Analisi della maturazione polmonare delle cellule dendritiche e migrazione durante l'infiammazione allergica delle vie aeree

Lo scopo di questa procedura è valutare la maturazione e la migrazione delle cellule dendritiche polmonari, o DC, durante l'infiammazione allergica delle vie aeree indotta da Val Boomin nei topi. Questo viene ottenuto sensibilizzando prima i topi con Val Boomin, seguito da una sfida delle vie aeree con Val Boomin marcato con fitsy. Successivamente, vengono prelevati i polmoni e i linfonodi mediastinici.

Infine, si prepara una sospensione di singole cellule a partire dai tessuti polmonare e linfonodale. In ultima analisi, lo stato di maturazione e il numero assoluto di cellule dendritiche Pullman read presenti nei linfonodi mediastinici dopo la sfida con FITC Val Boomin possono essere valutati mediante analisi citofluorimetrica. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande fondamentali riguardo le risposte immunitarie polmonari, come ad esempio se le cellule dendritiche subiscono maturazione in seguito all'esposizione all'antigene e se migrano verso i linfonodi di drenaggio.

E se migrano, qual è la velocità di migrazione. Iniziare aggiungendo goccia a goccia, in rapporto uno a uno, una soluzione di Val Boomin appena preparata in un tubo contenente allume, agitando con vorticoso. Mescolare la miscela per 30 minuti, quindi riempire una siringa da un millilitro con 0,2 millilitri della miscela.

Con il pollice e l'indice di una mano, afferrare il mouse da iniettare dal collo, vicino alla base del cranio. Successivamente, con l'altra mano, iniettare la soluzione di Val Boomin in allume nella cavità peritoneale del mouse. Sette giorni dopo la seconda iniezione di Val in allume, mantenere un animale sensibilizzato con Val in allume in posizione eretta sotto anestesia, quindi utilizzando punte di pipetta sterili pipettare 100 microlitri di soluzione di Val in fxi appena preparata sul NAS del mouse in modo goccia a goccia.

Iniziare collegando un catetere da 20 gauge a una siringa da un millilitro. Successivamente, dopo aver confermato l'eutanasia del topo, aprire la cavità toracica dell'animale fino al collo per esporre e canulare la trachea del topo. È assolutamente fondamentale lavare i polmoni e perfondere il cuore per assicurarsi che tutti i macrofagi alveolari e le cellule mononucleari contaminanti presenti nel sangue periferico siano stati rimossi.

E assicurarsi di eseguire con attenzione questi due passaggi successivi e, ovviamente, con mano ferma. Somministrare ora tre volte PBS freddo con EDTA attraverso il catetere per risciacquare le vie respiratorie inferiori e rimuovere le cellule dagli spazi alveolari. Successivamente, dopo aver montato una siringa da 10 millilitri con un ago da 20 gauge, perfondere i polmoni con 10 millilitri di PBS contenente eparina attraverso il ventricolo destro del cuore.

La rimozione di tutte le cellule ematiche residue dalla vascolarizzazione polmonare si considera completa quando i polmoni diventano bianchi. Successivamente, rimuovere i linfonodi mediastinici, ponendoli in una piastra separata. Evitare la fotodegradazione riducendo al minimo l'esposizione alla luce del tessuto.

Quindi dissezionare i polmoni perfusi e posizionarli in una piastra di Petri; utilizzando delle forbici, tritare i polmoni. Successivamente, digerire il tessuto polmonare a 37 gradi Celsius in 250 unità per millilitro di collagenasi D. Dopo 25 minuti di incubazione, aggiungere EDTA alla miscela per cinque minuti per arrestare l'attività della collagenasi. Infine, far passare i frammenti di polmoni digeriti attraverso un filtro cellulare da 100 micron e lisare i globuli rossi con un tampone ipotonico.

Separare delicatamente i linfonodi mediastinici utilizzando aghi fini e digerirli con collagenasi come appena dimostrato per i polmoni, quindi filtrare il tessuto attraverso un filtro per cellule dopo la sensibilizzazione intraperitoneale e la provocazione delle vie aeree con Val. La presenza di cellule infiammatorie può essere valutata mediante colorazione ematossilina-eosina in sezioni polmonari rappresentative di controllo.

Negli animali trattati con soluzione salina, i tessuti sono privi di infiammazione, come dimostrato dal grafico superiore. Al contrario, le cellule infiammatorie sono diffuse in tutta la sezione polmonare di Val negli animali sensibilizzati e stimolati, come si può osservare nel grafico inferiore. La colorazione con acido periodico di Schiff può essere utilizzata per valutare la produzione di muco, come mostrato in questo grafico inferiore.

L'induzione dell'infiammazione allergica delle vie aeree dopo la sfida con Val in topi sensibilizzati con Val è confermata dalla presenza di muco. Al contrario, un'assenza completa di produzione di muco è osservata nei controlli trattati con soluzione salina, come dimostrato nel grafico superiore. Dopo la sfida con Val, le cellule dendritiche polmonari subiscono maturazione e successiva migrazione verso i linfonodi drenanti.

Un'analisi rappresentativa dei linfonodi mediastinici di topi mostra un aumento modesto ma costante della proporzione di cellule positive per CD11c negli animali sensibilizzati e stimolati con Val Boomin, rispetto ai topi trattati con soluzione salina. Inoltre, l'analisi del numero assoluto di cellule positive per CD11c, CD11b e Val Boomin fits C provenienti dai linfonodi mediastinici di topi sensibilizzati e stimolati con Val rivela un incremento di diverse volte nel numero di cellule dendritiche nei topi stimolati rispetto agli animali trattati con soluzione salina. Dopo aver visto questo video, dovremmo avere una chiara comprensione della nostra tecnica per analizzare la maturazione e la migrazione delle cellule dendritiche polmonari.

E una volta compresa a fondo questa tecnica, sarà possibile modificarla per valutare le risposte delle cellule dendritiche polmonari ad altri patogeni, nonché ad altri fattori sperimentali.