Name: Caricamento in corso retrogrado di Nervi, tratti e radici spinali con le tinture fluorescenti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Scopri una tecnica semplice e a basso costo per caricare tinture fluorescenti e sensibili al calcio in neuroni e tratti neuronali utilizzando pipette in polietilene. Questo metodo facilita la visualizzazione dell'attività neuronale.

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<p class="jove_content"&gt; Questo lavoro è stato sostenuto dal programma intramurale del National Institute of Neurological Disorder and Stroke dei National Institutes of Health. Vorremmo anche ringraziare il Dr. George Mentis per i suoi contributi precedenti al metodo e ai dati in Figura 3.</p

Destrani fluorescenti sono stati utilizzati come strumenti anatomici e per l&#39;imaging attività neuronale 1-4. Campi et al. (2009) 4 pubblicato un protocollo per l&#39;applicazione di ioni e della tensione di coloranti sensibili ai tratti assonali con un focus sul midollo spinale come sistema modello. Qui si descrive una procedura più dettagliata per l&#39;applicazione colorante fluorescente e / o ione-sensibile alle radici taglio ventrali, radici dorsali o qualsiasi tratto neuronale del midollo spinale per studi in vitro optophysiological e morfologiche. 1. Di tipo I e tipo II Pipettes Avviare tirando due brevi tratti di tubazione in polietilene (PE90, Clay marca Adams) sulla fiamma di una lampada ad alcool 7 per la produzione di pipette con puntali conici. Una pipetta (Type-I) deve essere breve (3-7 mm) con una piccola punta che può ben tenere la radice di destinazione o del tratto (diametro esterno: 0,2-0,4 mm, diametro interno: 0,1-0,3 mm). Quindi tirare una pipetta secondo (Type-II) con un più lungo (8-12 cm) più sottile, albero e una punta molto fine (diametro esterno: 0,2-0,3 mm, diametro interno: 0.1-0.2 mm) che può essere inserito nel tipo I pipettare fino la sua punta. La seconda pipetta sottile verrà utilizzato per aspirare ed introdurre fluido cerebrospinale artificiale (ACSF) e la soluzione colorante, rispettivamente, dal tipo I pipetta. 2. Posizionamento di tipo-I Pipettare Staccare ed isolare il midollo spinale 8,9 e collocarlo in un bagno, con superfuso refrigerate ACSF (~ 16 ° C) durante tutto il processo di caricamento. Posizionare il Type-I pipettare su un portaelettrodo (H1/12 portaelettrodo, Narishige) in modo che la sua apertura posteriore può essere facilmente collegato ad una siringa (1 ml U-100 siringa da insulina, Becton Dickinson o comparabili) tramite un tubo flessibile (PharMed BPT, Cole-Parmer, # AY242002, 10 cm) (Fig.1A-B). 3. Dye Application <ol><li> Usando la siringa, prima disegnareACSF nel tipo I pipetta (Fig.1B; 2A) seguita dal tratto assonale o radice da riempire (Fig. 2B). Il tubo flessibile deve quindi essere rimosso dalla apertura posteriore. Il Tipo II-pipetta è attaccata ad un&#39;altra siringa e inserito nel tipo I pipettare premuto il tratto assonale o radice. Usando la siringa collegata al tipo II pipetta, aspirare ACSF in modo che il residuo ACSF copre appena il tratto assonale (Fig.1C; 2C-D). Poi ritirare il tipo II pipetta dal tipo I pipetta. Monitorare il livello ACSF per qualche minuto per verificare una buona tenuta sul tratto assonale o nervi (vedi sezione 3 Risoluzione dei problemi di &quot;buona tenuta&quot;). </li><li> Sciogliere il colorante in ACSF o 0,2% di Triton X-100 in acqua bidistillata e renderlo il Type-II pipetta facendo attenzione a non includere bolle d&#39;aria. Inserire il Tipo II-pipetta contenente il colorante nel tipo I pipetta e nella soluzione residua ACSF (Fig. 2E). Rilasciare lentamenteil colorante nella ACSF mediante una leggera pressione positiva (Fig. 2F). Fare attenzione a non introdurre eventuali bolle d&#39;aria o di provocare lo spostamento del tessuto bersaglio dall&#39;interno della punta. Ritirare il tipo II pipetta dopo sufficiente quantità di colorante è stata rilasciata (3-5 ml di soluzione colorante). </li></ol> 4. Incubazione Incubare il tessuto al buio tra 6 e 20 ore a seconda del tipo di esperimento. Una volta che un tempo sufficiente è stato consentito per il riempimento, tirare delicatamente l&#39;elettrodo lontano dal tessuto lasciando il tessuto pronto per l&#39;imaging e l&#39;istologia. Risoluzione dei problemi <ol><li> Se il tessuto bersaglio non entra facilmente nella punta della pipetta di tipo I o è sciolto una volta dentro, allora il diametro della punta è la dimensione sbagliata. In questo caso, tirare e utilizzare una pipetta differente. </li><li> Prima di aggiungere il colorante alla ACSF del tipo I pipetta, assicurarsi che ACSF sia sufficiente in modo che possa essere raggiunto con laType-II puntale (Fig. 2D). Altrimenti, un traferro esisterà una volta che il colorante viene aggiunto. Se questo accade, non aggiungere il colorante e rimuovere il tratto assonale dalla pipetta e poi tirarla indietro con ACSF sufficiente per essere raggiunto dalla Type-II pipetta. </li><li> Se il livello ACSF in tipo I aumenta pipette dopo che è stato aspirato con il Tipo II-pipetta, significa che il sigillo con il tessuto non è buona. Utilizzare un elettrodo diverso, altrimenti il ​​colorante viene diluito nel corso della procedura di etichettatura. </li><li> Se una bolla d&#39;aria viene introdotta nel tipo I pipetta mentre iniettando il colorante, defluire la bolla facendo avanzare il tipo-II vicino punta della pipetta per la bolla e delicatamente applicando una pressione negativa debole usando la siringa attaccata. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Motoneuroni Per illustrare l&#39;applicazione del metodo, caricati contemporaneamente, le afferenze sensoriali e interneuroni spinali con tre differenti Dextcorse di coniugati coloranti fluorescenti (Fig. 3A). Come illustrato in fig. 3B, tre classi di neuroni sono etichettati; afferenze sensoriali (rosso), interneuroni sporgenti all&#39;interno del funicolo ventrale (verde) e motoneuroni (blu). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig1.jpg" /> Figura 1. Schema che mostra Pipettare di tipo I e tipo II montaggio. (A) Un tipo I pipetta (luce blu) è posto su un portaelettrodo in modo che sia indietro apertura può essere facilmente collegata al tubo elastomero flessibile (B) e in cui uno di tipo II pipetta può essere inserito (C). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig2.jpg" /> Figura 2. Schematico che mostra il processo di caricamento dei motoneuroni con coloranti fluorescenti. (A) di tipo A-I pipetta si trova vicino alla radice ventrale da riempire. (B) di aspirazione viene applicata alla pipetta per disegnare ACSF nella pipetta seguita dalla radice. (C-D) Staccare il tubo flessibile in elastomero dal backend di tipo-I pipetta e ridurre la quantità di ACSF applicando aspirazione alla Type-II pipetta. (E) Inserire la punta della pipetta Type-II contenente il colorante dissolto nel ACSF rimanente nel tipo I pipetta. (EF) Lentamente riempire la Type-I pipetta con il colorante e quindi rimuovere la Type-II pipetta. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig3.jpg" /> Figura 3. Applicazione della procedura di riempimento al midollo spinale topo isolato. (A) schematico che mostra tre tipo I pipette per riempire diverse classi neuronali nel midollo spinale. Motoneuroni (blu, blu destrano Cascade) e sacrale afferenze sensoriali (rosso, Texas-Red destrano) sono stati riempita attraverso le radici ventrali e dorsali, rispettivamente. Fluoresceina destrano è stato utilizzato per caricare interneuroni spinali (verde) i cui assoni salire attraverso il funicolo ventrale (VF). 1 mg di ciascun colorante destrano (10.000 MW; Molecular Probes)è stato sciolto in 6 microlitri di acqua distillata contenente 0,2% Triton X-100 (B). Immagine confocale di una sezione del midollo sacrale di un midollo spinale in cui i neuroni sono stati retro-etichettato come descritto in A. Si noti che le afferenti etichettate sensoriali sono principalmente omolaterale con alcune sporgenze poco controlaterali. I neuroni motori sono etichettati omolaterale alla radice ventrale riempita mentre le interneuroni sono etichettati controlaterale al lato del riempimento (testa freccia). Calibrazione bar 200 micron.

<ol><li>Nance, D. M., Burns, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dextrans+as+sensitive+anterograde+neuroanatomical+tracers%3A+applications+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dextrans as sensitive anterograde neuroanatomical tracers: applications and pitfalls.</a> Brain Res. Bull. 25, 139-145 (1990).</li>
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<li>Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+functional+synaptic+connections+between+medullary+reticulospinal+neurons+and+lumbar+descending+commissural+interneurons+in+the+neonatal+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse.</a> J. Neurosci. 31, 4731-4742 (2011).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Non abbiamo nulla da rivelare.</p

<p class="jove_content"&gt; Descriviamo qui un protocollo semplice e conveniente per l&#39;introduzione di coloranti in neuroni, nervi e tratti della colonna vertebrale. Questo metodo consiste nell&#39;esporre i percorsi identificati anatomiche a una soluzione altamente concentrata colorante per la durata del processo di caricamento. Ciò si traduce in etichettatura retrogrado del sito bersaglio con sfondo poco rispetto microiniezioni, applicazione bagno e tecniche di elettroporazione. Tuttavia, il metodo è limitato ai siti nel sistema nervoso i...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td colspan="2"<strong&gt; Nome del materiale</strong</td&gt;<td<strong&gt; Azienda</strong</td&gt;<td<strong&gt; Numero di catalogo</strong</td&gt;<td<strong&gt; Commenti</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td rowspan="2"&gt; Tubi</td&gt;<td&gt; PE90 (IDxOD: 0,034 &quot;x0.050&quot;; Spessore parete: 0.008 &quot;)</td&gt;<td&gt; Clay Adams Marca Intermedic</td&gt;<td&gt; 427.421</td&gt;<td&gt; Per Tipo I e Tipo II pipette</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NSF-51 (IDxOD: 1/16x1/8; Spessore parete: 1/32)</td&gt;<td&gt; PharMed BPT, Cole-Parmer</td&gt;<td&gt; AY242002</td&gt;<td&gt; Per Tubi flessibili</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Siringa</td&gt;<td&gt; Siringa da insulina da 1 ml U-100</td&gt;<td&gt; Becton Dickinson</td&gt;<td&gt; 329.650</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Needle</td&gt;<td&gt; 19G x1-1/2 &quot;Metal Hub Needle</td&gt;<td&gt; MONOJECT</td&gt;<td&gt; 200.136</td&gt;<td&gt; Collegamento di tipo II pipetta siringa</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; Alcohol Lamp</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Rubinetto</td&gt;<td&gt; Valvola a tre vie con Maschio Adattatore Luer slip</td&gt;<td&gt; Baxter Healthcare Corp.</td&gt;<td&gt; 2C6241</td&gt;<td&gt; Usa con siringa</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td rowspan="3"&gt; Titolare</td&gt;<td&gt; Supporto H-1 elettrodo</td&gt;<td&gt; Narishige</td&gt;<td&gt; H-1/12</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Magnet supporto</td&gt;<td&gt; Narishige</td&gt;<td&gt;-8 GJ</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Micromanipolatore</td&gt;<td&gt; Narishige</td&gt;<td&gt; M-3333</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pinzetta</td&gt;<td&gt; S &amp; T DUMONT svizzera 00632-11</td&gt;<td&gt; DUMONT</td&gt;<td&gt; JF-5 TC</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"&gt; * Questi sono materiali suggeriti. Può essere sostituito con qualsiasi prodotti compatibili</p

caricamento in corso retrogrado di nervi, tratti e radici spinali con le tinture fluorescenti

Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes

Etichettatura retrograda di neuroni è uno standard 1,2 metodo anatomica che è stata anche utilizzata per caricare e calcio voltaggio-coloranti sensibili in neuroni 3-6. Generalmente, i coloranti vengono applicate come cristalli solidi o mediante iniezione a pressione locale utilizzando pipette di vetro. Tuttavia, ciò può causare diluizione della intensità etichettatura colorante e ridotta, in particolare quando sono necessarie diverse ore per diffusione colorante. Qui mostriamo una tecnica semplice e di basso costo per l&#39;introduzione coloranti fluorescenti e ioni sensibile in neuroni con una pipetta di aspirazione polietilene riempito con la soluzione colorante. Questo metodo offre un modo affidabile per mantenere un&#39;elevata concentrazione del colorante in contatto con assoni tutta la procedura di caricamento.

Descriviamo una tecnica semplice ea basso costo per introdurre alta concentrazione di coloranti fluorescenti e calcio-sensibili in neuroni o qualsiasi tratto neuronale mediante una pipetta di aspirazione polietilene.

Caricamento in corso retrogrado di Nervi, tratti e radici spinali con le tinture fluorescenti

La marcatura retrograda dei neuroni è un metodo anatomico standard1,2 che è stato utilizzato anche per caricare coloranti sensibili al calcio e al voltaggio nei neuroni3-6. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è introdurre una concentrazione elevata di colorante fluorescente o sensibile agli ioni nei neuroni o in qualsiasi tratto neuronale, utilizzando una tecnica semplice ed economica. Questo risultato si ottiene innanzitutto producendo due tipi di pipette, tipo uno e tipo due. Successivamente, si collega un tubo flessibile in elastomero alla pipetta di tipo uno ed si applica una pressione positiva per aspirare il tratto neuronale bersaglio all'interno della pipetta di tipo uno, verificando che si formi un buon sigillo. Successivamente, inserire la pipetta di tipo due nella pipetta di tipo uno ed utilizzare la pipetta di tipo due per aspirare il residuo di A CSF dalla pipetta di tipo uno. Quindi introdurre il colorante, ma nessuna bolla d'aria, nella pipetta di tipo uno. L'ultimo passaggio consiste nell'incubare i neuroni al buio per un periodo compreso tra sei e 20 ore.Infine, dopo la rimozione della pipetta di tipo uno, il preparato è pronto per studi in vitro di elettrofisiologia o morfologici. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'applicazione in bagno, l'iniezione BOS e l'elettroporazione è che il D vi

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Il calcio è un messaggero onnipresente nel sistema nervoso, essenziale per innescare il rilascio dei neurotrasmettitori e dei cambiamenti nella forza sinaptica. Qui mostriamo una tecnica per il caricamento di Ca 2 +-indicatori in terminazioni nervose Drosophila. Abbiamo anche dimostrare fabbricazione degli apparati necessari e sottolineare i punti critici per il successo della tecnica.

Caricamento terminazioni nervose Drosophila con gli indicatori di calcio

Abbiamo descritto le caratteristiche strutturali del Glia-sinapsi neuromuscolare in un preparato romanzo Inside-out tessuto di larve di mosca dal vivo con coloranti fluorescenti con microscopia confocale. Siamo etichettati terminazioni neuronali vivere con anticorpi fluorescenti primario di HRP, e anche visualizzare lo spazio perisynaptic con destrani fluorescenti.

Visualizzazione di Live Drosophila Gliali-giunzione neuromuscolare con tinture fluorescenti

Imaging in diretta degli assoni spinali dopo rizotomia

Trasporto retrogrado di colorante fluorescente etichetta una sotto-popolazione di neuroni basati su proiezione anatomica. Assoni con etichetta possono essere mirati...

Retrograda Etichettatura fluorescente Consente mirata extracellulare singola unità di registrazione da parte dei neuroni identificati<em&gt; In vivo</em

Fonte: Inal, M. A. et. al., Tracciamento retrogrado di  Drosophila motoneuroni embrionali utilizzando coloranti fluorescenti lipofili. J. Vis. Exp. (2020)Questo video dimostra il metodo di marcatura retrograda dei motoneuroni  Drosophila utilizzando coloranti lipofili. Il colorante entra nell'assone, viaggia retrogradamente ed etichetta i neuroni in verde, consentendo una visualizzazione dettagliata della loro morfologia e delle proiezioni al microscopio confocale.

Marcatura retrograda dei motoneuroni di Drosophila utilizzando coloranti lipofili fluorescenti

Fonte: Wang, J., et al. Visualizzazione dell'innervazione immunoreattiva del peptide correlato al gene della calcitonina della dura madre cranica di ratto con immunofluorescenza e tracciamento neurale. J. Vis. Exp. (2021).  Questo video mostra un metodo per tracciare le origini dei neuroni sensoriali nella dura madre utilizzando la microscopia a fluorescenza. Un tracciante retrogrado viene introdotto nella dura madre esposta di un ratto anestetizzato. Il tracciante viene assorbito dagli assoni...

Indagine sulle origini dei neuroni sensoriali nella dura madre mediante microscopia a fluorescenza

Presentiamo un protocollo che utilizza la microscopia time-lapse con eccitazione a due fotoni per visualizzare simultaneamente la dinamica delle lesioni degli assoni e della mielina in tempo reale. Questo protocollo proposto consente di studiare fattori sia intrinseci che estrinseci che possono influenzare il destino dell'assone mielinizzato centrale dopo una lesione e contribuire alla disabilità clinica permanente.

Un Ex Vivo Laser-indotta Spinal Cord Injury modello per valutare i meccanismi di degenerazione assonale in tempo reale

Descriviamo una tecnica per etichettare i neuroni ei loro processi tramite iniezioni anterograda o traccianti retrogradi in nuclei cerebrali con una preparazione in vitro. Abbiamo modificato un metodo esistente di i n vitro tracciante elettroporazione sfruttando fluorescente mutanti di topo attrezzatura ottica e di base al fine di aumentare la precisione di etichettatura.

Neuronal Tracing negli espianti cerebrali a guida laser

Qui descriviamo un metodo per caricare un colorante sensibile al calcio attraverso il ceppo nervoso della rana nelle estremità nervose. Presentiamo inoltre un protocollo per la registrazione e l'analisi dei rapidi transitori di calcio nei terminali nervosi periferici.

Caricamento di un colorante di calcio in terminazioni di nervi della rana attraverso il ceppo del nervo: registrazione transitoria del calcio nella giunzione neuromuscolare della rana

Descriviamo un metodo per la tracciatura retrograda dei motoneuroni embrionali della Drosophila usando coloranti fluorescenti lipofilici.

Tracciamento retrogrado dei neuroni motori embrionali della Drosophila utilizzando coloranti fluorescenti lipofilici

Descriviamo i metodi di fotoattivazione della fluorescenza per analizzare il trasporto assonale dei neurofilamenti in assoni singoli mielinati di nervi periferici da topi transgenici che esprimono una proteina neurofilabile fotoattivabile.

Imaging e analisi del trasporto neurofilamento nel nervo tibiale del topo escresato

Scopri una tecnica semplice e a basso costo per caricare tinture fluorescenti e sensibili al calcio in neuroni e tratti neuronali utilizzando pipette in polietilene. Questo metodo facilita la visualizzazione dell'attività neuronale.

Caricamento in corso retrogrado di Nervi, tratti e radici spinali con le tinture fluorescenti

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