Name: Caratterizzazione dei meccanismi molecolari di In vivo UVR indotta cataratta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 56 s
Description: Scopri come indurre cataratta nei ratti tramite radiazione ultravioletta e analizzare i meccanismi molecolari con PCR quantitativa e immunochimica. Questo metodo permette di studiare l'espressione della caspasi 3 nel tessuto lenticolare.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto dal Karolinska Institutet KID-finanziamento, Autorità svedese per la protezione dalle radiazioni, Karolinska Institutet Eye Research Foundation, Gun och Bertil Stohnes Stiftelse, Occhio di St. Erik Hospital Research Foundation, Ögonfonden, Konung Gustav V: s och Drottning Viktorias Frimurarstiftelse.

1. L&#39;esposizione alle radiazioni ultraviolette <ol><li> 15 minuti prima dell&#39;esposizione, anestetizzare una femmina Sprague-Dawley di ratto con una miscela di 90 mg / kg Ketalar (ketamina) e 10 mg / kg Rompun (xilazina) mediante iniezione intraperitoneale. </li><li> Posizionare l&#39;animale in un dispositivo di immobilizzazione ratto e tendere le cinghie fino immobilizzazione del ratto senza provocare una compressione del tronco 13. </li><li> Instillare Mydriacyl (tropicamide), 10 mg / ml, in entrambi gli occhi di ratto per indurre midriasi. </li><li> Posizionare l&#39;animale in modo che un occhio è posizionato contro un fascio di raggi UV a 300 nm 14 con larghezza di 10 nm a metà del massimo e schermare l&#39;occhio controlaterale con nastro nero. </li><li> Esporre il ratto unilateralmente sub-dose soglia 1 kJ / m 2 raggi UV-B a 300 nm per 15 min 15. </li></ol> 2. Dissezione <ol><li> Dopo intervallo predeterminato post esposizione (1, 5, 24 e 120 ore), sacrificare il topo sei settimane di età (peso &lt;200 g) da carbon biossido di asfissia e dislocazione delle vertebre cervicali. </li><li> Enucleare gli occhi. Successivamente, inserire la cornea degli occhi verso il basso, lato posteriore in alto. Poi, un buco minima applicando una cannula 27 gauge e spingere tangenzialmente alla sclera per evitare di danneggiare la lente che è molto vicino alla sclera. Quindi utilizzare un paio di forbici per tagliare chirurgia oftalmica circonferenzialmente appena dietro il limbus finché la parte posteriore della sclera può essere sollevato. Quindi, sollevare la lente con una pinza contundenti curve. </li><li> Rimuovere residui del corpo ciliare dall&#39;equatore lente al microscopio, mantenendo la lente in soluzione salina bilanciata di non più di 5-10 minuti. </li></ol> 3. RT-PCR quantitativa <ol><li> Inserire un obiettivo in una miscela di 350 microlitri RA1 tampone di lisi (II NucleoSpin RNA totale isolamento dell&#39;RNA kit) e 3,5 microlitri β-mercaptoetanolo in una provetta Eppendorf da 2 ml. </li><li> Mantenere l&#39;obiettivo in questa miscela per 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Omogeneizzare la lente conun ago fino solo nucleo duro della lente viene lasciata dalla lente (corteccia e della capsula della lente vengono lisate in tampone di lisi). Rimuovere il nucleo dal mix. </li><li> Conservare i campioni immediatamente a -70 ° C. </li><li> Scongelare i campioni e seguire la &quot;purificazione RNA totale da cellule in coltura e tessuti&quot; protocollo (NucleoSpin RNA II RNA totale Kit di isolamento). </li><li> Conservare i campioni di RNA a -70 ° C. </li><li> Per verificare sufficiente asportazione di DNA da ogni campione, eseguire una PCR nelle seguenti condizioni (passo 1: 95 ° C per 2 min; step 2 per 40 cicli: 95 ° C per 20 sec, 55 ° C per 20 sec, 72 ° C per 20 sec; passaggio 3: 72 ° C per 7 min) con primers specifici DNA di p53, forward 5&#39;-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 &#39;e 5&#39;-inversa TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3&#39; e la DNA polimerasi Taq (dNTPack), secondo la fabbricazione protocollo. Il prodotto di PCR previsto è lungo 243 coppie di basi. </li><li> Eseguire un 1,5% elettroforesi su gel di agarosio per rilevare il DNA specifico prodotto di PCR di 243 paia di basi. Per preparare1,5% gel di agarosio in tampone TBE tener 3,75 g di agarosio e risolvere in 250 ml di tampone TBE. Aggiungi etidio bromuro (0,5 mg / ml) 500 microlitri in 500 ml di soluzione 1,5% gel di agarosio. Riscaldare il miscuglio in un forno a microonde e mescolare per risolvere l&#39;agarosio. </li></ol> Nessuno dei campioni deve rivelare eventuali specifiche di DNA prodotti PCR su 1,5% gel di agarosio. <ol start="9"><li> Misurare la concentrazione di campioni di RNA (1 microlitri) e il rapporto di assorbanza del campione a 260 nm (RNA) e 280 nm (proteina) in una NanoDrop ND-1000 spettrofotometro. Se l&#39;RNA rapporto alle proteine ​​di densità ottica dei campioni di RNA è di 2,0 o più, quindi il campione di RNA è puro. Se il rapporto di assorbanza del campione RNA è inferiore a 2,0, ripetere RNA purificazione 3,5. </li><li> Prendere un volume di campione di RNA corrispondenti a 1 ug e sintetizzare cDNA seguito Kit 1 Strand protocollo di sintesi di cDNA st (1 st Strand cDNA Kit sintesi per RT-PCR). </li><li> Conservare campioni di cDNA a -20 ° C(Per un periodo di 1 o più anni, conservare a -70 ° C). </li><li> Eseguire quantitativa real-time PCR su iCycler Colore unico MyiQ sistema in tempo reale di rilevamento PCR. Triplica carico su piastra a 96 pozzetti con 1 campione microlitri di cDNA, TaqMan Gene Expression Master Mix, TaqMan Gene Expression Assay per caspasi 3, secondo le istruzioni fabbricazione. Carico triplica su un&#39;altra piastra a 96 pozzetti con 1 campione microlitri di cDNA, TaqMan Gene Expression Master Mix, saggio TaqMan Gene Expression per minori di 18 anni, secondo le istruzioni per la produzione (Protocollo TaqMan Gene Expression Assay). Diluire in serie una frazione di cDNA da tre scelte a caso non esposti lenti. Eseguire diluizioni seriali insieme con il cDNA da campioni in una piastra a 96 pozzetti. </li><li> Utilizzare il metodo standard della curva per la quantificazione dei risultati. Il numero di cicli a fluorescenza soglia viene utilizzata come misura nel software MyiQ. Una curva standard che esprime il numero di cicli al livello di soglia in funzione della concentrazione relativa di calibratore è esnoltre stabilito per le diluizioni seriali in ogni piatto. cDNA da tre campioni non trattati lente è stato utilizzato per la calibrazione. Riguardano il numero di cicli di soglia per ciascun campione per la curva standard per ottenere la concentrazione relativa del campione di cDNA misurata. Infine, ottenere il livello di espressione dei geni bersaglio mediante la relativa concentrazione relativa del bersaglio cDNA ai 18s controllo interno cDNA. </li></ol> 4. Colorazione immunoistochimica <ol><li> Fissazione <ol><li> Staccare l&#39;occhio in PBS (tampone fosfato salino, pH 7,4). </li><li> Messo l&#39;occhio in un tubo riempito con 4% paraformaldeide (PFA) in freddo ghiaccio per 20 min. Preparare PFA 4% il giorno prima. Conservare a +4 ° C fino all&#39;uso. PFA è fresco per circa una settimana. </li><li> Rimuovere PFA con una micropipetta. Poi, lavare con PBS freddo ghiaccio per 20 min. </li><li> Mettere l&#39;occhio in saccarosio 30% a +4 ° C durante la notte. </li><li> Mettere l&#39;occhio in una tazza piena di temperatura di taglio ottimale (OCT)-medio (Tissue-Tek). Messo l&#39;occhio in una posizione adatta per il sezionamento. </li><li> Congelare in OCT-media a ghiaccio secco. </li><li> Conservare a -70 ° C fino all&#39;uso. </li></ol></li><li> Sezionamento <ol><li> Posizionare l&#39;occhio per la crio-sezionamento in un piano adeguato. </li><li> Tagliare tre 5 micron di spessore sagittale sezioni da una porzione centrale di ciascuna lente. Scartare almeno 6 sezioni tra sezioni sequenziali per evitare di macchiare i nuclei stessa in diverse sezioni. </li><li> Una volta che una sezione è stata tagliata, delicatamente posizionare un vetrino su di esso. La sezione deve quindi attenersi alla diapositiva. </li><li> Lasciare i vetrini asciugare all&#39;aria prima dell&#39;uso. Vetrini possono essere conservati a -20 ° C fino all&#39;utilizzo. </li></ol></li><li> Fluorescenza immunoistochimica <ol><li> Lasciate che i campioni raggiungere temperatura ambiente (5-10 minuti). </li><li> Disegnare bordi attorno ai campioni con un PAP-pen (Invitrogen). </li><li> Lasciate che il confine a secco per un po &#39;(10 min). </li><li> Etichettare i vetrini da microscopio. </li><li> Reidratare in 1 × PBS per 15 min. </li><li> Permeabilize in soluzione standard di blocco per 30 min. </li><li> Aggiungere l&#39;anticorpo primario (policlonale di coniglio, spaccati caspasi-3 anticorpo Asp175 9661; segnalazione Cell Technology, Inc) diluito 1:3000 in soluzione standard di blocco. </li><li> Conservare in una camera umidificata a 4 ° C durante la notte. </li><li> Lavare in PBS pipettando (3 × 5 min) o immergendolo in un bagno di grandi dimensioni (&gt; 15 min, 1-2 modifiche). </li><li> Aggiungi anticorpo secondario (anticorpo di coniglio anti secondaria con un assorbimento specifico / spettro di emissione) diluito 1:300 nella soluzione standard di blocco. </li><li> Lavare in PBS pipettando (3 × 5 min) o immergendolo in un bagno di grandi dimensioni (&gt; 15 min, 1-2 modifiche). </li><li> Pulire PAP-penna strisci. </li><li> Memorizzare in una camera umidificata a temperatura ambiente per 3 ore. Evitare l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Aggiungere una goccia di Vectashield e mettere un coprioggetto sul vetrino. Evita di fare le bolle. </li><li> Lasciare indurire Vectashield (~ 20 min). </li><li> Tenere sezioni in al buio fino al momento dell&#39;analisi. </li><li> Tutte le sezioni di controllo vengono elaborati in assenza di anticorpo primario. </li><li> Cercare i risultati in poche ore sotto un microscopio a fluorescenza. </li><li> Contare nuclei delle cellule epiteliali &#39;da un fiocco laterale nucleare a prua dall&#39;altra parte nucleare di ogni lente. Applicare il filtro blu standard per vedere tutte nuclei epiteliale lente in blu e un filtro standard che si inserisce l&#39;emissione dell&#39;anticorpo secondario per vedere la caspasi-3 nuclei positivi in ​​verde. </li><li> Registrare il numero di tutti i nuclei lente epiteliale e il numero di nuclei positivi. Contare le cellule tre volte per ogni sezione. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Brian, G., Taylor, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cataract+blindness%3A+challenge+for+the+21+st+century%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Cataract blindness: challenge for the 21 st century.</a> Bulletin of the World Health Organization. 79, 249-256 (2001).</li>
<li>Jose, J. G., Pitts, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength+dependency+of+cataracts+in+albino+mice+following+chronic+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Wavelength dependency of cataracts in albino mice following chronic exposure.</a> Experimental Eye Research. 41, 545-563 (1985).</li>
<li>Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+cataract+in+the+rat+after+exposure+to+radiation+in+the+300+nm+wavelength+region.+A+study+of+the+macro-%2C+micro-+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol.+%28Copenh%29%22%5BJournal%5D)">Acute cataract in the rat after exposure to radiation in the 300 nm wavelength region. A study of the macro-, micro- and ultrastructure.</a> Acta Ophthalmol. (Copenh). 66, 141-152 (1988).</li>
<li>Meyer, L., Dong, X., Wegener, A., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+dependent+cataractogenesis+and+Maximum+Tolerable+Dose+%28MTD+2.3%3A16%29+for+UVR+-+B+induced+cataract+in+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Dose dependent cataractogenesis and Maximum Tolerable Dose (MTD 2.3:16) for UVR - B induced cataract in C57BL/6J mice.</a> Experimental Eye Research. 86, 282-289 (2008).</li>
<li>McCarty, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+lifetime+ocular+exposure+to+UV-B%3A+the+Melbourne+visual+impairment+project%5BTitle%5D)+AND+%22Developments+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Assessment of lifetime ocular exposure to UV-B: the Melbourne visual impairment project.</a> Developments in Ophthalmology. 27, 9-13 (1997).</li>
<li>Sasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+cortical+cataract+in+subjects+of+diverse+races+and+latitude%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Localization of cortical cataract in subjects of diverse races and latitude.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 4210-4214 (2003).</li>
<li>Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+cataract+induced+by+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol.+%28Copenh%22%5BJournal%5D)">Experimental cataract induced by ultraviolet radiation.</a> Acta Ophthalmol. (Copenh. 68, Suppl 196. 1-77 (1990).</li>
<li>Galichanin, K., Löfgren, S., Bergmanson, J., Söderberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+damage+in+the+lens+after+in+vivo+close+to+threshold+exposure+to+UV-B+radiation%3A+cytomorphological+study+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Evolution of damage in the lens after in vivo close to threshold exposure to UV-B radiation: cytomorphological study of apoptosis.</a> Exp. Eye Res. 91, 369-377 (2010).</li>
<li>McCarty, C. A., Taylor, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+epidemiologic+evidence+linking+ultraviolet+radiation+and+cataracts%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A review of the epidemiologic evidence linking ultraviolet radiation and cataracts.</a> Dev. Ophthalmol. 35, 21-31 (2002).</li>
<li>Li, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+epithelial+cell+apoptosis+appears+to+be+a+common+cellular+basis+for+non-congenital+cataract+development+in+humans+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals.</a> Journal of Cell Biology. 130, 169-181 (1995).</li>
<li>Michael, R., Vrensen, G., van Marle, J., Gan, L., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+the+rat+lens+after+in+vivo+threshold+dose+ultraviolet+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in the rat lens after in vivo threshold dose ultraviolet irradiation.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 13, 2681-2687 (1998).</li>
<li>Ayala, M. N., Strid, H., Jacobsson, U., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Expression+and+Apoptosis+In+The+Lens+After+Ultraviolet+Radiation+Exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+of+visual+science%22%5BJournal%5D)">p53 Expression and Apoptosis In The Lens After Ultraviolet Radiation Exposure.</a> Investigative ophthalmology of visual science. 48, 4187-4191 (2007).</li>
<li>Galichanin, K., Wang, J., Lofgren, S., Soderberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+universal+rat+restrainer+for+ophthalmic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A new universal rat restrainer for ophthalmic research.</a> Acta Ophthalmol. 89 (1), (2011).</li>
<li>Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cataract+after+repeated+exposure+to+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo cataract after repeated exposure to ultraviolet radiation.</a> Experimental Eye Research. 70, 451-456 (2000).</li>
<li>Söderberg, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+ultraviolet+radiation+exposure+to+the+lens+expressed+by+maximum+tolerable+dose+%28MTD%29%5BTitle%5D)+AND+%22Developments+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Toxicity of ultraviolet radiation exposure to the lens expressed by maximum tolerable dose (MTD).</a> Developments in Ophthalmology. 35, 70-75 (2002).</li>
<li>Michael, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+repair+of+cataract+induced+by+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation.</a> Ophthalmic Research. 32, 1-45 (2000).</li>
<li>Löfgren, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cataract+from+ultraviolet+radiation%22">Cataract from ultraviolet radiation</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2001).</li>
<li>Ayala, M. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Influence+of+exposure+patterns+and+oxidation+in+UVR+induced+Cataract%22">Influence of exposure patterns and oxidation in UVR induced Cataract</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).</li>
<li>Dong, X. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Safety+limit+estimation+for+cataract+induced+by+ultraviolet+radiation%22">Safety limit estimation for cataract induced by ultraviolet radiation</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).</li>
<li>Löfgren, S., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+age+and+sex+in+ultraviolet+radiation+cataract+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Impact of age and sex in ultraviolet radiation cataract in the rat.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44, 1629-1633 (2003).</li>
<li>Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+exposure+time+for+UV+radiation-induced+cataract%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Influence of exposure time for UV radiation-induced cataract.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 41, 3539-3543 (2000).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

<html> Questo articolo descrive i metodi che consentono di studiare gli eventi molecolari che si verificano durante raggi UV-B indotta da cataratta. Considerando, che più le informazioni disponibili in vivo UVR cataratta indotta è stato derivato da esperimenti su albino Sprague-Dawley 7, 16, 17, 18, ​​19, abbiamo deciso di utilizzare l&#39;albino ratto Sprague-Dawley nel presente studio. Età dei ratti aveva sei settimana fa. Il genere è stato scelto per essere femminile pe...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Ketalar </td><td> Pfizer </td><td> 150086 </td><td> 50 mg / ml </td></tr><tr><td> Rompun </td><td> Bayer </td><td> 022545 </td><td> 20 mg / ml </td></tr><tr><td> Oculentum Simplex </td><td> Apoteket, Svezia </td><td> 336164 </td><td> 5 g </td></tr><tr><td> Mydriacyl </td><td> Alcon </td><td> 00352 </td><td> 10 mg / ml </td></tr><tr><td> Soluzione salina bilanciata </td><td> Alcon </td><td> 0007950055 </td><td></td></tr><tr><td> 3,5 ul β-mercaptoetanolo </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NucleoSpin RNA II RNA totale Kit di isolamento </td><td> Macherey-Nagel GmbH &amp; Co, Düren, Germania </td><td> 740.955,50 </td><td></td></tr><tr><td> p53 primer specifici del DNA </td><td> biomers.net GmbH </td><td> Una soluzione su misura </td><td></td></tr><tr><td> Taq DNA polimerasi, dNTPack </td><td> Roche </td><td> 04 728 866 001 </td><td></td></tr><tr><td> Agarosio </td><td> Sigma </td><td> A5093 </td><td></td></tr><tr><td> Bromuro di etidio soluzione 0,5 mg / ml </td><td> Sigma </td><td> E1385 </td><td></td></tr><tr><td> Nano-Drop ND-1000 spettrofotometro </td><td> Prodotti NanoDrop </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 ° Strand cDNA kit di sintesi per RT-PCR (AMV) </td><td> Roche Diagnostics GmbH </td><td> 11 483 188 001 </td><td></td></tr><tr><td> iCycler MyiQ Colore unico reale sistema di rilevamento Time PCR </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td></td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Piastra a 96 pozzetti </td><td> Sarstedt </td><td> 72.1979.202 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan Gene Expression Master Mix </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4369016 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan Gene Expression Assay per caspasi 3 </td><td> Applied Biosystems </td><td> Rn00563902_m1 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan Gene Expression Assay per minori di 18 anni </td><td> Applied Biosystems </td><td> Hs99999901_s1 </td><td></td></tr><tr><td> MyiQ software </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cleaved caspasi-3 (Asp175) </td><td> Tecnologia delle celle di segnalazione </td><td> 9661 </td><td></td></tr><tr><td> Anti IgG di coniglio </td><td> Abcam </td><td> Ab6798 </td><td></td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 84097 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscopio Universale Axioplan 2 Imaging </td><td> Carl Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 441244 </td><td></td></tr><tr><td> Buffer TBE 10x </td><td> Promega </td><td> V4251 </td><td></td></tr></tbody></table>

caratterizzazione dei meccanismi molecolari di<em&gt; in vivo</em&gt; uvr indotta cataratta

Characterization of Molecular Mechanisms of In vivo UVR Induced Cataract

La cataratta è la principale causa di cecità nel mondo 1. L&#39;Organizzazione Mondiale della Sanità definisce cataratta come una opacità del cristallino dell&#39;occhio che impedisce il trasferimento della luce. La cataratta è una patologia multifattoriale associata al diabete, il fumo, le radiazioni ultraviolette (UVR), alcool, radiazioni ionizzanti, gli steroidi e l&#39;ipertensione. Vi è una forte evidenza sperimentale 2-4 e 5,6 epidemiologica che UVR causa della cataratta. Abbiamo sviluppato un modello animale per UVR B cataratta indotta sia anestetizzati 7 e non animali anestetizzati 8. L&#39;unica cura per la cataratta è l&#39;intervento chirurgico, ma questo trattamento non è accessibile a tutti. È stato stimato che un ritardo di insorgenza della cataratta per 10 anni potrebbe ridurre la necessità di chirurgia della cataratta del 50% 9. Per ritardare l&#39;incidenza di cataratta, è necessario per comprendere i meccanismi di formazione della cataratta e trovare strategia efficace di prevenzionegie. Tra i meccanismi di sviluppo della cataratta, apoptosi svolge un ruolo cruciale nella apertura di cataratta nell&#39;uomo e negli animali 10. La nostra attenzione è stata recentemente apoptosi nella lente come meccanismo per la cataratta sviluppo 8,11,12. Si prevede che una migliore comprensione dell&#39;effetto della UVR sul percorso apoptosi fornirà possibilità per la scoperta di nuovi farmaci per prevenire la cataratta. In questo articolo, si descrive come la cataratta può essere indotta sperimentalmente dalla esposizione in vivo a raggi UV-B. Inoltre RT-PCR e immunoistochimica sono presentati come strumenti per lo studio dei meccanismi molecolari di raggi UV-B indotta da cataratta.

Le varie fonti di variazione delle misurazioni sono stati stimati con l&#39;analisi della varianza e si è constatato che, considerando tre misurazioni per animale, la varianza per misure era dell&#39;ordine del 15% di quella per gli animali. Pertanto, considerando intera analisi lente, non è possibile aumentare la precisione. Test ortogonale chiarito un contrasto statisticamente significativo per la caspasi-3 messaggio tra 120 intervallo di latenza ore rispetto intervalli di latenza inferiori. <p class="jove_content...

La cataratta è la principale causa di cecità nel mondo. Radiazione ultravioletta solare (UVR) è il principale fattore di rischio per lo sviluppo della cataratta. Un modello animale di gran lunga raggi UV-B indotta da cataratta è stato sviluppato. In questo articolo si descrivono i metodi di indagine della cataratta: l&#39;esposizione a raggi UV, RT-PCR e immunoistochimica.

Caratterizzazione dei meccanismi molecolari di<em&gt; In vivo</em&gt; UVR indotta cataratta

La cataratta è la principale causa di cecità nel mondo 1. L'Organizzazione Mondiale della Sanità definisce la cataratta come un'opacizzazione del cristallino dell'occhio che...

In questo video viene dimostrato un metodo per indurre cataratte mediante radiazioni ultraviolette nel ratto. I meccanismi molecolari coinvolti nello sviluppo della cataratta vengono successivamente studiati utilizzando la PCR quantitativa in tempo reale e l'immunocitoimmunochimica. In primo luogo, l'occhio del ratto viene esposto a radiazioni ultraviolette per indurre la formazione della cataratta.L'occhio opposto funge da controllo. Successivamente, le lenti vengono dissezionate e processate per ottenere RNA al fine di valutare i livelli di espressione di CAS B tramite PCR quantitativa in tempo reale oppure vengono colorate utilizzando un anticorpo specifico per la caspasi clivata. Tre per valutare espressione e localizzazione della proteina attiva.In definitiva, i risultati di questi saggi confermano un aumento dell'mRNA della caspasi 3 e dell'espressione della proteina attiva nel nucleo delle cellule del cristallino dopo l'esposizione alle radiazioni ultraviolette. Il vantaggio principale di questo protocollo rispetto ai metodi esistenti consiste nell'utilizzo di una sorgente unica di radiazioni ultraviolette a banda stretta e di un contenitore universale per ratti, che ci perm

characterization-molecular-mechanisms-vivo-uvr-induced

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Una dimostrazione formale della dissezione di un occhio del mouse, per un monte di tutto l'epitelio pigmentato retinico.

Dissezione di un occhio mouse per un monte intero di dell&#39;epitelio pigmentato retinico

Melanina epidermica è indotta mediante applicazione topica di forskolina in un modello murino di umano UV-sensitive pelle chiara. Manipolazione farmacologica dei livelli di cAMP nella pelle e dell'epidermide oscuramento fortemente a proteggere contro l'infiammazione UV-mediata (scottature), come misurato dalla dose minima eritematosa (MED) dosaggio.

Induzione farmacologica di melanina epidermica e di protezione contro le scottature in un modello di topo umanizzato

Descriviamo un protocollo dettagliato per l'analisi di mutazione di Lambda selezionare cII in cellule coltivate di roditori transgenici o corrispondenti animali trattati con un agente chimico/fisiche di interesse. Questo approccio è stato ampiamente utilizzato per il test di mutagenicità degli agenti cancerogeni in cellule di mammifero.

La Lambda selezionare cII , sistema di rilevazione di mutazione

Questo protocollo dimostra il rilevamento simultaneo di specie reattive dell'ossigeno (ROS), cellule vive e cellule morte nelle colture primarie vive da cellule superficiali del topo. 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetate, iodio propidio e colorazione Hoechst sono utilizzati per valutare il ROS, le cellule morte e le cellule vive, seguita dall'imaging e dall'analisi.

Valutazione dei danni ossidativi nelle cellule primarie della superficie oculare del topo/cellule staminali in risposta ai danni ultravioletti-C (UV-C)

In questo rapporto presentiamo un protocollo che consente allo sperimentatore di generare un modello murino di uveite intraoculare. Più comunemente indicato come uveite autoimmune sperimentale (EAU), questo modello consolidato cattura molti aspetti della malattia umana. Qui, descriveremo come indurre e monitorare la progressione della malattia utilizzando diverse letture.

Uveite autoimmune sperimentale: un modello murino infiammatorio intraoculare

Questo articolo descrive le procedure utilizzate per valutare la tossicità delle radiazioni UV e delle tossine chimiche su una linea cellulare primaria e immortalata.

Determinazione della tossicità delle radiazioni UV e delle sostanze chimiche sulle cellule epiteliali corneali umane primarie e immortalizzate

I modelli murini possono essere strumenti utili per studiare la biologia dell'epitelio pigmentato retinico (RPE). È stato stabilito che i topi possono sviluppare una serie di patologie RPE. Qui, descriviamo un protocollo di fenotipizzazione per chiarire e quantificare le patologie RPE nei topi utilizzando luce, elettrone di trasmissione e microscopia confocale.

Un protocollo per valutare e quantificare le patologie dell'epitelio pigmentato retinico in modelli murini di degenerazione maculare legata all'età

Questo metodo modella la chirurgia della cataratta in vivo rimuovendo le cellule delle fibre del cristallino da topi adulti e lasciando dietro di sé la sacca capsulare con le cellule epiteliali del cristallino (LEC) attaccate. La risposta alla lesione viene quindi valutata in vari momenti post-operatorio utilizzando criteri molecolari e morfologici.

Modellazione della chirurgia della cataratta nei topi

Il protocollo descrive uno studio degli effetti sistemici e locali sulla pelle dell'esposizione all'ultravioletto B nei topi.

Studio dell'esposizione cronica dei topi alle radiazioni ultraviolette B 

La funzione della lente oculare di focalizzare la luce sulla retina dipende dalla trasparenza tissutale, dalla biomeccanica e dall'indice di rifrazione. Questa revisione mette in evidenza l'architettura tridimensionale della lente e discute i complessi meccanismi che mantengono l'omeostasi tissutale.

La lente oculare dei mammiferi a fuoco: sviluppo, anatomia, fisiologia, trasparenza, biomeccanica e sfide legate all'età

Scopri come indurre cataratta nei ratti tramite radiazione ultravioletta e analizzare i meccanismi molecolari con PCR quantitativa e immunochimica. Questo metodo permette di studiare l'espressione della caspasi 3 nel tessuto lenticolare.

Caratterizzazione dei meccanismi molecolari di

Esplora altri video