Analisi della maturazione polmonare delle cellule dendritiche e migrazione durante l'infiammazione allergica delle vie aeree

Lo scopo di questa procedura è valutare la maturazione e la migrazione delle cellule dendritiche polmonari o delle DC durante il corso dell'infiammazione allergica delle vie aeree indotta da Val Boomin nei topi. Ciò si ottiene sensibilizzando prima i topi con Val Boomin, seguito da una sfida delle vie aeree con Val Boomin etichettato come fitsy. Successivamente, vengono prelevati il polmone e i linfonodi mediastinici.

Infine, viene preparata una sospensione a singola cellula dai tessuti polmonari e linfonodali. In definitiva, lo stato di maturazione e il numero assoluto di cellule dendritiche della lettura di Pullman presenti nel linfonodo mediastinico dopo la provocazione FITC Val Boomin possono essere valutati mediante analisi citometrica a flusso. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande chiave sulle risposte immunitarie polmonari, ad esempio se le cellule dendretiche subiscono la maturazione, la diminuzione dell'esposizione all'antigene e se migrano verso i linfonodi di valutazione.

E se migrano, allora qual è il tasso di migrazione. Inizia aggiungendo la soluzione Val Boomin appena preparata Dropwise in un rapporto uno a uno in un tubo di allume durante il vortice. Mescolare la miscela per 30 minuti e poi riempire una siringa da un millilitro con 0,2 millilitri di miscela.

Usando il pollice sull'indice di una mano, afferrare il mouse da iniettare dal frammento del collo vicino alla base del cranio. Quindi iniettare con l'altra mano la soluzione di allume Val Boomin nella cavità peritoneale del topo. Sette giorni dopo la seconda iniezione di Val in allume, tenere un val anestetizzato in allume sensibilizzato animale in posizione verticale, quindi utilizzando punte di pipetta sterili pipettare 100 microlitri e val appena preparato in soluzione fxi sul NAS del topo in modo gocce.

Inizia collegando un catetere calibro 20 a un millilitro di siringa. Quindi, dopo aver confermato l'eutanasia del topo, aprire la cavità toracica dell'animale fino al collo per esporre e incannulare la trachea del topo. È assolutamente fondamentale lavare i polmoni e cospargere il cuore per assicurarsi che tutti i macrofagi alveolari contaminanti e le cellule mononucleate presenti nel sangue periferico siano stati rimossi.

E assicurati di eseguire questi due passaggi con attenzione e, naturalmente, con mano ferma. Ora somministrare il PBS ghiacciato con EDTA tre volte attraverso il catetere per sciacquare il tratto respiratorio inferiore e rimuovere le cellule dagli spazi alveolari. Quindi, dopo aver inserito una siringa da 10 millilitri con un ago calibro 20, perfondere i polmoni con 10 millilitri di PBS contenente eparina attraverso il ventricolo destro del cuore.

La rimozione di eventuali cellule del sangue rimanenti dal sistema vascolare polmonare è considerata completa quando i polmoni diventano bianchi. Successivamente, rimuovere i linfonodi mediastinici, mettendoli in un piatto separato. Prevenire la tempra riducendo al minimo l'esposizione alla luce del tessuto.

Quindi sezionare i polmoni perfusi e metterli in una capsula di Petri usando le forbici, tritare i polmoni. Successivamente, digerire il tessuto polmonare a 37 gradi Celsius in 250 unità per millilitro di collagenasi D.Dopo 25 minuti di incubazione, aggiungere EDTA alla miscela per cinque minuti per interrompere l'attività della collagenasi. Infine, passare i frammenti di polmoni digeriti attraverso un colino cellulare da 100 micron e adagiare gli eritrociti con tampone ipotonico.

Separare i linfonodi mediastinici usando aghi sottili e digerirli con collagenasi come appena dimostrato per i polmoni, quindi sforzare il tessuto attraverso un colino cellulare dopo l'intraperitoneale, la sensibilizzazione e le vie aeree. Val in sfida. La presenza di cellule infiammatorie può essere valutata mediante colorazione con emato, toina ed eosina in sezioni polmonari rappresentative dal controllo.

Animali trattati con soluzione salina, i tessuti sono privi di infiammazione come dimostrato dal grafico in alto. Al contrario, le cellule infiammatorie sono pervasive in tutte le sezioni polmonari da Val negli animali sensibilizzati e sfidati, come si può vedere nel fondo. La colorazione a spostamento acido periodica può essere utilizzata per valutare la produzione di muco, come mostrato in questo grafico in basso.

L'induzione di infiammazione allergica delle vie aeree a seguito di val in challenge in Val in topi sensibilizzati è confermata dalla presenza di muco. Al contrario, il controllo mostra una completa assenza di produzione di muco. I topi trattati con soluzione salina, come dimostrato nel grafico in alto che segue la val in test di provocazione, la dcs polmonare subisce la maturazione e la successiva migrazione verso i linfonodi drenanti.

Qui un'analisi rappresentativa dei linfonodi mediastinici di topo mostra che un modesto ma consistente aumento della proporzione di cellule C positive CD 11 viene rilevato negli animali sensibilizzati e sfidati con Val Boomin rispetto ai topi trattati con soluzione salina. Inoltre, l'analisi del numero assoluto di cellule CD 11 C positive CD 11 B positive Val Boomin si adatta alle cellule C positive dei linfonodi mediastinici di Val in topi sensibilizzati e sfidati mostra che un aumento di diverse volte superiore del numero di DC si verifica nei topi sfidati rispetto agli animali trattati con soluzione salina. Dopo aver visto questo video, dovremmo avere un'ottima comprensione della nostra tecnica per analizzare la maturazione e la migrazione delle cellule dendritiche polmonari.

E una volta che si comprende veramente questa tecnica, si può continuare a modificarla per valutare le risposte delle cellule dendritiche polmonari ad altri agenti patogeni e ad altri fattori sperimentali.