Planaria immobilizzazione, irradiazione parziale, e di tessuti

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di posizionare una popolazione di cellule staminali sane adiacenti al tessuto ablato con cellule staminali all'interno di un pariano al fine di analizzare i comportamenti delle cellule staminali e della progenie in vivo durante la rigenerazione. Ciò si ottiene anestetizzando e immobilizzando un parian non irradiato o irradiato a foglia per ulteriori manipolazioni. Successivamente, il parian immobilizzato non irradiato viene parzialmente schermato con piombo e quindi irradiato con raggi X, che produce un parian illeso con tessuto ablato con cellule staminali giustapposto al tessuto schermato che rimane carico di cellule staminali.

In alternativa, un innesto di tessuto prelevato da un donatore non irradiato può essere trapiantato in un ospite precedentemente irradiato al fine di produrre un parian con una popolazione isolata di cellule staminali. Fally presente all'interno di una cellula staminale diversa. Si ottengono risultati dell'ospite ablato che mostrano popolazioni di cellule staminali isolate adiacenti ai tessuti ablati delle cellule staminali mediante ibridazione in situ di RNA a montatura intera per due geni marcatori di cellule staminali.

Quindi i metodi qui descritti mirano a comprendere meglio le planarie di rigenerazione studiando il comportamento delle cellule staminali sia nel paradigma del trapianto che in un paradigma di irradiazione parziale, che ci permette di testare se i tessuti circostanti e gli ambienti locali in cui risiedono queste cellule staminali, influenzano o influenzano il comportamento di questi neoblasti o cellule staminali. Durante il processo di rigenerazione, uno o due mesi prima dell'esperimento, alimentare il plin secondo il manoscritto allegato. Per ottenere la dimensione desiderata in questa dimostrazione, vengono selezionati plin di lunghezza compresa tra uno o due centimetri e più larghi di due millimetri.

Quindi vengono fatti morire di fame da tre a sette giorni prima dell'uso. Successivamente, preparare la soluzione di tono cloro, un leggero anestetico locale, sciogliendo lo 0,1-0,2% in peso per volume di cleone nell'acqua paria. Quindi raffreddare la soluzione su ghiaccio per il trapianto di tessuto con un bruciatore bunsen, piegare un tubo capillare con diametro interno di 0,75 millimetri a uno o due centimetri dall'estremità a un angolo di 90 gradi per tagliare il tessuto dell'innesto.

Quindi piegare un altro tubo capillare con un diametro esterno di 0,7 millimetri a uno o due centimetri dall'estremità a un angolo di 90 gradi per creare un foro nell'ospite per ricevere l'innesto. Quindi, taglia il watman di carta da filtro nera. Numero tre, carta da filtro Kim wipe e carta da rollare per sigarette secondo le dimensioni indicate nel manoscritto di accompagnamento.

Successivamente, preparare la soluzione di Holt Fers modificata e la soluzione di Holt Fretter satura di Caine. Raffreddali entrambi a quattro gradi Celsius. Quindi attacca una salvietta Kim piegata a un quadrato di Paraform.

Posizionarlo sulla piastra di raffreddamento Peltier o su un altro dispositivo di raffreddamento al microscopio da dissezione. Successivamente saturare la salvietta Kim con una soluzione fredda di Holt Fretter. Quindi posiziona due rettangoli di carta da filtro nera sulla salvietta Kim.

Ora metti un pezzo di carta da filtro Watman numero due in una capsula di Petri. Inumidire la carta da filtro con la soluzione Holt Fretter. Quindi raffreddare il piatto con ghiaccio per un'irradiazione parziale.

Metti un foglio di carta più grande in un piatto più grande simile al trapianto di tessuti. Inumidire la carta da filtro con la soluzione Holt Fretter. Quindi raffreddare il piatto con ghiaccio.

In questo procedimento, riempire una capsula di Petri con una soluzione di cleone raffreddata. Pipettare la planaria nel piatto per il trapianto. Anestetizzare solo un ospite e un donatore alla volta.

Per l'irradiazione parziale, è possibile anestetizzare contemporaneamente molti animali. Quindi lasciare che i paria si immergano nella soluzione di cleone per cinque-10 minuti fino a quando non diventano immobili. Sciacquare i paria pipettandoli in un piatto riempito con soluzione Holt Fretter raffreddata.

Successivamente, immobilizzare l'area del plin pipettandola sulla carta da filtro nera imbevuta di soluzione Holt Fretter raffreddata. Quindi orientali con il lato ventrale verso il basso con un paio di pinze. Ora metti una capsula di Petri fredda preparata in precedenza in un secchiello per il ghiaccio che si inserirà all'interno di un irradiatore di raggi X dalla sorgente superiore.

Disporre l'area del plin anestetizzata in una capsula di Petri spostando le carte da filtro nere. Quindi trasferirli nell'irradiatore a raggi X a sorgente superiore, posizionare il secchiello del ghiaccio in modo tale che la distanza dal tubo catodico al paria sia ridotta al minimo. Massimizzando così l'intensità di dose efficace.

Quindi posizionare gli schermi di piombo tra il paria e il tubo catodico per la dose di raggi X. Se si desidera l'ablazione completa delle cellule staminali da regioni non schermate, erogare 30 grigi o più. Immediatamente dopo l'emissione di raggi X, trasferire il parian in acqua parian refrigerata.

Dopodiché, lascia che l'acqua del parian si riscaldi a temperatura ambiente e che gli animali si stacchino dalla carta da filtro nera. La procedura di irradiazione parziale è ora completata. Per iniziare questa procedura al microscopio da dissezione, disporre l'area di plin dell'ospite e del donatore anestetizzata su filtri neri rettangolari separati sulla salvietta Kim, che è già stata raffreddata sul peltier o sulla piastra di raffreddamento.

Utilizzare un tubo capillare di 0,75 millimetri di diametro interno per tagliare il tappo dell'innesto dal donatore. Quindi usa un paio di pinze per posizionarlo su una parte fuori mano dell'ostia. Quindi utilizzare un tubo capillare di 0,7 millimetri di diametro esterno per rimuovere un tappo dall'host.

Successivamente posizionare l'innesto nel foro. Trasferire l'ostia trapiantata sulla carta da filtro nera rettangolare nella capsula di Petri preparata in precedenza. Bagnare un pezzo di carta da rollare con la soluzione di Holt Fretter satura di Caine.

Quindi posizionalo sopra l'ospite trapiantato. Quindi, immergere quattro pezzi di carta da filtro che racchiudono una soluzione Holter satura e, nel caso in cui il sub ospite trapiantato immerga successivamente quattro batuffoli di soluzione Holt Fretter tagliata, la salvietta Kim che racchiude una soluzione Holt Fretter satura. Adagiatele sopra la carta da filtro.

Dopodiché, chiudi il coperchio. Mettere la capsula di Petri sul ghiaccio. Quindi trasferire il parian donatore nell'acqua parian per il recupero e la rigenerazione.

Quando tutti i trapianti sono completati, posizionare il parian trapiantato in un'incubatrice a 10 gradi Celsius durante la notte. La mattina dopo, trasferiscilo in una capsula di Petri riempita con acqua paria. Lascia che il parian si stacchi dalla carta da filtro o rimuovilo delicatamente con una pinza e cambia l'acqua del parian una volta ogni due o tre giorni dopo.

L'ibridazione in situ con montaggio a foro nel parian di controllo irradiato, ma completamente schermato, fissato tre giorni dopo l'irradiazione, mostra una distribuzione di cellule staminali indistinguibile da quella del parian wild type. D'altra parte, per il pario che era solo parzialmente schermato, lasciando le parti anteriori e posteriori esposte le cellule staminali sembrano essere ablate dalle regioni non schermate. Qui mostra le viste dorsali e ventrali di un parian trapiantato con successo.

Tre giorni dopo il trapianto, l'innesto è chiaramente visibile sia sulla superficie dorsale che su quella ventrale ed è circondato da caratteristico tessuto non pigmentato all'interfaccia dell'ospite dell'innesto. Tuttavia, il trapianto non riuscito non mostra alcun tessuto di innesto visibile nel sito di trapianto. L'ibridazione in situ dell'intera montatura ha rivelato la presenza di cellule staminali solo all'interno o intorno alla posizione dell'innesto, il che indica il successo del trapianto Una volta padroneggiato.

I trapianti possono essere eseguiti in soli cinque minuti ciascuno. Con percentuali di successo che si avvicinano al 90-100% e l'irradiazione parziale possono essere notevolmente aumentate. Supponendo che la dimensione del campo dell'irradiatore sia sufficientemente grande.