Caricamento in corso retrogrado di Nervi, tratti e radici spinali con le tinture fluorescenti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di introdurre un'alta concentrazione di colorante fluorescente o iono-sensibile nei neuroni o in qualsiasi tratto neuronale utilizzando una semplice tecnica a basso costo. Ciò si ottiene producendo prima due tipi di pipette, tipo uno e tipo due. Quindi collegare un tubo flessibile in elastomero alla pipetta di tipo uno e applicare una pressione positiva per aspirare il tratto neuronale bersaglio nella pipetta di tipo uno, verificando che sia stata effettuata una buona tenuta.

Quindi, inserire la pipetta di tipo due nella pipetta di tipo uno e utilizzare la pipetta di tipo due per aspirare l'A CSF residuo dalla pipetta di tipo uno. Quindi introdurre il colorante, ma senza bolle d'aria nella pipetta di tipo uno. Il passaggio finale consiste nell'incubare i neuroni al buio tra le sei e le 20 ore.

Infine, dopo la rimozione della pipetta di tipo uno, la preparazione è pronta per studi in vitro, elettrofisiologici o morfologici. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'applicazione del bagno, l'iniezione di BOS e l'elettroporazione, è che la D viene erogata a una popolazione neuronale definita. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come l'attività, la connettività, la morfologia e la distribuzione di neuroni definiti.

In generale, la tecnica richiede pratica, in particolare assicurandosi che il colorante non venga diluito all'interno della pipetta di tipo uno e che non vengano introdotte bolle d'aria al suo interno. Iniziare questa procedura tirando il tubo di polietilene sulla fiamma di una lampada ad alcool per produrre due pipette corte con punte coniche. Innanzitutto, tirare una pipetta corta di tipo uno con una punta piccola che possa trattenere saldamente la radice o il tratto target.

Quindi, estrarre una pipetta di tipo due con uno stelo più lungo e sottile e una punta molto sottile che può essere inserita nella pipetta di tipo uno fino alla punta. Successivamente, collegare la pipetta di tipo due all'ago calibro 19 con clip EC. Quindi mettere il midollo spinale isolato in un bagno.

Super fonderlo con A CSF raffreddato durante tutto il processo di caricamento. Successivamente, posizionare la pipetta di tipo uno su un portaelettrodo in modo che la sua apertura posteriore possa essere facilmente collegata a una siringa tramite un tubo flessibile. In questa procedura, aspirare prima un liquido cerebrospinale nella pipetta di tipo uno utilizzando una siringa.

Quindi, disegnare il tratto assonale o la radice da riempire. Quindi rimuovere il tubo flessibile dall'apertura posteriore. Successivamente, collegare la pipetta di tipo due a un'altra siringa.

Inserirlo nella pipetta di tipo uno, che tiene un tratto assonale, o una radice neuronale al microscopio. Utilizzare la siringa collegata alla pipetta di tipo due per aspirare l'A CSF in modo che l'A residuo del CSF copra appena il tratto assonale. Quindi estrarre la pipetta di tipo due dalla pipetta di tipo uno.

Monitorare il livello di A nel liquido cerebrospinale per alcuni minuti per verificare una buona tenuta sul tratto assonale o sui nervi. Successivamente, sciogliere il colorante in A CSF o 0,2% Triton X 100 in acqua doppia distillata. Aspirarlo nella pipetta di tipo due applicando una leggera pressione negativa alla siringa collegata, facendo attenzione a non aspirare bolle d'aria.

Quindi inserire la pipetta di tipo due contenente il colorante nella soluzione residua di A CSF Nella pipetta di tipo uno, rilasciare lentamente il colorante nell'A CSF esercitando una leggera pressione positiva sulla siringa. Assicurarsi di non introdurre bolle d'aria o di causare lo spostamento del tessuto bersaglio dall'interno della punta. Se una bolla d'aria viene introdotta nella pipetta di tipo uno durante l'iniezione del colorante, estrarre la bolla facendo avanzare la punta della pipetta di tipo due vicino alla bolla, quindi applicando delicatamente una debole pressione negativa utilizzando la siringa collegata.

Dopo che è stata rilasciata una quantità sufficiente di colorante, prelevare la pipetta di tipo due. Successivamente, incubare il tessuto al buio per sei-20 ore, a seconda del tipo di esperimento. Una volta concesso un tempo sufficiente per il riempimento, estrarre delicatamente l'elettrodo dal tessuto.

Quindi il tessuto è pronto per l'imaging o l'istologia. Ecco un diagramma schematico che mostra il caricamento di tre diversi coloranti fluorescenti coniugati contemporaneamente ai motoneuroni, agli interneuroni sensoriali afferenti e spinali, ai motoneuroni e all'afferenza sensoriale sacrale sono stati riempiti con destrano blu Cascade e destrano rosso Texas rispettivamente attraverso le radici ventrali e dorsali. Il destrano fluorescente verde è stato caricato negli interneuroni spinali i cui assoni salgono attraverso il funicolo ventrale.

Qui è mostrata un'immagine confocale di una sezione del midollo spinale sacrale in cui i neuroni sono stati retromarcati. Si noti che le afferenze sensoriali etichettate sono principalmente omolaterali. Con alcune proiezioni controlaterali, i motoneuroni marcati sono omolaterali alla radice ventrale riempita, mentre gli interneuroni marcati sono controlaterali ad essa come indicato dalla punta della freccia.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire un metodo aggiuntivo per rispondere a domande chiave come la connettività funzionale, l'inibitore eccitatorio, il tipo di seno, la distribuzione e la produzione di neurotrasmettitori nei neuroni del campo DI. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neurofisiologia del midollo spinale e del tronco encefalico per emettere una popolazione neuronale specifica utilizzando coloranti sensibili agli ioni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come applicare coloranti fluorescenti e/o sensibili agli ioni nei neuroni e nelle fibre sensoriali nel midollo spinale isolato.