Caratterizzazione dei meccanismi molecolari di

In questo video viene dimostrato un metodo per indurre cataratte mediante radiazioni ultraviolette nel ratto. I meccanismi molecolari coinvolti nello sviluppo della cataratta vengono successivamente studiati utilizzando la PCR quantitativa in tempo reale e l'immunocitoimmunochimica. In primo luogo, l'occhio del ratto viene esposto a radiazioni ultraviolette per indurre la formazione della cataratta.

L'occhio opposto funge da controllo. Successivamente, le lenti vengono dissezionate e processate per ottenere RNA al fine di valutare i livelli di espressione di CAS B tramite PCR quantitativa in tempo reale oppure vengono colorate utilizzando un anticorpo specifico per la caspasi clivata. Tre per valutare espressione e localizzazione della proteina attiva.

In definitiva, i risultati di questi saggi confermano un aumento dell'mRNA della caspasi 3 e dell'espressione della proteina attiva nel nucleo delle cellule del cristallino dopo l'esposizione alle radiazioni ultraviolette. Il vantaggio principale di questo protocollo rispetto ai metodi esistenti consiste nell'utilizzo di una sorgente unica di radiazioni ultraviolette a banda stretta e di un contenitore universale per ratti, che ci permettono di esporre in modo sicuro e preciso gli animali a uno spettro ultravioletto ben definito e a una dose controllata. Inoltre, abbiamo applicato moderne tecniche biologiche, la R-T-P-C-R quantitativa e l'immunostoria-chimica, per studiare l'apoptosi nel cristallino; questo metodo può fornire informazioni sui meccanismi molecolari della cataratta indotta dalle radiazioni ultraviolette.

È possibile applicarlo anche ad altri modelli sperimentali, come i tumori della pelle indotti da radiazioni ultraviolette, le neuroscienze comportamentali del ratto e la ricerca sperimentale sull'occhio con un focus sull'apoptosi. Iniziare questo protocollo posizionando un ratto femmina Sprague dawley anestetizzato in un contenitore per ratto e, senza comprimere il tronco, stringere le cinghie fino a immobilizzare l'animale. Per indurre la midriasi o la dilatazione della pupilla, instillare una o due gocce di una soluzione di tpic aide a 10 milligrammi per millilitro in ciascun occhio.

Quindi applicare un unguento sull'occhio non esposto e coprirlo con nastro nero per bloccare i raggi UV. Successivamente, posizionare l'animale nel contenitore in modo che l'occhio scoperto sia esposto a un fascio stretto di radiazione ultravioletta a 300 nanometri con una larghezza a mezza altezza di 10 nanometri, generato da una lampada a mercurio ad alta pressione. Esporre il ratto unilateralmente a una dose sub-liminare di un chilojoule per metro quadrato di UVRB per 15 minuti dopo l'esposizione.

Rimuovere il nastro dall'occhio non esposto e applicare un unguento su entrambi gli occhi. Restituire l'animale alla sua gabbia e coprirlo con carta morbida per mantenerlo al caldo. Monitorare l'animale finché non avrà ripreso una coscienza sufficiente a mantenere la decubito sternale.

Quindi rimettere il ratto recuperato nella gabbia insieme agli altri. 1, 5, 24 e 120 ore. Seguire dopo l'esposizione.

Posizionare l'occhio enucleato del ratto, proveniente da animale sacrificato, con la cornea rivolta verso il basso e la faccia posteriore verso l'alto, su un fazzoletto di carta morbido. Quindi, operare sotto un microscopio stereoscopico. Utilizzare una cannula da 27 gauge per praticare un foro minimo, spingendo tangenzialmente sulla sclera per evitare di danneggiare il cristallino, che è molto vicino alla sclera.

Successivamente, utilizzando un paio di forbici per chirurgia oftalmica, effettuare un taglio in senso circolare appena dietro il limbo fino a quando la porzione posteriore della sclera può essere sollevata. Quindi, utilizzando pinze curve e ottuse, sollevare il cristallino, collocarlo in una soluzione salina bilanciata ed eliminare i residui del corpo ciliare dal cristallino. Il cristallino non deve essere mantenuto nella soluzione salina bilanciata per più di 10 minuti.

Dopo la dissezione, posizionare un cristallino in una provetta microcentrifuga da due millilitri contenente 350 microlitri di RA, un buffer di lisi del kit di isolamento di RNA totale Nucleo Spin RNA due e 3,5 microlitri di Beamer keto etanolo. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, utilizzare un ago per omogeneizzare meccanicamente il cristallino fino a quando rimane solo il nucleo duro. Il cortex e la capsula del cristallino verranno lisati dal buffer di lisi.

Rimuovere il nucleo dalla miscela e scartarlo. Conservare immediatamente i campioni a meno 70 gradi Celsius. I campioni possono essere conservati fino a un anno quando si è pronti per procedere.

Procurare i campioni e purificare l'RNA seguendo il protocollo per l'RNA totale, purificazione da cellule in coltura e tessuti fornito con il kit. Conservare i campioni di RNA a meno 70 gradi Celsius. Per verificare un'adeguata rimozione del DNA da ciascun campione, amplificare il DNA utilizzando primer specifici per il DNA di P53 nelle seguenti condizioni.

Passo 1: 95 gradi Celsius per due minuti. Passo due: 40 cicli, 95 gradi Celsius per 20 secondi. 55 gradi Celsius per 20 secondi.

72 gradi Celsius per 20 secondi. Passo 3: 72 gradi Celsius per sette minuti. Al termine della corsa, analizzare i prodotti su un gel di AROS al 1,5%.

Per rilevare il prodotto PCR specifico per il DNA di 243 paia di basi, assicurarsi di includere un campione di controllo positivo e uno negativo. Se il DNA è stato correttamente eliminato, i prodotti PCR non saranno visibili. Una banda dovrebbe essere visibile soltanto nella corsia del controllo positivo utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop per misurare la concentrazione dei campioni di RNA e determinare il rapporto tra RNA e proteine.

Se il rapporto RNA su proteina, determinato mediante l'assorbanza del campione di RNA o il rapporto 260/280, è pari a 2,0 o superiore, il campione di RNA è puro. Successivamente, utilizzando un microgrammo di RNA, sintetizzare il cDNA mediante un kit per la sintesi del primo filamento di cDNA per RT-PCR; conservare i campioni di cDNA a -20 gradi Celsius. Successivamente, per eseguire la PCR quantitativa in tempo reale, applicare i campioni in triplicato su una piastra a 96 pozzetti.

Ogni pozzetto deve contenere un microlitro di campione di cDNA combinato con il saggio di espressione genica TAC man per la caspasi 3 su una piastra separata. Applicare gli stessi campioni, ma utilizzando il saggio di espressione genica TAC man per 18S. Successivamente, per generare una curva standard per l'analisi, eseguire una diluizione in serie di un microlitro di cDNA proveniente da tre lenti non esposte scelte casualmente.

Eseguire diluizioni seriali insieme al cDNA dei campioni. In una piastra a 96 pozzetti su ogni piastra. Centrifugare la piastra, quindi eseguirla su un termociclatore I cycler my iq, sistema di rilevamento PCR in tempo reale monocromatico.

Dopo l'esecuzione, utilizzando il software my IQ. Stabilire una curva standard che esprima il numero di cicli alla soglia come funzione della concentrazione relativa del calibratore per le diluizioni seriali in ogni piastra. Utilizzare la curva standard per determinare la concentrazione relativa del campione di cDNA misurata mediante il numero di cicli alla soglia per ciascun campione.

Infine, determinare il livello di espressione dei geni bersaglio rapportando la concentrazione relativa del cDNA bersaglio al cDNA del controllo interno 18 s. Per eseguire la colorazione immunohistochemica, dissezionare l'occhio e immergerlo in PBS dopo la dissezione. Trasferire l'occhio in un tubo contenente paraformaldeide al 4%, incubare sul ghiaccio per 20 minuti.

Utilizzando una pipetta micrometrica, rimuovere il paraformaldeide. Successivamente, trasferire l'occhio in un tubo Eppendorf da due millilitri contenente un millilitro di PBS freddo di ghiaccio e incubare per 20 minuti sul ghiaccio. Poi, trasferire l'occhio in un tubo Eppendorf contenente saccarosio al 30%.

Incubare a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, utilizzare pinze per trasferire l'occhio in un contenitore riempito con mezzo ottimale per il taglio o mezzo OCT. Posizionare l'occhio in modo dritto per la sezione.

Quindi posizionare il contenitore sul ghiaccio secco per congelarlo e conservarlo a meno 70 gradi Celsius fino all'uso, per sezionare l'occhio ed analizzarlo mediante microscopia a fluorescenza. Iniziare posizionando l'occhio incorporato in OCT su un mandrino nel criostato per la criosezionatura. Provare ad allineare il lato più piatto dell'occhio parallelamente al bordo del coltello.

Tagliare tre sezioni midsagittali dello spessore di cinque micron da una porzione centrale di ciascun cristallino. Scartare almeno sei sezioni tra sezioni successive per evitare di colorare gli stessi nuclei in sezioni diverse. Una volta tagliata una sezione, posizionare delicatamente un vetrino sopra di essa.

La sezione dovrebbe quindi aderire al vetrino. Lasciare i vetrini asciugare all'aria prima dell'uso. I vetrini possono essere conservati a meno 70 gradi Celsius fino al momento dell'uso per la colorazione.

Lasciare che i vetrini raggiungano la temperatura ambiente. Quindi eseguire la colorazione con anticorpi per identificare la fase tre del CAS scisso come descritto nel documento allegato entro poche ore, esaminare i vetrini al microscopio a fluorescenza. Contare tutti i nuclei delle cellule epiteliali del cristallino.

Registrare il numero di tutti i nuclei epiteliali del cristallino contando le cellule colorate con DAPI e il numero di nuclei positivi alla caspasi tre contando la caspasi attiva. Tre cellule etichettate. Contare le cellule tre volte per ogni sezione.

La caspasi 3 è una proteasi principale nella fase esecutiva dell'apoptosi. Microscopia elettronica a trasmissione. Studi dimostrano che la radiazione ultravioletta induce apoptosi nel cristallino.

Studi sperimentali sull'apoptosi confermano che la caspasi tre è un marcatore affidabile dell'apoptosi. Per determinare se l'esposizione in vivo a radiazioni ultraviolette (UVR) induca l'espressione della caspasi tre, l'espressione di mRNA nel cristallino è stata misurata mediante QPCR a 1, 5, 24 e 120 ore successivamente all'esposizione in vivo a un chilojoule per metro quadrato di UVR a 300 nanometri. Il rapporto medio di CASP3, mRNA rispetto a 18S-rRNA, tra cristallino esposto e cristallino controlaterale non esposto, è stato quindi riportato per ciascun punto temporale.

Questa figura mostra l'espressione dell'mRNA della caspasi 3 nel tempo e dimostra la trascrizione dell'apoptosi. Il marcatore caspasi 3 nel cristallino in vivo, dopo esposizione a test ortogonali con raggi UVR lontani, ha determinato un contrasto statisticamente significativo del segnale dell'mRNA della caspasi 3 tra l'intervallo di latenza di 120 ore e intervalli di latenza più brevi. L'espressione della caspasi 3 in un cristallino esposto e non esposto è stata inoltre confrontata mediante microscopia a immunofluorescenza, come mostrato in queste immagini a 24 ore dall'esposizione, in cui i nuclei sono marcati, indicando la presenza di caspasi 3 attiva.

Questo metodo di immunomarcatura fornisce informazioni preziose sulla distribuzione spaziale delle cellule epiteliali marcate con il marcatore di apoptosi caspasi tre nel cristallino. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come indurre sperimentalmente la cataratta da V-V-U-V-R e di come studiare il meccanismo molecolare della cataratta indotta da cinque UVR mediante TPCR quantitativa e immunohistochimica.