In elettroporazione ovo nel mesencefalo Chick per lo Studio la funzione dei geni nello sviluppo dopaminergici Neuron

Questo esperimento dimostra l'elettroporazione in ovo del mesencefalo di embrioni di pollo per studiare l'effetto dell'espressione genica esogena sullo sviluppo del mesencefalo e sulla differenziazione dei neuroni dopaminergici. Per prima cosa, iniettare il mesencefalo di embrioni di pollo allo stadio 11 di Hamburger-Hamilton con il plasmide o DNA desiderato, al fine di indirizzare in modo specifico il DNA esogeno nella vescicola mesencefalica in via di sviluppo. Successivamente, utilizzando elettrodi piccoli su misura, elettroporare la vescicola mesencefalica per veicolare il DNA esogeno specificamente nei progenitori neurali del mesencefalo.

Successivamente, isolare embrioni allo stadio 23 con una buona espressione di M cherry nel mesencefalo e generare sezioni trasversali ottimali del mesencefalo. Infine, l'analisi di immunoistochimica per marcatori dei neuroni dopaminergici, come la tirosina idrossilasi, può mostrare la differenziazione dei progenitori neurali in neuroni dopaminergici maturi indotta dall'espressione dei geni di interesse. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi esistenti di elettroporazione in ovo è che questo protocollo permette un'elettroporazione specifica della membrana per studiare la differenziazione dei neuroni dopaminergici.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sullo sviluppo del mesencefalo, può essere applicato anche ad altre parti del sistema nervoso per eseguire analisi di mappatura del destino cellulare e per indagare la regolazione dell'espressione genica. Per ottenere embrioni allo stadio 11 di Hamburger-Hamilton, posizionare ogni uovo fecondato di lato e segnare la sommità con un trattino a matita. Successivamente, posizionare i vassoi su un'altalena all'interno di un incubatore umidificato preriscaldato.

Controllare l'umidità e il livello dell'acqua ogni 24 ore a 41 ore dalla fecondazione. Rimuovere le uova dall'incubatrice e conservarle a temperatura ambiente. Pulire la superficie di ogni uovo con etanolo al 70% e asciugare.

Ora posizionare due pezzi di nastro adesivo da quattro centimetri l'uno accanto all'altro su un uovo in modo da formare un rettangolo più grande sopra il trattino tracciato con la matita. Appiattire il nastro sull'uovo per incorniciare la finestra con una siringa da 10 millilitri collegata a un ago da 18 gauge. Forare il guscio dell'uovo inclinando l'ago lontano dal tuorlo, in modo da non disturbare né danneggiare l'embrione.

Prelevare cinque millilitri di albume dall'uovo. Pulire l'ago con etanolo al 70%. Asciugare l'ago prima di forare l'uovo successivo.

Impostare i parametri per il tiratore di micropipette bruno a fiamma. Quindi, utilizzare un pipettatore P 10 per tirare tubi capillari a parete sottile e formare aghi per iniezione. Aspirare da cinque a dieci microlitri di soluzione plasmidica in una punta capillare di pipetta lunga.

Quindi caricare lentamente l'ago di vetro in una colonna continua priva di bolle d'aria. Posizionare l'ago caricato nel porta-ago collegato al micromanipolatore e al microinjector. Ora, sotto un microscopio stereoscopico e utilizzando uno sfondo scuro per visualizzare meglio l'ago, tagliare l'ago nel punto in cui il liquido verde termina, usando forbici a molla.

Ritagliare una finestra del diametro di due a due centimetri e mezzo dal foro lasciato precedentemente dall'ago. Per prelevare l'albumina. Ruotare l'uovo in una mano mentre si effettua il taglio.

Ricordarsi di pulire le forbici con un fazzoletto di carta imbevuto di etanolo al 70% tra un uovo e l'altro. Procedere quindi a osservare l'embrione di pollo al microscopio stereoscopico. Se necessario, visualizzare l'embrione iniettando sotto l'embrione di pollo dell'inchiostro di India al 20%, filtrato a 0,22 micrometri, in soluzione salina tamponata al fosfato (PBS). Posizionare l'embrione parallelamente al percorso dell'ago, con la testa rivolta lontano dall'ago.

Punzona lentamente il tubo neurale con un angolo di 45 gradi al giunzione tra mesencefalo e romboencefalo. Inizia l'iniezione utilizzando i microiniettori pico spritzer con la durata impostata a 25 millisecondi. Regola il tempo in base alla punta dell'ago, riempiendo solo la vescicola neurale che rappresenta il mesencefalo con DNA plasmidico contenente colorante verde brillante.

Dopo aver recuperato l'ago per iniezione, applicare tre gocce di soluzione penicillina-streptomicina sull'embrione. Verificare le impostazioni del B-T-X-E-M-C eight 30 electro por per un'elettroporazione efficiente. A livello del mesencefalo ventrale, posizionare gli elettrodi al platino personalizzati di forma a L in modo che si trovino allo stesso livello orizzontale rispetto al fondo del tubo neurale, in modo che il mesencefalo embrionale risulti centrato tra i due elettrodi.

Premere una volta l’interruttore a pedale BTX e osservare le bolle d’aria generate intorno agli elettrodi. Dopo ogni elettroporazione riuscita, rimuovere con attenzione gli elettrodi dall’uovo e pulire gli elettrodi. Con un panno chimico imbevuto di etanolo al 70%, aggiungere altre tre gocce di soluzione penicillina-streptomicina sull’embrione.

Ora coprire la finestra con un pezzo di nastro adesivo trasparente per imballaggio di cinque centimetri per cinque centimetri. Senza toccare il contenuto dell'uovo, sigillare bene l'uovo e riposizionare le uova nell'incubatrice con i piatti girevoli spenti. Quando si raggiunge lo stadio desiderato, raccogliere gli embrioni vivi in una comune capsula di Petri riempita con PBS per ogni condizione.

Successivamente, utilizzare un microscopio stereoscopico a fluorescenza. Esaminare gli embrioni raccolti per rilevare l'espressione di mCherry e trasferire gli embrioni positivi in pozzetti singoli di una piastra a 24 pozzetti. Aggiungere in ciascun pozzetto un millilitro di paraformaldeide al 2% appena preparata e incubare per tre ore a quattro gradi Celsius.

Lavare gli embrioni fissati in PBS per 3 volte; posizionare gli embrioni nel 15% di saccarosio fino a quando affiorano in seguito all'equilibrazione. Ripetere l'equilibrazione nel 30% di saccarosio, quindi incorporare ciascun embrione in OCT, orientando correttamente gli embrioni per ottenere sezioni trasversali ottimali del mesencefalo per le analisi successive.

Preparare sezioni criostatiche di 18 micron di spessore del mesencefalo spesso per analisi successive nel saggio di elettroporazione in ovo del mesencefalo di embrione di pollo. Gli embrioni di pollo allo stadio 11 vengono iniettati con un cocktail di plasmidi contenente il marcatore fluorescente m-cherry, geni di interesse e un tracciante colorato con verde brillante per il processo di iniezione. Dopo l'elettroporazione del mesencefalo, gli embrioni vengono ulteriormente incubati e gli embrioni positivi per m-cherry vengono raccolti, fissati e inclusi.

Quindi vengono preparate sezioni crio del mesencefalo. I campioni vengono analizzati mediante immunomarcatura con marcatori del mesencefalo, come la tirosina idrossilasi, in embrioni di pollo correttamente iniettati ed elettroporati. L'espressione di mCherry è tipicamente visibile nella regione del mesencefalo dopo ulteriore sviluppo, utilizzando l'espressione di mCherry come marcatore di iniezione.

Gli embrioni che mostrano un'espressione corretta di m cherry vengono quindi fissati, inclusi ed orientati per preparare sezioni crio del mesencefalo. Qui, la specificazione del destino dopaminergico nei progenitori neurali elettroporati viene esaminata mediante la codistribuzione di m cherry e del gene marcato con flag con il marcatore dei neuroni dopaminergici tirosina idrossilasi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come limitare in modo regionale l'espressione genica ai progenitori dei neuroni dopaminergici del mesencefalo embrionale, inclusa la tecnica di iniezione di costrutti di DNA specificamente nella regione del mesencefalo e come indirizzare con precisione l'elettroporazione utilizzando elettrodi piccoli e personalizzati seguendo questa procedura.

Altri metodi, come il blocco mediato da RNI o l'espressione di potenziatori collegati a geni reporter, possono essere utilizzati per studiare la funzione genica e la regolazione genica in regioni specifiche e in tipi cellulari specifici del sistema nervoso.