello di singola cellula.

Utilizzo dell'ibridazione in situ a fluorescenza immuno-RNA per visualizzare SARS-CoV-2

Qui si descrive un insieme di montaggio...

Tutta la Monte RNA fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; L&#39;ibridazione di<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

Abbiamo stabilito un protocollo di ibridazione fluorescente in situ per la rilevazione di un genoma del virus DNA persistente all'interno di sezioni tissutali di modelli animali. Questo protocollo permette studiando processo di infezione da codetection del genoma virale, i suoi prodotti di RNA e proteine ​​virali o cellulari all'interno delle cellule singole.

La rilevazione del genoma e Trascrizioni di un virus DNA persistente in tessuti neuronali da fluorescente In situ Ibridazione In combinazione con Immunostaining

Il protocollo descritto di RNA in situ ibridazione del permette la rilevazione del RNA in embrioni della drosofila interi o tessuti dissecati. Utilizzando piastre microtiter a 96 pozzetti e amplificazione del segnale di microarray, trascrizioni possono essere rilevate alla velocità effettiva, sensibilità e alta risoluzione e ad un costo relativamente basso.

Ibridazione fluorescente In Situ ad alta risoluzione in embrioni della drosofila e tessuti mediante amplificazione del segnale Tyramide

Presentato qui un protocollo per un approccio di imaging a fluorescenza, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), un metodo in grado di visualizzare simultaneamente fluorescenza singola cellula di proteine virali e acidi nucleici di diverso tipo e filamento. Questo approccio può essere applicato a una vasta gamma di sistemi.

Imaging a fluorescenza multiplexata a singola cellula per visualizzare acidi nucleici e proteine virali e monitorare HIV, HTLV, HBV, HCV, virus Zika e infezione influenzale

Qui descriviamo un metodo semplice che combina la fluorescenza dell'RNA nell'ibridazione situ (RNA-FISH) con l'immunofluorescenza per visualizzare l'RNA della sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Questo protocollo può aumentare la comprensione delle caratteristiche molecolari delle interazioni RNA-host SARS-CoV-2 a livello di singola cellula.

Visualizzazione di SARS-CoV-2 utilizzando l'ibridazione immuno RNA-fluorescenza in situ

I microbi intestinali, compresi i batteri extracellulari e gli agenti patogeni intracellulari come il virus Orsay e i microsporidi (funghi), sono spesso associati ai nematodi selvatici di Caenorhabditis . Questo articolo presenta un protocollo per rilevare e quantificare i microbi che colonizzano e / o infettano i nematodi C. elegans e per misurare il carico patogeno dopo infezioni controllate in laboratorio.

Ibridazione in situ con fluorescenza dell'RNA (FISH) per visualizzare la colonizzazione microbica e l'infezione nell'intestino di Caenorhabditis elegans

Questo video-articolo descrive, passo dopo passo, come elaborare un campione di sperma per raggiungere una buona qualità di...

Fluorescenza In situ</emIbridazione> (FISH) Protocollo di sperma umano

Scopri il metodo FISH per visualizzare l'RNA virale nelle cellule infette mediante microscopia a fluorescenza. Questa tecnica consente di studiare la localizzazione intracellulare e il traffico del genoma virale in vivo.

Rilevamento di RNA virale per fluorescenza

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