Generazione di un immortalato Murine Linea microvascolare Brain Cell endoteliali come In Vitro Blood Cervello Modello barriera

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere una coltura omogenea di cellule endoteliali cerebrali immortalizzate. Questo risultato si ottiene innanzitutto isolando i cervelli di topi neonati ed ottenendo una sospensione di singole cellule. Il secondo passaggio consiste nell'immortalizzare le cellule mediante l'antigene T medio del polioma.

Successivamente, le cellule vengono fatte crescere per circa quattro settimane fino a quando non si forma un monostato endoteliale omogeneo. L'ultimo passaggio consiste nel caratterizzare la nuova linea cellulare mediante tecniche come l'immunomarcatura, il Western blot e la Q-Q-P-C-R. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle malattie cerebrali neuroinfiammatorie o ischemiche, poiché è possibile ottenere una valutazione preclinica delle terapie e approfondimenti sulla fisiopatologia.

La procedura sarà dimostrata dal Dott. Elaine Salvador, un ricercatore postdottorato del mio laboratorio. Dopo aver rimosso il cervello di un topo neonato di tre-cinque giorni e trasferito in una piastra di Petri contenente buffer A, sono necessari i cervelli di cinque-dieci topi per ogni preparazione, operando in una cappa a flusso laminare. Rimuovere il cervelletto, il tronco encefalico, le meningi e i frammenti capillari da ciascun cervello.

Quindi trasferire i cervelli in una seconda piastra di Petri contenente il buffer A. Utilizzare un bisturi sterile per tagliare i cervelli in piccoli pezzi, quindi usare una pipetta da 10 millilitri per aspirare ed espellere il tessuto e il buffer fino a quando non compaiono grumi. A questo punto, trasferire la sospensione in un tubo da centrifuga da 50 millilitri dopo aver centrifugato il tessuto cerebrale a 250 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente. Scartare il soprannatante e risospendere il pellet in 4,5 millilitri di buffer A con 1,5 millilitri di una soluzione al 0,75% peso/volume.

Disporre il collaghenasi. Incubare il tessuto e la soluzione di collaghenasi per 45 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius con agitazione occasionale. Nel frattempo, preparare le piastre per colture cellulari rivestendo quattro pozzetti di una piastra a 12 pozzetti con una soluzione sterile di 0,1 milligrammi per millilitro.

Collagene quattro e acido acetico 50 millimolari consentono al collagene di aderire alle pozzette a temperatura ambiente per un'ora. Una volta trascorso il periodo di incubazione di 45 minuti, interrompere la digestione del tessuto cerebrale aggiungendo 15 millilitri di buffer A e risospendere accuratamente il pellet in questa soluzione. Successivamente, centrifugare a 250 ×g per 10 minuti e scartare il soprannatante.

Successivamente, per rimuovere la mielina dalla preparazione, aggiungere 10 millilitri di BSA (sieralbumina bovina) sterile al 25% peso/volume in PBS al tessuto e centrifugare a 1000 ×g per 20 minuti a 4 °C. Dopo la centrifugazione, scartare con attenzione il soprannatante, quindi sciogliere il pellet in 15 millilitri di buffer A e trasferire in un nuovo tubo da centrifuga da 50 millilitri; centrifugare nuovamente a 250 ×g per 5 minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, lavare la piastra rivestita con collagene IV due volte con PBS.

Dopo il secondo lavaggio, lasciare due dei pozzetti vuoti e aggiungere due millilitri di mezzo di crescita negli altri due pozzetti. Dopo aver eliminato il sopranatante, risospendere il pellet cellulare, composto principalmente da cellule endoteliali, in quattro millilitri di mezzo di crescita contenente quattro microgrammi per millilitro di puromicina, e piastrare due millilitri della sospensione cellulare in ciascuno dei due pozzetti vuoti rivestiti con collagene. Incubare a 37 gradi Celsius per 45 minuti per eliminare le cellule non endoteliali aderenti rapidamente. Successivamente, aspirare il mezzo di crescita dai due pozzetti che non contengono cellule e scartarlo.

Quindi trasferire il mezzo contenente le cellule non aderenti, che include la frazione di cellule endoteliali, in queste due pozzette. Ricaricare le pozzette precedenti con due millilitri di mezzo fresco. Queste pozzette contengono altri tipi cellulari come fibroblasti e astrociti, e possono essere coltivate in parallelo ed utilizzate per confronti di morfologia.

Incubare le cellule durante la notte nell'incubatore per colture cellulari; il giorno successivo, sostituire con mezzo fresco e coltivare i fibroblasti GPE neo, che secernono un virus difettivo per la replicazione contenente l'oncogene T medio del polioma, in fiasche rivestite di gelatina contenenti GPE neomed. La trasfezione con l'oncogene T medio del polioma conferisce un vantaggio proliferativo alle cellule endoteliali rispetto alle cellule non endoteliali, portando alla formazione di un monostrato omogeneo di cellule con morfologia endoteliale. Dopo quattro-sei settimane di coltura, le cellule GPE neo non sono disponibili in commercio e possono essere ottenute come materiale condiviso pubblico.

Dopo aver coltivato le GPE Neo Fiberblast per 24 ore, rimuovere 10 millilitri del mezzo e aggiungere soluzione sterile di poli-brain fino a una concentrazione finale di otto microgrammi per millilitro. Far passare la miscela del sopranatante attraverso un filtro da 0,45 micron per rimuovere eventuali frammenti cellulari. Aspirare ora il mezzo dalle colture di cellule endoteliali e aggiungere due millilitri della miscela di sopranatante con poli-brain ai pozzetti dopo un'incubazione notturna.

Ripetere questa procedura il giorno successivo con un'aliquote fresca della miscela poli-cervello del sopranatante. Rimuovere la miscela poli-cervello del sopranatante. Lavare le cellule due volte con PBS e quindi aggiungere mezzo di crescita fresco.

Continuare a cambiare il mezzo di crescita ogni tre giorni quando le cellule diventano confluenti; passare le cellule da uno a due su piastre rivestite di collagene. Di solito si ottengono linee cellulari stabili di endotelio cerebrale dopo quattro-cinque settimane di coltura successiva.

Quando uno strato monoendoteliale omogeneo ricopre completamente l'intero pozzetto. Una volta ottenute le linee cellulari stabili, trasferire in fiaschi per coltura cellulare rivestiti con collagene IV e passare le cellule non più di una volta alla settimana mediante tripsina con tre millilitri di tripsina EDTA e incubazione a 37 gradi Celsius per cinque-quindici minuti, fino a quando lo strato cellulare non si è disperso. Dopo l'aggiunta di cinque millilitri di mezzo, seminare nei nuovi fiaschi evitando diluizioni superiori a 1:4.

Una volta ottenuto un numero sufficiente di cellule per raggiungere la confluenza in un fiasco T 75, è possibile preparare aliquote criogeniche delle cellule per un uso successivo. Per fare ciò, raccogliere le cellule con tripsina come in precedenza, quindi centrifugare la sospensione cellulare a 250 ×g per cinque minuti. A temperatura ambiente, risospendere il pellet cellulare in sei millilitri di mezzo di congelamento, quindi pipettare 1,5 millilitri della sospensione cellulare in quattro vial criogenici.

Posizionare le provette criogeniche in un contenitore per congelamento Nalgene riempito con isopropanolo e mantenerle per un giorno a meno 80 gradi Celsius. Infine, conservare le provette criogeniche in azoto liquido. Scongelare il quadruplo criogenico di cellule in un bagno a temperatura ambiente, quindi trasferirle in un tubo da centrifuga da 15 millilitri contenente 10 millilitri di terreno di crescita.

Riscaldare il mezzo a 37 gradi Celsius e centrifugare il tubo a 250 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo aver aspirato il mezzo, risospendere il pellet in un volume appropriato di mezzo di crescita. Trasferire la sospensione cellulare in un fiasco per coltura cellulare T25 rivestito con collagene IV contenente mezzo di crescita preriscaldato.

La densità cellulare per la semina dovrebbe essere almeno di un milione di cellule per millilitro. Cambiare il mezzo il giorno successivo e continuare a passaggiare le cellule come in precedenza quando le cellule raggiungono la confluenza, circa cinque giorni dopo; a quel punto, seminare le cellule alla densità desiderata per i successivi esperimenti. Le cellule C end sono state caratterizzate mediante colorazione immunoistochimica per marcatori endoteliali e della barriera ematoencefalica.

Questa immagine mostra la morfologia delle cellule C e la colorazione immunoistochimica per la claina cinque. Le cellule C presentano una morfologia simile a quella delle colture primarie di ECS cerebrali, con monolayer di cellule allungate strettamente impaccate che mostrano inibizione della crescita. Alla confluenza, le cellule esprimono livelli rilevabili di claina.

Qui le cellule CN C sono state immuno marcate con un anticorpo contro l'occludina. Qui osserviamo l'espressione delle proteine VE-caderina, localizzate ai giunzioni intercellulari, nuovamente evidenziate mediante colorazione di immunofluorescenza. La resistenza elettrica transendoteliale è stata misurata utilizzando un dispositivo contenente elettrodi per il passaggio della corrente e per la misurazione del voltaggio.

Da questa figura si può osservare che la resistenza elettrica transendoteliale delle cellule C end aumenta nel tempo in coltura dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare i disturbi cerebrovascolari in un modello murino.