Rilevamento di RNA virale per fluorescenza In situ Hybridization (FISH)

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare la posizione dell'RNA virale in C 2 all'interno delle cellule. Per fare ciò, per prima cosa, fai crescere le cellule che verranno trasfettate o infettate su vetrini di vetro. Il secondo passo consiste nel fissare le cellule con aldeide paraforme al 4% dopo la trasfezione o l'infezione riuscita.

Successivamente, incubare le cellule con una miscela di ibridazione che etichetta l'RNA. Questo viene fatto posizionando la cella del vetrino coprioggetto con il lato rivolto verso il basso sulla miscela di ibridazione su un vetrino. Il passaggio finale di questa procedura consiste nell'utilizzare gli anticorpi per colorare le cellule per l'etichetta dell'RNA.

In definitiva, la localizzazione dell'RNA marcato all'interno della cellula viene visualizzata mediante fluorescenza nell'ibridazione C 2 o nei pesci. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi come l'imaging dell'RNA e le cellule vitali che utilizzano i tag è che l'RNA nativo può essere rilevato rispetto all'RNA modificato. In generale, le persone che non conoscono questa tecnica avranno difficoltà perché richiede ai pazienti la cura e la gestione dei vetrini, la standardizzazione del metodo e i tempi precisi.

Durante le incubazioni, la procedura specifica per la coltura delle cellule per la fissazione dipenderà dal tipo di cellule. Per le cellule aderenti, è inizialmente importante seminarle su vetrini di vetro sterili non trattati. Quindi la cofluenza finale al momento del prelievo è di circa il 70-80%, le cellule non aderenti devono essere coltivate in modo standard fino a quando non sono pronte per essere raccolte.

Quindi incubarli con vetrini coprioggetti che sono stati trattati con poli-L lisina per una tipica piastra di coltura tissutale in polistirene a 12 pozzetti, 150.000 cellule per pozzetto a 24 ore prima dell'infezione o della trasfezione. Incubare le cellule sulle labbra di copertura per un'ora a 37 gradi Celsius per iniziare la procedura di fissazione cellulare. Scartare il terreno con un'attenta aspirazione e aggiungere delicatamente un XPBS preparato e acqua distillata due volte.

Oppure DPBS lava le celle per un minuto. Può essere utilizzato anche Dathyl pyro CARBATE o DEPC trattato con un XPBS. Non utilizzare PBS non trattato in quanto potrebbe contenere enzimi R nasi.

Scartare il DPBS e aggiungerne delicatamente una quantità sufficiente. 4% di para formaldeide per coprire completamente le cellule, incubare per 15-20 minuti, dopodiché, scartare la paraldeide e lavare le cellule con DPBS per un minuto. Scartare il DPBS e aggiungere 0,1 molari di glicina incubare per 10 minuti.

Quindi, scartare la glicina e lavare le cellule con DPBS per un minuto. Dopo aver scartato il DPBS, aggiungere lo 0,2% di Triton X 100, incubare per cinque-10 minuti. Se si colorano le proteine dell'involucro nucleolare o nucleare, permeare con tritone X 100 per non più di cinque minuti, altrimenti la localizzazione proteica diventerà diffusa.

Scartare triton X 100 e lavare due volte in DPBS per un minuto ogni volta prima di iniziare la procedura per il pesce. Preparate i lati su cui incubare i vetrini di copertura avendo cura di pulirli ed etichettarli bene. Per un vetrino coprioggetti da 18 millimetri, aggiungere 50 microlitri di soluzione di DNA al vetrino.

L'aspetto più difficile di questa procedura è la corretta gestione dei vetrini di copertura. È importante assicurarsi di incubare il lato destro del vetrino coprioggetti e di maneggiarlo delicatamente. Per evitare rotture, aggiungere il vetrino coprioggetti al vetrino, assicurandosi di posizionarlo con la cella rivolta verso il basso e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente Dopo 15 minuti, posizionare i vetrini con il lato di vendita rivolto verso l'alto in una capsula di coltura con un X-D-P-B-S.

Lavare i vetrini coprioggetto per un minuto. Questo mix contiene quanto segue. 50% di ammide in forma deionizzata un milligrammo per millilitro, TRNA due X-S-S-P-E cinque RNA X dnar fuori sonda e acqua DEPC fino a un volume finale di 50 microlitri.

La sonda è una sonda a RNA marcata con dig genin progettata per essere complementare all'RNA genomico virale. Luogo. Ogni cella di scorrimento coprioggetti con il lato rivolto verso il basso sulla miscela di ibridazione sul vetrino. L'incubazione deve essere eseguita in un vassoio contenente un 50% FIDE due X-S-S-P-E.

Mescolare, incubare per 16-18 ore a 42 gradi Celsius. Successivamente, incubare il vetrino coprioggetto con la cella rivolta verso il basso in 50 microlitri di 50% di fede per 50 minuti a 42 gradi Celsius. Lavare i vetrini coprioggetto due volte in due X-S-S-P-E incubandoli con il lato rivolto verso il basso in 50 microlitri di due X-S-S-P-E per cinque minuti ciascuno a 42 gradi Celsius.

Infine, lavare i vetrini coprioggetto in un X-D-P-P-S per un minuto. Per iniziare questa procedura, bloccare i vetrini di copertura posizionando la cella con la parte rivolta verso il basso in 50 microlitri di una soluzione bloccante X Roche per 30 minuti a temperatura ambiente quando il blocco è completo, posizionare ogni cella di vetrino di copertura con il lato rivolto verso il basso in 50 microlitri di una soluzione di anticorpi primari che contenga tutti gli anticorpi primari per l'esperimento alle concentrazioni appropriate. Incubare per un'ora a 37 gradi Celsius dopo un'ora.

Posizionare la cella del vetrino con il lato rivolto verso l'alto in una capsula di coltura contenente DPPS e lavare i vetrini coprioggetti per 10 minuti. Quindi, pipettare 50 microlitri di soluzione di anticorpi secondari su un vetrino per ogni vetrino coprioggetti. Gli anticorpi coniugati a pavimento Alexa possono essere utilizzati per generare una gamma di colori e vengono utilizzati a una diluizione da uno a 500 in una soluzione bloccante x e un X-D-P-B-S Posizionare ciascuna cella di copertura con il lato rivolto verso il basso nella soluzione di anticorpi secondari e incubare per un'ora a 37 gradi.

Lavare i vetrini coprioggetto due volte per 10 minuti ciascuno. In DPBS asciutto il coperchio scivola con la cella rivolta verso l'alto su un pezzo di carta assorbente. Assicurati di coprire i vetrini coprioggetti per evitare l'esposizione alla luce e lo sbiancamento.

Una volta evaporato tutto il liquido, montare i vetrini copricoperchio su vetrini freschi. Utilizzando otto microlitri di immuno mount, picchiettare delicatamente il vetrino coprioggetti per eliminare eventuali bolle d'aria, applicare lo smalto sui bordi del vetrino coprioggetti per fissarlo in posizione. Anche la visualizzazione dell'RNA e delle proteine mediante tecniche di microscopia è fondamentale per il successo di questa procedura.

Le impostazioni del microscopio utilizzato possono aiutare o ostacolare la visualizzazione. Pertanto, è fondamentale che le impostazioni sul microscopio siano impostate correttamente e siano coerenti da un campione all'altro in un determinato esperimento. Un risultato rappresentativo della visualizzazione dell'RNA virale da parte dei pesci e della localizzazione delle proteine mediante immunofluorescenza è illustrato da questa figura.

In questo primo pannello in cui le cellule hela vengono trasfettate con l'HIV uno, l'RNA virale per l'HIV uno estratto in verde è visibile in tutto il citoplasma visualizzato diffusamente per la maggior parte, sebbene piccole punte citoplasmatiche non siano rare, la specificità può essere vista confrontando le cellule positive con le cellule circostanti che non mostrano fluorescenza come illustrato dall'immagine in bianco e nero che rappresenta solo la colorazione dell'RNA virale. La colorazione rossa riflette l'immunofluorescenza della proteina legante il terzo dominio di Ross GA, PSH o G tre bp, che contrassegna principalmente il citoplasma quando le cellule dell'elio vengono trasfettate con l'HIV, una che manca della proteina regolatoria rev. L'RNA virale prodotto viene trattenuto nel nucleo.

Questo può essere visualizzato come un segnale verde brillante nel nucleo e una mancanza di segnale fluorescente dell'RNA nel citoplasma. La distribuzione dell'RNA virale dell'HIV one può anche essere alterata dalla sovraespressione di alcune proteine cellulari. Ad esempio, la sovraespressione della proteina lisosomiale interagente RAB sette o della proteina reale, A coinvolta nel traffico delle vescicole endosomiali, porta alla rilocalizzazione dell'RNA genomico virale tracciato in verde al centro di organizzazione micro tubale.

Qui gli endosomi sono etichettati con una lampada e colorati in rosso. Al contrario, la sovraespressione di un delta N ammino-terminale deleto che non è in grado di legarsi a P one 50 incollato del complesso motorio dine disperde gli endosomi tardivi all'interno del citoplasma sovraespressione di P 50 dyin blocca la grande subunità del motore dine e rilascia endosomi tardivi, ma anche l'RNA genomico virale e le proteine strutturali dell'HIV V one alla periferia cellulare. Quando l'HIV 1 viene espresso nelle cellule elicoidali e quindi le cellule vengono raccolte e analizzate in diversi punti temporali, l'RNA virale appare nella cellula già tre ore dopo la trasfezione e l'infezione e diventa facilmente osservabile con questa tecnica di pesce entro 12 ore.

Qui l'espressione dell'RNA virale è tracciata in verde mentre quella della proteina cellulare H-N-R-N-P-A è colorata in rosso Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 20 minuti il primo giorno e quattro ore e mezza il secondo giorno se viene eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di maneggiare delicatamente i vetrini coprioggetti per evitare di romperli e per assicurarsi di evitare la luce una volta che l'anticorpo secondario è stato applicato. Non dimenticare che quando si lavora con l'HIV V uno e qualsiasi altro agente patogeno di livello superiore, è estremamente pericoloso prima della fissazione e precauzioni come un'adeguata formazione e contenimento dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.