Name: Generazione di un immortalato Murine Linea microvascolare Brain Cell endoteliali come In Vitro Blood Cervello Modello barriera (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Impara a generare una linea cellulare endoteliale cerebrale murina immortalizzata per studiare la barriera ematoencefalica in vitro. Questo metodo consente ricerche precliniche su disturbi neuroinfiammatori.

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Questa ricerca è stata sostenuta dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG con il numero di sovvenzione FO 315/4-1 e DFG SFB 688.

1. Isolamento di Brain microvasi <ol><li> Per ogni preparazione utilizzare 5-10 topi neonati di entrambi i sessi (3-5 giorni). </li><li> Euthanize un mouse a seconda locali IACUC / veterinario raccomandazioni, rimuovere il cervello immediatamente, e trasferire in una piastra Petri contenente la seguente soluzione: 15 mM Hepes (pH 7,4), 153 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 2,3 mM CaCl 2 2H 2 x O, 2,6 mM MgCl 2 x 6H 2 O, 1% (w / v) BSA (di seguito denominato come tampone A). </li><li> Se non diversamente indicato, tutte le procedure di isolamento deve essere eseguita a temperatura ambiente (RT) (22-24 ° C) sotto la cappa a flusso laminare. Tagliare i cervelli (cervello senza cervelletto e tronco encefalico), dopo la rimozione delle meningi e frammenti capillari, in tampone A utilizzando un bisturi sterile. Pipettare il tessuto frammenti su e giù con una pipetta 10 ml fino a quando non appaiono grumi. Trasferire la sospensione in un tubo Falcon da 50 ml e centrifugare a 250 xg per 5 min a RT. </li></ol> Nota: Meningi possono essere identificati come sottili membrane trasparenti alla superficie del tessuto cerebrale. Essi possono essere accuratamente rimosso con una pinza sterile. <ol start="4"><li> Eliminare il surnatante. </li><li> Sciogliere il precipitato in 4,5 ml di tampone A con 1,5 ml di 0,75% (w / v) di collagenasi / dispasi (Roche) e incubare per 45 min a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua (occasionalmente agitazione). </li><li> Nel frattempo, preparare le piastre da 12 pozzetti con rivestimento quattro pozzetti con collagene IV (0,1 mg / ml sciolti in 50 mM di acido acetico). Consentono di aderire per 1 ora. </li><li> Arrestare la digestione mediante aggiunta di 15 ml di tampone ghiacciato A. risospendere il pellet accuratamente. </li><li> Centrifugare la sospensione a 250 xg per 10 min a RT. </li><li> Eliminare il surnatante. </li><li> Per rimuovere mielina, aggiungere 10 ml 25% (w / v) BSA (Sigma, purezza&gt; 98%) e centrifugare a 1000 xg per 20 min a 4 ° C. BSA 25% deve essere sciolto in PBS 1x (PAA Laboratories) e filtrata attraverso f 0,2 micronilter). </li><li> Eliminare attentamente il supernatante, sciogliere il precipitato in 10 ml di tampone A e trasferire in una nuova provetta Falcon. </li><li> Centrifugare la sospensione a 250 xg per 5 min a RT. Il pellet risultante contiene le cellule endoteliali. </li><li> Lavare due volte il collagene IV rivestita 12-pozzetti con PBS. </li><li> Risospendere il pellet in 4 ml di mezzo di crescita (DMEM contenente 10% FCS, 50U/ml penicillina / streptomicina, 1% di L-glutammina) e la piastra di sospensione cellulare in due pozzetti, 2 ml per ciascun pozzetto. Aggiungere la puromicina ad una concentrazione finale di 4 mg / ml e incubare per 45 min a 37 ° C in un incubatore per colture cellulari. Questo passaggio consente la rimozione di cellule in rapida aderenti Nota:. Puromicina è aggiunto per 24 ore. Solo cervello EC può metabolizzare, per altri tipi cellulari puromicina è tossico 14. </li><li> Trasferire il 2 ml di terreno contenente le cellule non aderenti dal passo 1,14 in due pozzetti freschi (questi pozzetti contengono la frazione CE). Riempire i pozzetti con cellule aderenti da step 1,14 con 2 ml di mezzo fresco (questi pozzetti contengono altri tipi di cellule, ad esempio, fibroblasti e astrociti possono essere coltivate in parallelo e utilizzato per il confronto di morfologia). </li><li> Modificare il mezzo il giorno seguente. </li></ol> 2. Immortalando le cellule cerebrali endoteliali microvascolari <ol><li> Coltivare il GP + E-86 Neo (GPENeo) 15 fibroblasti, che secernono una replica carente di virus con oncogene polioma centrale T in mezzo DMEM contenente 10% FCS inattivato al calore, 50U/ml penicillina / streptomicina, e 2 mg / ml di G418 ( . PAA Laboratories) in gelatina fiasche rivestite Nota: Polyoma metà trasfezione oncogene T provoca vantaggio di crescita delle cellule endoteliali nel non-ECS portando ad un monostrato omogeneo di cellule con morfologia endoteliale 4 a 6 settimane della cultura. GPENeo non sono disponibili in commercio e possono essere ottenuti come comune materiale pubblico (si prega di fare riferimento a pubblicazioni originali 4,16). </li><li> Per utilizzare il virus per mezzo contenente<html> immortalizzazione, coltivare le cellule in GPENeo G418 terreno privo per 24 ore. </li><li> Rimuovere 10 ml del surnatante e aggiungere GPEneo Polybrene (hexadimethrine bromuro) (Sigma) ad una concentrazione finale di 8 mg / ml, sterilizzare mediante 0,45 micron filtro per rimuovere i frammenti cellulari. </li><li> Rimuovere il terreno di crescita dalle culture CE preparati nella Parte 1 e aggiungere 2 ml di surnatante GPEneo / Polybrene miscela nei pozzetti. Ripetere il giorno dopo con un fresco GPEneo supernatante / Polybrene miscela Nota:. Polybrene è usato per fare pori nella parete cellulare di facilitare l&#39;infezione con particelle virali). </li><li> Rimuovere il surnatante / Polybrene GPEneo miscela il giorno seguente, lavare le cellule due volte con PBS e mantenere le cellule nel mezzo di crescita cambiandolo ogni 3 giorni. Alla confluenza, dividere le celle 1:2 su collagene IV piastre rivestite. </li><li> In genere, stabili cerebrali endoteliali (CEND) linee cellulari devono essere ottenuti dopo 4-5 settimane. </li></ol>e &quot;&gt; 3. coltivando le cellule endoteliali microvascolari cerebrali <ol><li> Scongelare le cellule di cryoaliquot a bagnomaria e il trasferimento in 15 ml-Falcon con 10 ml di pre-riscaldato media. </li><li> Centrifugare la sospensione a 250 xg per 5 min a RT. </li><li> Rimuovere medie, trasferire il pellet nel collagene IV rivestita T 25 cm 2 pallone di coltura cellulare con pre-riscaldato mezzo di crescita (densità cellulare per placcatura dovrebbe essere di almeno 1 x 10 4 cellule / ml). </li><li> Cambiare media il giorno dopo e dopo che le cellule raggiunto confluenza (in genere dopo 5 giorni) dividere le celle. </li></ol> 4. La divisione della CEND-cellule (Nota: La divisione dovrebbe essere fatto solo una volta a settimana, evitare di spaccare superiore a 1:4). <ol><li> Estrarre il supporto, lavare le cellule con PBS. </li><li> Aggiungere 3 ml di tripsina-EDTA caldo soluzione (PAA Laboratories) (T 75 cm 2 beuta), incubare a 37 ° C e attendere strato di cellule viene disperso (di solito entro 5 a 15 minuti). </li><li> Aggiungere 5 ml ocrescita media f, pipettare su e giù, e il trasferimento ad un nuovo collagene IV rivestita pallone. </li></ol> 5. Congelamento dei CEND-cellule <ol><li> Ottenere la sospensione cellulare come descritto nel passaggio 4 </li><li> Centrifugare la sospensione a 250 xg per 5 min a RT. </li><li> Risospendere il pellet cellulare (ottenuto da 1 T 75 cm 2 pallone) in 6 ml di mezzo di congelamento (95% mezzo di crescita, 5% DMSO). </li><li> Dividere la sospensione cellulare in quattro 1,5 ml crio-aliquote. Nota: un crio-aliquota può essere seminato su T 25 cm 2 pallone. </li><li> Conservare i-aliquote congelate a temperatura azoto liquido vapore. </li></ol> CEND terreno di crescita: 450 ml DMEM, 10% FCS, 10 ml L-glutammina, 2% MEM-Kit, 2% NEAA, piruvato natrium 10 ml, 50 U / ml di penicillina / streptomicina 6. Risultati rappresentativi Le cellule CEND e cerebEND sono stati caratterizzati da immunostainings endoteliale di unnd BBB marcatori nonché da misure di transendoteliale resistenza elettrica (TEER) e permeabilità. Il CEND e cerebEND aveva una morfologia simile a colture primarie di cervello ECS, con monostrati di cellule allungate, serrato che mostravano inibizione della crescita a confluenza. Le cellule esprimono livelli rilevabili di ben claudina-5, occludina e VE-caderina proteine ​​che sono state localizzate le giunzioni cellula-cellula, come mostrato mediante immunofluorescenza (Figura 3) 4,5. Coltivazione di cellule in CEND siero ridotto medie portato ad un aumento TEER (da 150 Qcm 2 in presenza di 10% siero di 500 Qcm 2 in presenza di 2% di siero), che è stato potenziato con l&#39;aggiunta di idrocortisone (800 Qcm 2) o insulina (1000 Qcm 2) 4. Monostrati di CEND coltivati ​​in siero ridotto mezzo per 21 giorni era di 900 Qcm TEER 2 (Figura 4). TEER è stata misurata utilizzando un assiemecontenenti elettrodi di corrente e tensione passeggera di misura Strumenti di precisione (Mondo). Per confronto, il primario microvascolare cervello EC è stato segnalato per avere valori di 200-600 Teer Qcm 2 e una linea cellulare disponibile in commercio del mouse bEnd.3 avuto Teer valori di 100-140 Qcm 2 (per la revisione recente si veda Abate 2005 e Toth et al., 2011 17,18). Inoltre, il passaggio di macromolecole, come la non-carica FITC-destrano delle masse molecolari 4, 10, 70 e 500 kDa, o fluoresceina (300 Da) attraverso il monostrato di CEND in terreno di differenziamento 2% FCS oltre 4 ore è diminuito rispetto a cellule di controllo mantenute in terreno di crescita contenente 10% FCS: flusso paracellulare è ridotto al 30% di cellule di controllo per la fluoresceina, al 26% di FITC-destrano 10 e 70 kDa, ed il flusso è stato ridotto a 4,5% di cellule di controllo per FITC -dextrtan 500 kDa. Simile a Teer valori, la permeabilità era al livello più basso nelle cellule coltivate in presenza di Glucocorticoids (GC) 4. In ulteriori studi, sono stati identificati i geni bersaglio glucocorticoidi, occludina, claudina-5 e VE-caderina in endotelio vascolare cerebrale 4,7,9. Trattamento GC portato ad un aumento della espressione di queste proteine ​​e al riarrangiamento di VE-caderina al citoscheletro. La diretta GC-mediata regolazione della stretta giunzione proteine ​​occludina e claudina-5 appare attraverso elementi di risposta GC nelle loro regioni promotrici 4,7,19. Inoltre, claudina-5 è stato identificato come un bersaglio estrogeni romanzo in endotelio vascolare 10. Alla base di disfunzioni endoteliali molte malattie differenti. Abbiamo colto il CEND sotto ossigeno / glucosio deprivazione (OGD) condizioni. OGD portato alla interruzione della funzione BBB, che potrebbe essere ricostituita dopo il trattamento combinato con GC e inibitore del proteasoma bortezomib 12. Condizioni OGD portato ad un forte aumento del glucosio e nell&#39;espressione di traspor glucosioTERS in cerebEND, che potrebbe essere attenuata mediante l&#39;aggiunta di mk801, un inibitore non competitivo del recettore NMDA-13. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig1.jpg" /> Figura 1. Morfologia del cervello cellule endoteliali microvascolari (CEND) una settimana dopo l&#39;isolamento. Immagini microscopia ottica sono stati presi sotto il 6x (A) e 15x (B) ingrandimento. Le colonie isola-formate di cellule endoteliali sono visibili. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig2.jpg" /> Figura 2. Morfologia del cervello cellule endoteliali microvascolari (CEND) un mese dopo l&#39;isolamento e immortalizzazione. Immagini microscopia ottica sono state scattate sotto l&#39;ingrandimento 15x. Un confluenti, monostrato omogeneo cellule endoteliali possono essere osservati. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig3.jpg" /> Figura 3. Cervello microvascul Immortalatoar cellule endoteliali esprimono claudina-5, occludina e VE-caderina. CEND cellule sono state coltivate su collagene IV rivestite coprioggetto e colorate con anticorpi contro claudina-5 (A), occludina (B) e VE-caderina (C). Le immagini sono state scattate con un microscopio Zeiss Axioscop2 sotto l&#39;ingrandimento 40x. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig4.jpg" /> Figura 4. Misura della resistenza elettrica transendoteliale (TEER) del CEND monostrato. CEND sono state coltivate su collagene IV rivestite filtri transwell (dimensione dei pori 0,4 micron). Dopo aver raggiunto la confluenza, le cellule sono state mantenute in terreno contenente 2% di FCS. TEER è stata misurata dopo 7, 14 e 21 con un assembly che contiene elettrodi di corrente e tensione passeggera di misurazione.

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<li>Minagar, A., Alexander, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+disruption+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mult.+Scler%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 9, 540(2003).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La procedura descritta può essere utilizzato per l&#39;isolamento di microvascolare ECS di diversi ceppi di topi nonché da diversi knock-out ceppi di topo per studiare le variazioni specifiche funzione vascolare. Come metodo di immortalizzazione abbiamo utilizzato la trasformazione con oncoproteina di poliomavirus murino, Polyoma mezzo antigene T. Si trasforma rapidamente immature cellule endoteliali in vivo e in vitro 20,21,22. Altri metodi di immortalizzazione di ECs descritti in letteratura includono per esempio l&#39;immortalizzazione con SV40 antigene T grande di Simian Virus vacuolizzante 40 23, prodotto genico adenovirus E1A 24 o sovraespressione della subunità catalitica della telomerasi umana 3. L&#39;immortalizzazione con PymT è specifico per il murina EC immaturo, che consente di ottenere una cultura omogenea CE da topi neonati in breve tempo. Immortalizzazione modifica le proprietà delle cellule e THrisultati ottenuti elettroniche con linee cellulari immortalizzate devono essere confrontati sia con cellule primarie o con esperimenti in vivo con topi. PymT immortalato CE è stato descritto per esprimere elevati livelli di attività fibrinolitica risultanti dalla produzione aumentata di urochinasi, attivatore del plasminogeno di tipo e diminuita produzione di plasminogeno inibitori 25. Confronto diretto PymT immortalato bEND5 linea cellulare con primario EC rivelato che sia in vitro modelli BBB sono adatti per studi di adesione cellulare T 26. Le linee cellulari stabilite secondo la procedura descritta può essere utilizzata al numero passaggio basso per mantenere le proprietà di barriera per l&#39;espressione di proteine ​​BBB e CE giunzionali, come cellule perdono queste proprietà durante l&#39;invecchiamento. Così dopo la perdita di proprietà barriera, la preparazione di una nuova linea cellulare dovrebbe essere considerato. Placcatura densità delle cellule dovrebbe essere alto per EC, in quanto questo è un fattore critico per la proliferazione cellulare. Questo deve essere considerato nel corso della procedura di isolamento, nonché il mantenimento della immortalato EC. Ogni linea cellulare dovrebbe essere testato per le sue proprietà di barriera e di eventuali contaminanti con altri tipi cellulari. Monostrati CE può essere trattata con l&#39;antigene muscolare anti-galactocerebroside, anti-proteina acidica fibrillare gliale e anti-liscia come anticorpi primari per escludere la contaminazione con gli oligodendrociti, astrociti e periciti 4,27. Per escludere la contaminazione da vascolatura meningal, l&#39;espressione di trombomodulina può essere testata, che è espresso in tutti i letti vascolari con l&#39;eccezione del cervello 28. È interessante notare che le linee cellulari immortalizzate microvascolari endoteliali isolate da differenti regioni del cervello si differenziano per le loro proprietà di barriera e la suscettibilità a stimoli pro-infiammatori. Come esempio, i CEND cerebrale e cerebellare linee cellulari cerebEND possono citare 4,5. CerebEND mostrato, in confrontoa CEND, più bassi livelli di espressione delle principali componenti di giunzione strette claudina-1 e occludina. Tuttavia, i livelli di claudina-3 e -12 erano più elevati nei cerebEND. La funzione di barriera di cellule cerebEND sofferto molto più sotto un trattamento con il mediatore infiammatorio, TNFa che le proprietà di barriera di cellule CEND fatto 5. Maggiore vulnerabilità cerebellare a stimoli infiammatori, può essere osservato in vivo in pazienti con sclerosi multipla e nel suo modello sperimentale animale di encefalomielite autoimmune 29. Questi risultati interessanti mostrano la necessità di generare e caratterizzare individuale modelli in vitro per diverse regioni del cervello, per migliorare il farmaco futuro mira nel cervello.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td> Purezza&gt; 98% </td></tr><tr><td> collagene IV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5533 </td><td> 50 ug / ml in 50 mM di acido acetico </td></tr><tr><td> Collagenasi / dispasi </td><td> Roche </td><td> 10269638001 </td><td></td></tr><tr><td> Mezzo di Dulbecco Eagle modificato (DMEM) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> Dimetilsolfossido (DMSO) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Calf Serum (FCS) </td><td> PAA Laboratories </td><td> A15110-1333 </td><td> concentrazione finale del 10%, inattivato al calore (30 min a 56 ° C) </td></tr&gt; <tr><td> L-glutammina </td><td> Biochrom AG </td><td> K0282 </td><td> Conservazione: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> MEM Vitamine </td><td> Biochrom AG </td><td> K0373 </td><td> Conservazione: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> Na-piruvato </td><td> Biochrom AG </td><td> L0473 </td><td></td></tr><tr><td> Neomicina (G418) </td><td> PAA Laboratories </td><td> P11-012 </td><td></td></tr><tr><td> Non aminoacidi essenziali (NEA) </td><td> Biochrom AG </td><td> K0293 </td><td> Conservare a 4 ° C </td></tr><tr><td> Penicilin / streptomicina </td><td> Biochrom AG </td><td> A2212 </td><td> Conservazione: ≤ -15 ° C </td></tr><tr><td> Tampone fosfato salino (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td></td></tr><tr><td> Polibrene (hexadimethrine bromuro) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 107689 </td><td> 0,8 mg / ml in PBS, conservazione a -20 ° C </td></tr><tr><td> Puromicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina / EDTA </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td> 0,05%, 0,02% EDTA in PBS </td></tr></tbody></table>

generazione di un immortalato murine linea microvascolare brain cell endoteliali come<em&gt; in vitro</em&gt; blood cervello modello barriera

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Cellule epiteliali ed endoteliali (EC) sono paracellulare costruzione di barriere che proteggono il tessuto dall&#39;ambiente esterno e interno. La barriera emato-encefalica (BBB), composto da CE, astrociti finali piedi, periciti e la membrana basale è responsabile per la protezione e l&#39;omeostasi del parenchima cerebrale. Modelli in vitro BBB sono strumenti comuni per studiare la struttura e la funzione del BBB a livello cellulare. Un numero considerevole di diversi modelli in vitro BBB sono stati stabiliti per la ricerca in laboratori diversi fino ad oggi. Solitamente, le cellule sono ottenute da bovini, suini, cervello di ratto o topo tessuto (discusso in dettaglio nella rassegna di Wilhelm et al. 1). Campioni di tessuti umani sono disponibili solo in un numero limitato di laboratori o società 2,3. Mentre preparazioni di cellule primarie sono in termini di tempo e le culture della CE può variare da lotto a lotto, la creazione di immortalato CE lines è al centro di interesse scientifico. Qui vi presentiamo un metodo per stabilire una linea immortalato cervello microvascolare CE, dal cervello di topo neonatale. Descriviamo il passo-passo la procedura profilo reagenti e le soluzioni utilizzati. Il metodo stabilito dal nostro laboratorio permette l&#39;isolamento di una linea omogenea immortalato cellule endoteliali entro quattro o cinque settimane. Le linee di cellule microvascolari cerebrali endoteliali definito CEND 4 (da corteccia cerebrale) e cerebEND 5 (da corteccia cerebellare), sono stati isolati secondo questa procedura in laboratorio Förster e sono state effettivamente utilizzate per la spiegazione dei diversi processi fisiologici e patologici a BBB. Utilizzando CEND e cerebEND abbiamo dimostrato che queste cellule rispondono a glucocorticoidi 4,6-9 ed estrogeno-trattamento 10 nonché a pro-infammatory mediatori, come TNFalfa 5,8. Inoltre, abbiamo studiato la patologia multiple sclerosis 11 e ipossia 12,13 sul CE-livello. Il CEND e linee cerebEND può essere considerata un valido strumento per studiare la struttura e la funzione delle risposte, BBB cellulari di EC per diversi stimoli o interazione del CE con linfociti o cellule tumorali.

Questo metodo descrive come isolare e immortalare cellule endoteliali microvascolari di cervello di topo. Descriviamo un passo-passo protocollo partire dalla omogeneizzazione del tessuto cerebrale, mineralizzazione, semina e immortalizzazione delle cellule. Di solito, ci vogliono circa cinque settimane per ottenere una omogenea, immortalato linea microvascolare delle cellule endoteliali.

Generazione di un immortalato Murine Linea microvascolare Brain Cell endoteliali come<em&gt; In Vitro</em&gt; Blood Cervello Modello barriera

Le cellule epiteliali e endoteliali (EC) costituiscono barriere paracellulari che proteggono il tessuto dall'ambiente esterno e interno. Il...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere una coltura omogenea di cellule endoteliali cerebrali immortalizzate. Ciò viene raggiunto isolando innanzitutto i cervelli di topi neonati ed ottenendo una sospensione cellulare singola. Il secondo passaggio consiste nell'immortalizzare le cellule mediante l'antigene T medio del poliomavirus.Successivamente, le cellule crescono per circa quattro settimane fino a formare un monolayer endoteliale omogeneo. L'ultimo passaggio consiste nel caratterizzare la nuova linea cellulare mediante tecniche come l'immunomarcatura, il Western blot e la Q-Q-P-C-R. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia di disturbi cerebrali neuroinfiammatori o ischemici, poiché è possibile ottenere una valutazione preclinica delle terapie e approfondimenti sulla patofisiologia.La procedura sarà dimostrata dal Dott. Elaine Salvador, un postdottorando del mio laboratorio. Dopo aver rimosso il cervello di un topo neonato di tre-cinque giorni e trasferito in una piastra di Petri contenente tampone A, sono necessari i cervelli di cinque-dieci topi per ogni preparazione, operando in una cappa a flusso laminare. Rimuovere il cervelletto, il tronco encefalico, le meningi e i frammenti capillari da ciascun cervello.Quindi trasferire i cervelli in una seconda piastra di Petri contenente il buffer A. Utilizzare un bisturi sterile per tagliare i cervelli in piccoli pezzi, quindi aspirare ed espellere il tessuto e il buffer con una pipetta da 10 millilitri fino a quando non compaiono grumi. A questo punto, trasferire la sospensione in un tubo da centrifuga da 50 millilitri dopo aver centrifugato il tessuto cerebrale a 250 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente. Eliminare il soprannatante e sciogliere il pellet in 4,5 millilitri di buffer A aggiungendo 1,5 millilitri di una soluzione al 0,75% peso/volume.Collagenasi dis porre. Incubare il tessuto e la soluzione di collagenasi per 45 minuti in un bagno a 37 gradi Celsius con agitazione occasionale. Nel frattempo, preparare le piastre per colture cellulari rivestendo quattro pozzetti di una piastra a 12 pozzetti con una soluzione sterile di 0,1 milligrammi per millilitro.Collagene IV e acido acetico 50 millimolari consentono al collagene di aderire alle pozzette a temperatura ambiente per un'ora. Una volta trascorso il periodo di incubazione di 45 minuti, arrestare la digestione del tessuto cerebrale aggiungendo 15 millilitri di buffer A e risospendere accuratamente il pellet in questa soluzione. Quindi centrifugare a 250 ×g per 10 minuti e scartare il soprannatante.Successivamente, per rimuovere la mielina dal preparato, aggiungere 10 millilitri di BSA al 25% peso/volume, sterile, in PBS al tessuto e centrifugare a 1000 ×g per 20 minuti a 4 °C. Al termine della centrifugazione, scartare con attenzione il soprannatante, quindi risospendere il pellet in 15 millilitri di buffer A e trasferire in un nuovo tubo da centrifuga da 50 millilitri; quindi centrifugare nuovamente a 250 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, lavare due volte la piastra rivestita di collagene IV con PBS.Dopo il secondo lavaggio, lasciare due dei pozzetti vuoti e aggiungere due millilitri di terreno di crescita negli altri due pozzetti. Dopo aver eliminato il sopranatante, risospendere il pellet cellulare, composto principalmente da cellule endoteliali, in quattro millilitri di terreno di crescita contenente quattro microgrammi per millilitro di puromicina, e piastrare due millilitri della sospensione cellulare in ciascuno dei due pozzetti vuoti rivestiti con collagene; incubare a 37 gradi Celsius per 45 minuti per eliminare le cellule non endoteliali che aderiscono rapidamente. Successivamente, aspirare il terreno di crescita dai due pozzetti che non contengono cellule e scartarlo.Quindi trasferire il mezzo contenente le cellule non aderenti, che include la frazione di cellule endoteliali, in queste due pozzette. Ricaricare le pozzette precedenti con due millilitri di mezzo fresco. Queste pozzette contengono altri tipi cellulari, come fibroblasti e astrociti, e possono essere coltivate in parallelo e utilizzate per confronti della morfologia.Incubare le cellule durante la notte nell'incubatore per colture cellulari il giorno successivo. Sostituire con mezzo fresco e coltivare i fibroblasti GPE neo, che secernono un virus con deficit di replicazione contenente l'oncogene T medio di poliomavirus in fiaschi rivestiti di gelatina contenenti GPE neomed. La trasfezione con l'oncogene T medio di poliomavirus induce un vantaggio proliferativo delle cellule endoteliali rispetto alle cellule non endoteliali, portando alla formazione di un monolayer omogeneo di cellule con morfologia endoteliale. Dopo quattro-sei settimane di coltura, le cellule GPE neo non sono disponibili in commercio e possono essere ottenute come materiale condiviso pubblico.Dopo aver coltivato le GPE Neo Fiberblast per 24 ore, rimuovere 10 millilitri del mezzo e aggiungere soluzione sterile di poli-brain fino a una concentrazione finale di otto microgrammi per millilitro. Far passare la miscela del soprannatante attraverso un filtro da 0,45 micron per rimuovere eventuali frammenti cellulari. Aspirare ora il mezzo dalle colture di cellule endoteliali e aggiungere due millilitri della miscela di soprannatante con poli-brain ai pozzetti dopo un'incubazione notturna.Ripetere questa procedura il giorno successivo con un'aliquote fresca della miscela poli-cervello del surnatante. Rimuovere la miscela poli-cervello del surnatante. Lavare le cellule due volte con PBS e quindi aggiungere mezzo di crescita fresco.Continuare a cambiare il mezzo di crescita ogni tre giorni quando le cellule diventano confluenti; passare le cellule da uno a due su piastre rivestite di collagene. Di solito si ottengono linee cellulari stabili di endotelio cerebrale dopo quattro o cinque settimane di coltura successiva.Quando un monostrato endoteliale omogeneo ricopre completamente l'intero pozzetto. Una volta ottenute le linee cellulari stabili, trasferire le cellule in fiaschi per coltura tissutale rivestiti di collagene IV, passando le cellule non più di una volta alla settimana mediante tripsina con tre millilitri di tripsina-EDTA e incubazione a 37 gradi Celsius per cinque-quindici minuti, fino a quando il monostrato cellulare risulta disperso. Dopo l'aggiunta di cinque millilitri di mezzo, seminare nei nuovi fiaschi, evitando di suddividere in rapporti superiori a 1:4.Una volta ottenuto un numero sufficiente di cellule per riempire in modo confluenziale un fiasco T 75, è possibile preparare aliquote criogeniche delle cellule per un uso successivo. Per fare ciò, raccogliere le cellule con tripsina come in precedenza, quindi centrifugare la sospensione cellulare a 250 volte G per cinque minuti. A temperatura ambiente, risospendere il pellet cellulare in sei millilitri di mezzo congelante, quindi pipettare 1,5 millilitri della sospensione cellulare in quattro vial criogenici.Posizionare le provette criogeniche in un contenitore per congelamento Nalgene riempito con isopropanolo e mantenerle per un giorno a meno 80 gradi Celsius. Infine, conservare le provette criogeniche in azoto liquido. Scongelare il pellet criogenico di cellule in un bagno a bagno maria e poi trasferirle in un tubo da centrifuga da 15 millilitri contenente 10 millilitri di terreno di crescita.Riscaldare il mezzo a 37 gradi Celsius e centrifugare il tubo a 250 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo aver aspirato il mezzo, risospendere il pellet in un volume appropriato di mezzo di crescita. Trasferire la sospensione cellulare in un fiasco per coltura cellulare T25 rivestito con collagene IV contenente mezzo di crescita preriscaldato.La densità cellulare per la semina dovrebbe essere almeno di un milione di cellule per millilitro. Cambiare il mezzo il giorno successivo e continuare a passaggiare le cellule come in precedenza quando le cellule raggiungono la confluenza, circa cinque giorni dopo; a quel punto, seminare le cellule alla densità desiderata per i successivi esperimenti. Le cellule C end sono state caratterizzate mediante colorazione immunoistochimica per marcatori endoteliali e della barriera ematoencefalica.Questa immagine mostra la morfologia delle cellule C e la colorazione immunoistochimica per la clain cinque. Le cellule C presentano una morfologia simile a quella delle colture primarie di ECS cerebrali, con monolayer di cellule allungate strettamente impacchettate che mostrano inibizione della crescita. Alla confluenza, le cellule esprimono livelli rilevabili di clain.Qui le cellule C CN sono state sottoposte a immunomarcatura con un anticorpo contro l'occludina. Qui osserviamo l'espressione delle proteine VE-caderina, localizzate alle giunzioni intercellulari, come mostrato nuovamente mediante colorazione di immunofluorescenza. La resistenza elettrica transendoteliale è stata misurata utilizzando un dispositivo contenente elettrodi per il passaggio di corrente e per la misurazione della tensione.Da questa figura si può osservare che la resistenza elettrica transendoteliale delle cellule C end aumenta nel tempo in coltura dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare i disturbi cerebrovascolari in un modello murino.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Istituzione di modelli umani della barriera emato-encefalica (BBB) ​​può beneficiare la ricerca sulle condizioni del cervello connesse con il fallimento BBB. Descriviamo qui una tecnica migliorata per la preparazione di un modello BBB contatto, che consente coculturing di astrociti e cellule endoteliali cervello sui lati opposti di una membrana porosa.

Migliorata metodo per la preparazione di un cell-based, Contact modello umano della barriera sanguigna del cervello

Lo scopo di questo studio era di convalidare la riproducibilità di un modello in vitro BBB coinvolge un singenici ratto co-coltura delle cellule endoteliali e astrociti. Il monostrato di cellule endoteliali presentato TEER alta e bassa permeabilità LY. Espressione di proteine ​​TJ specifici, sono state valutate le risposte funzionali ai infiammazione e la funzionalità dei trasportatori e recettori.

Istituzione di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello di Rat barriera emato-encefalica (BBB): A Focus on BBB impermeabilità e Trasporti recettore-mediata

Le cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) sono interconnesse da specifiche proteine giunzionali che formano una barriera altamente regolata che separa il sangue e il sistema nervoso centrale (SNC), la cosiddetta barriera emato-encefalica (BBB). L'isolamento delle cellule endoteliali microvascolari primarie del cervello murino, come discusso in questo protocollo, consente studi dettagliati in vitro della BEE.

Isolamento di cellule primarie murini cervello microvascolare endoteliali

Qui, descriviamo un modello murino in vitro della barriera emato-encefalica che fa uso della spettroscopia delle cellule di impedenza, con particolare attenzione alle conseguenze sull'integrità e la permeabilità delle cellule endoteliali in seguito all'interazione con le cellule T attivate.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello della barriera emato-encefalica Utilizzando spettroscopia di impedenza: un focus sui T Cell-endoteliale cellulare Interazione

Il mantenimento della copertura della barriera emato-sangue è fondamentale per l'omeostasi del sistema nervoso centrale. Questo protocollo descrive tecniche in vitro per delineare i processi fondamentali e patologici che modulano la copertura della barriera emato-sangue.

In vitro dosaggi per valutare la formazione e la rottura del vaso come la barriera emato-cerebrale

L'obiettivo del protocollo è di presentare una procedura ottimizzata per la creazione di un modello in vitro barriera ematomeningea (BBB) basato sulle cellule endoteliali cerebrali primari porcina (pBECs). Il modello mostra un'elevata riproducibilità, alta tenuta ed è adatto per studi di trasporto e traffico intracellulare nella scoperta della droga.

Migliorato il metodo per la creazione di un In Vitro barriera emato - encefalica modello basato sulle cellule endoteliali Porcine cervello

La barriera emato-encefalica umana previene selettivamente la penetrazione di molecole idrofile e patogeni nel cervello. Diverse patologie, tra cui meningite e delirio postoperatorio, sono associate a una maggiore permeabilità della barriera emato-encefalica. Qui, descriviamo un modello di coltura cellulare endoteliale per testare la permeabilità della barriera mediante attraversamento microbico.

Analisi della permeabilità della barriera sangue-encefalica attraverso l'attraversamento microbico attraverso le cellule endoteliali microvascolari

La barriera emato-encefalica (BBB) è un'unità neurovascolare multicellulare che regola strettamente l'omeostasi cerebrale. Combinando gli iPSC umani e le tecnologie organ-on-chip, abbiamo generato un chip BBB personalizzato, adatto per la modellazione delle malattie e le previsioni di penetrazione dei farmaci del SNC. Viene descritto un protocollo dettagliato per la generazione e il funzionamento del chip BBB.

Generazione di un chip di barriera emato-encefalica basata sull'iPSC umano

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo adattato per derivare, espandere e crioconservare le cellule endoteliali microvascolari cerebrali ottenute differenziando le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo e per studiare le proprietà della barriera eculare nel sangue in un modello ex vivo.

Derivazione, espansione, crioconservazione e caratterizzazione di cellule endoteliali microvascolari cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Qui, descriviamo un protocollo, il metodo di coltura cellulare endoteliale estesa (EECM), che consente la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti in cellule simili alle cellule endoteliali microvascolari del cervello (BMEC). Queste cellule mostrano l'espressione della molecola di adesione delle cellule endoteliali e sono quindi un modello di barriera emato-encefalica umana adatto a studiare le interazioni delle cellule immunitarie in vitro.

Differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte umane in cellule simili a cellule microvascolari simili a cellule endoteliali microvascolari del cervello con un fenotipo immunitario maturo

Impara a generare una linea cellulare endoteliale cerebrale murina immortalizzata per studiare la barriera ematoencefalica in vitro. Questo metodo consente ricerche precliniche su disturbi neuroinfiammatori.

Generazione di un immortalato Murine Linea microvascolare Brain Cell endoteliali come

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