Name: Linduzione di segnali di adesione-dipendenti utilizzando ultrasuoni a bassa intensità (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Scopri come stimolare i fibroblasti con ultrasuoni a bassa intensità per indurre la formazione di adesioni focali e l'attivazione di Rac1. Questo metodo permette di studiare i meccanismi molecolari della migrazione cellulare.

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1. Le superfici di rivestimento con Ligand Matrix <ol><li> Ultrasound sarà applicata alle cellule in 3,5-cm pozzi, sia come piatti individuali o come una piastra da 6 pozzetti. Per saggi biochimici, ligando strato direttamente sulla plastica. Per immunofluorescenza, vetro bollire coprioggetto tre volte in acqua MilliQ e 4 coprioggetti posto sul fondo di ciascun pozzetto. </li><li> Superfici di vetro deve essere derivatizzato per garantire rivestimento efficiente ligando. Sciogliere solfo-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide estere in PBS a 1 mM. Aggiungere 2 ml a ciascun pozzetto ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le superfici derivatizzati 3 volte con PBS. </li><li> Coat vetro oppure derivatizzato o plastica trattata con ligando integrina. Applicare 2 ml di 10 ug / ml integrina ligand9, disciolto in PBS contenente Ca 2 + e Mg 2 + a ciascun pozzetto ed incubare durante la notte a 4 ° C. </li><li> Preparare monoparticulate BSA riscaldando 1% BSA, disciolto in PBS, a 85 ° C per 13 minuti. Consentireraffreddare e poi passare attraverso un filtro da 0,45-um. </li><li> Lavare ligando superfici rivestite 3 volte con PBS e il blocco con BSA monoparticulate per 30 minuti. </li></ol> 2. Preparazione delle cellule <ol><li> Per controllare l&#39;ambiente di matrice durante l&#39;esperimento, la sintesi proteica deve essere bloccata mediante aggiunta di 25 pg / ml cicloeximide al 80% fibroblasti confluenti per 2 ore. </li><li> Risciacquare cicloeximide cellule trattate con PBS e staccare dal pallone di coltura utilizzando 0,5 mg / ml di tripsina / EDTA. </li><li> Cellule Harvest staccati di centrifugazione a 500x g per 5 minuti. </li><li> Risospendere le cellule in DMEM/25 HEPES mm, 25 mcg / ml cicloeximide. </li><li> Contare densità cellulare della sospensione utilizzando un emocitometro e diluire a 105 ml-1. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C per 20 minuti per recuperare integrina superficie. </li><li> Risciacquare le ligando rivestita, BSA-bloccati pozzetti 3 volte con PBS. </li><li> Seme 2 ml della sospensione di cellule in ciascun pozzetto. </li><li> Allow celle a sviluppa per 2 ore a 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 3. Ultrasuoni Stimolazione <ol><li> Scaldare l&#39;array emettitore ultrasuoni e gel di accoppiamento a 37 ° C. </li><li> Applicare un pisello blob di gel ad ogni emettitore. </li><li> Verificare che ciascun emettitore è funzionale con un indicatore rivelatore ultrasuoni diodo. </li><li> Posizionare i pozzetti sulla matrice emettitore. Ritorna matrice a 37 ° C, 5% di CO 2 e temperatura consente di equilibrare per 10 minuti. </li><li> Accendere il segnale ad ultrasuoni. </li><li> Il segnale ad ultrasuoni si disattiva dopo 20 minuti, imitando il regime terapeutico. Se i tempi di stimolazione più brevi sono necessarie, le piastre devono essere rimossi dalla matrice al momento opportuno time-points. In tutti i casi non stimolate utilizzare piastre come controllo negativo. </li></ol> 4. Adesione Analisi focale mediante immunofluorescenza <ol><li> Per l&#39;analisi di formazione di adesione focale, applicare il 20-minuti segnale ultrasonicoe quindi consentire di sviluppare strutture per altri 40 minuti, mantenendo le cellule a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Aspirare media e fissare le cellule applicando 2 ml di paraformaldeide al 4% in PBS. Incubare per 14 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare paraformaldeide e sciacquare tre volte con PBS, applicando il PBS dolcemente lungo il bordo del pozzo per evitare la generazione di forze di taglio. </li><li> Trasferire ciascun coprioggetto da 3,5 cm e ad una piastra da 24 pozzetti per la successiva colorazione di immunofluorescenza. </li><li> Quench paraformaldeide residuo applicando 0,5 ml di 0,1 M glicina in PBS a ciascuno dei 24 pozzetti. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare glicina e sciacquare tre volte con PBS. </li><li> Permeabilise cellule applicando 0,5 ml 0,5% Triton X-100 (w / v) in PBS. Incubare per 4 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare Triton X-100 e sciacquare tre volte con PBS. </li><li> Bloccare applicando 0,5 ml 3% (w / v) BSA in PBS. Incubare per una notte a 4 &amp; deg; C. </li><li> Stain vinculin contenenti adesione focale con hVIN-1 anticorpo diluito 1:400 in blocco BSA. Incubare per un&#39;ora a temperatura ambiente. </li><li> Risciacquare tre volte con PBS. </li><li> Applicare fluoroforo (DyLight 488) coniugato anticorpo secondario (diluito 1:200) e actina macchia con TRITC coniugato phalloidin (diluito 1:200) nel blocco BSA. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Risciacquare tre volte con PBS, e una volta con acqua. </li><li> Montare su un vetrino in posizione invertita utilizzando Prolungare mon-Gold. </li></ol> 5. Quantificazione di Rac1 Attivazione da Pull-down Assay <ol><li> Per l&#39;analisi di Rac1 attivazione, applicare il 20-minuti segnale ultrasonico a cellule a 37 ° C, 5% CO 2. Nel valutare tempi di reazione più lunghi di 20 minuti, applicare il segnale a ultrasuoni per 20 minuti e mantenere le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 per il tempo rimanente per permettere la risposta di sviluppare. </li><li> Aspirare il terreno e luogo bens su ghiaccio. Sciacquare i pozzetti con 2 ml di PBS freddo e aspirato. Assicurarsi che ogni residuo PBS viene rimosso lasciando pozzi inclinati per 1 minuto seguito da aspirazione profonda. </li><li> Lisare le cellule su ghiaccio con 35 microlitri di tampone di lisi (10% glicerolo, 20 mM Hepes pH 7,4, 140 mM NaCl, 1% NP40, desossicolato di sodio allo 0,5%, 4 mM EGTA, 4 mM EDTA, 1 × inibitore di proteasi completo) per pozzetto. In questo esempio, 6 pozzetti sono utilizzati per punto di tempo per generare 210 microlitri di lisato cellulare. Pozzi più o meno quelli che possono essere utilizzati, ma il volume totale di lisato dovrebbero ammontare a circa 200 microlitri. </li><li> Raschiare accuratamente le cellule con raschietto cella per assicurare completa lisi delle cellule e lasciare pozzi inclinato per 1 minuto per consentire lisato alla piscina. </li><li> Trasferire il lisato ad una ghiacciata 1,5 ml provetta per microcentrifuga (lisati pooling dal regime stesso trattamento) e centrifugare a 21000 × g per 2 minuti a 4 ° C a detriti pellet cellulare. </li><li> Trasferire 180 microlitri di lisato di ghiacciata 1,5 ml provette da microcentrifuga contenente 130 microlitri di tampone di lisi e 25 microlitri PAK-glutathione perline di agarosio 10. Mantenere rimanente lisato grezzo a -20 ° C per la successiva separazione gel. </li><li> Cattura Rac1 attivo sulle PAK perline di glutatione-agarosio ruotando provette per 40 minuti a 4 ° C. </li><li> Harvest agarosio tallone coniuga mediante centrifugazione a 2000 × g per 1 minuto a 4 ° C. </li><li> Wash tallone coniuga tre volte con 500 microlitri tampone di lisi, perline raccolta per centrifugazione a 2000x g e scartando supernatante dopo ogni lavaggio. Rimuovere con cautela qualsiasi residuo di lavaggio tampone di lisi con una pipetta 200 pl. </li><li> Eluire ciascun campione con l&#39;aggiunta di 35 microlitri SDS-PAGE di tampone di caricamento e incubare a 85 ° C su un blocco di calore agitazione per 5 minuti. Rimuovere perline per centrifugazione a 21.000 xg per 1 minuto. </li><li> Risolvere eluato tallone mediante SDS-PAGE, trasferimento in nitrocellulosa e sonda per Rac1. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi In questo protocollo si descrive l&#39;induzione di vinculin-macchiaEd adesioni focali e Rac1 attività con l&#39;ecografia. Per l&#39;esperimento adesione focale, la posizione di base è che i fibroblasti distribuite su un ligando di 5 α β 1-integrina non formano vinculina contenenti aderenze (Fig. 3A) a meno che un recettore secondo fibronectina, Syndecan-4, viene impegnato dalla aggiunta di ligando solubile (Fig. 3B) 3,4. Tuttavia, la stimolazione con ultrasuoni induce la formazione focale adesione nella stessa misura di impegno Syndecan-4 (Fig. 3C), che indica che la stimolazione ad ultrasuoni può sostituire alcuni componenti della fibronectina-dipendente via di segnalazione 5. L&#39;ostacolo chiave con questo protocollo si elimina la formazione di adesione focale in assenza di stimolante. Incompleta inibizione della sintesi proteica da parte cicloeximide permetterà di deposizione della matrice che è sufficiente per le cellule per l&#39;auto-stimolano. Il sovraffollamento delle cellule può portare anche a basso livello Formatio adesione focalen ed una scarsa risposta a ultrasuoni come diafonia tra cellula-cellula e cellula-matrice contatti complicare un esperimento che è progettata per isolare un singolo stimolo. Come sviluppo del saggio di base si mostra lo stesso esperimento, ripetuto con fibroblasti privi Syndecan-4 (Fig. 4). Questi fibroblasti di rispondere a ultrasuoni (Fig. 4C), ma non riescono a rispondere alle Syndecan-4 legante (Fig. 4B). L&#39;esperimento utilizzando Sdc4 - / - fibroblasti dimostra che gli ultrasuoni possono effettivamente bypassare la necessità di certi recettori fibronectina, e illustra come il protocollo semplice può essere sviluppato per ottenere informazioni aggiuntive sul percorso di segnalazione. Per l&#39;esperimento biochimico dimostriamo che gli ultrasuoni possono indurre l&#39;attivazione di Rac1, utilizzando un pull-down saggio che è un adattamento del metodo descritto da Del Pozo et al. 10. Precipitazione di attivo Rac1 0, 10, 30 e 60 minuti dopo iniziazione di stimolazione ultrasuoni rivela che RAC1 picchi di attività a 10-30 minuti, prima di tornare alla linea di base (Fig. 5). Blotting lisati greggio per vinculin assicura carico equivalente tra i punti temporali. Il risultato assomiglia attivazione di Rac1 da un blocco del Syndecan-4 3, ma è leggermente più lunga di attivazione da parte fibronectina. Pertanto 8-10 ripetizioni sono tipicamente necessari per ottenere dati significativi. Attivazione di Rac1 è responsabile per l&#39;impegno alla formazione delle cellule adesione focale e nascenti adesioni focali cominciano a formarsi a 10-30 minuti, in coincidenza con Rac1 attivazione. Una volta avviato, tali aderenze continuerà a maturare nelle placche di adesione grandi illustrate nelle figure 3 e 4. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig1.jpg" /> Figura 1. La forma d&#39;onda ad ultrasuoni. Ecografia comprende un segnale intermittente 1,5 MHz che, a causa di bassa ampiezza (30 mW / cm &lt;sup&gt; 2, media spaziale, media temporale) non ha alcun effetto di riscaldamento. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig2.jpg" /> Figura 2. Rappresentazione schematica del flusso di lavoro per la preparazione e la stimolazione delle cellule con ultrasuoni. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig3.jpg" /> Figura 3. Induzione Ecografia di formazione adesione focale nei fibroblasti. I fibroblasti sono stati sparsi sul integrina-binding frammento di fibronectina (A) prima della stimolazione con il Syndecan-4-binding frammento di fibronectina (B) o ultrasuoni (C). Dopo 60 minuti di stimolazione, le cellule sono state fissate, colorate per vinculina e actina, e ripreso da epifluorescenza. Bar = 10 micron. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig4.jpg" /> Figura 4. Induzione Ecografia di formazione adesione focale in fibroblasti carenti Syndecan-4. <em&gt; Sdc4 - / - fibroblasti sono stati sparsi sul integrina-binding frammento di fibronectina (A) prima della stimolazione con il Syndecan-4-binding frammento di fibronectina (B) o ultrasuoni (C). Dopo 60 minuti di stimolazione, le cellule sono state fissate, colorate per vinculina e actina, e ripreso da epifluorescenza. Anche se Sdc4 - / - fibroblasti erano fibronectina-insensitive, ecografia ancora indotto la formazione di focale adesione, indicando che l&#39;ecografia esclude l&#39;impegno matrice recettore. Bar = 10 micron. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4024/4024fig5.jpg" /> Figura 5. Attivazione di Rac1 da ultrasuoni. Le cellule sono state stimolate per minuto 0, 10, 30 e 60 con 6 pozzetti utilizzati per punto di tempo. La quantità di GTP-Rac1 presenti nei campioni da un pull-down Rac1 corso del test il tempo è stato visualizzato mediante incubazione con l&#39;anticorpo anti-Rac1 su un Western Blot (immagine in alto). Quantificazione dell&#39;intensità band (media di 8-10 replicati) rivela un aumento Rac1 unoettività risultante dal segnale ad ultrasuoni a 10 e 30 minuti, prima di tornare ai livelli basali a 60 minuti (grafico). Le barre di errore rappresentano sem

<ol><li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+syndecan-4+hair+trigger+initiates+wound+healing+through+caveolin-+and+RhoG-regulated+integrin+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A syndecan-4 hair trigger initiates wound healing through caveolin- and RhoG-regulated integrin endocytosis.</a> Dev. Cell. 21, 681-693 (2011).</li>
<li>Echtermeyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+wound+repair+and+impaired+angiogenesis+in+mice+lacking+syndecan-4%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Delayed wound repair and impaired angiogenesis in mice lacking syndecan-4.</a> J. Clin. Invest. 107, R9-R14 (2001).</li>
<li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndecan-4-dependent+Rac1+regulation+determines+directional+migration+in+response+to+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Syndecan-4-dependent Rac1 regulation determines directional migration in response to the extracellular matrix.</a> J. Cell Biol. 177, 527-538 (2007).</li>
<li>Woods, A., Couchman, J. R., Johansson, S., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+and+cytoskeletal+organisation+of+fibroblasts+in+response+to+fibronectin+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Adhesion and cytoskeletal organisation of fibroblasts in response to fibronectin fragments.</a> Embo. J. 5, 665-670 (1986).</li>
<li>Mahoney, C. M., Morgan, M. R., Harrison, A., Humphries, M. J., Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+ultrasound+bypasses+canonical+syndecan-4+signaling+to+activate+rac1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Therapeutic ultrasound bypasses canonical syndecan-4 signaling to activate rac1.</a> J. Biol. Chem. 284, 8898-8909 (2009).</li>
<li>Claes, L., Willie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enhancement+of+bone+regeneration+by+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Biophys.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The enhancement of bone regeneration by ultrasound.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. 93, 384-398 (2007).</li>
<li>Heckman, J. D., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Kilcoyne, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+tibial+fracture-healing+by+non-invasive%2C+low-intensity+pulsed+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Joint+Surg.+Am%22%5BJournal%5D)">Acceleration of tibial fracture-healing by non-invasive, low-intensity pulsed ultrasound.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 76, 26-34 (1994).</li>
<li>Kristiansen, T. K., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Roe, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+healing+of+distal+radial+fractures+with+the+use+of+specific%2C+low-intensity+ultrasound.+A+multicenter%2C+prospective%2C+randomized%2C+double-blind%2C+placebo-controlled+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Joint+Surg.+Am%22%5BJournal%5D)">Accelerated healing of distal radial fractures with the use of specific, low-intensity ultrasound. A multicenter, prospective, randomized, double-blind, placebo-controlled study.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 79, 961-973 (1997).</li>
<li>Danen, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+the+synergy+site+for+cell+adhesion+to+fibronectin+depends+on+the+activation+state+of+integrin+alpha+5+beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Requirement for the synergy site for cell adhesion to fibronectin depends on the activation state of integrin alpha 5 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 270, 21612-21618 (1995).</li>
<li>Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+to+the+extracellular+matrix+regulates+the+coupling+of+the+small+GTPase+Rac+to+its+effector+PAK%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK.</a> Embo. J. 19, 2008-2014 (2000).</li>
<li>Makarem, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+binding+of+vascular+cell+adhesion+molecule-1+and+the+HepII%2FIIICS+domain+of+fibronectin+to+the+integrin+alpha+4+beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Competitive binding of vascular cell adhesion molecule-1 and the HepII/IIICS domain of fibronectin to the integrin alpha 4 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 269, 4005-4011 (1994).</li>
</ol>

Andrew Harrison è un dipendente di Smith &amp; Nephew UK Limited.

In questo protocollo è descritto il metodo con cui un trattamento che viene normalmente applicato a pazienti umani possono essere utilizzati in esperimenti basati su celle. L&#39;obiettivo finale è quello di comprendere il meccanismo molecolare di azione degli ultrasuoni in modo che la terapia può essere raffinato. In questo protocollo, si usa fibroblasti embrionali di topo (MEF) come sistema modello di cella, ma ad ultrasuoni è stato anche stato trovato per essere efficace in fibroblasti primari umani prepuzio 5, cellule staminali mesenchimali, osteoblasti e condrociti 6. Usiamo Rac1 attivazione come un saggio biochimico esempio, ma il metodo può essere utilizzato anche per testare regolazione di fosforilazione proteica o la formazione di complessi proteici di immunoprecipitazione. Per l&#39;esempio immunofluorescenza si dimostra una ecografia effetto sulla formazione di adesione focale, ma la ridistribuzione di qualsiasi molecola potrebbe essere esaminato. Ad esempio, si potrebbe verificare assunzione di fattori citosolici alla membrana plasmatica, colocalisation di proteins in vescicole traffico o esaminare l&#39;effetto degli ultrasuoni sull&#39;organizzazione mitotico mandrino. Finora ci siamo limitati a noi stessi di test della fibronectina dipendenti percorsi, per effetto degli ultrasuoni sulle cellule sul collagene, o in presenza di fattori di crescita potrebbe essere testato per costruire un quadro di come gli ultrasuoni influenza il comportamento delle cellule in un ambiente complesso che più assomiglia una situazione in vivo. Una sfida maggiore sarà per testare l&#39;effetto di ultrasuoni utilizzando time-lapse imaging, dove la presenza di emettitore bloccare il percorso di luce e vibrazioni dagli attuali ultrasuoni ulteriori ostacoli tecnici. Tuttavia, il fatto che l&#39;applicazione terapeutica richiede solo 20 minuti di stimolazione al giorno suggerisce che l&#39;analisi del comportamento delle cellule dopo un burst di stimolazione può anche essere produttiva.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> solfo-m-maleimidobenzoyl-N-hydrosuccinimide estere </td><td> FisherPerbio </td><td> PN22312 </td><td> Stock 25 mM disciolti in acqua può essere conservato a -20 ° C </td></tr><tr><td> 6-ben piastra di coltura tissutale </td><td> Corning </td><td> 3516 </td><td> Plastica da altre società in grado di ricoprire poco </td></tr><tr><td> 13 mm di vetro coprioggetto </td><td> Scientifici materiale di laboratorio, Ltd.SLS </td><td> MIC3336 </td><td> Vetro da altre società in grado di ricoprire poco </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, Ca 2 + Mg 2 + </td><td> Sigma </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> 50K integrina ligando (frammento fibronectina) </td><td> Costruire descrizione e preparazione in 9, 11 </td><td></td><td> Alternative ligandi matrice potrebbe essere utilizzato per interrogare altri percorsi </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A3059 </td><td></td></tr><tr><td> Cicloeximide </td><td> Sigma </td><td> C7698 </td><td> Può essere conservato come stock 10mg/ml in acqua </td></tr><tr><td> DMEM/25 HEPES </td><td> Sigma </td><td> D6171 </td><td></td></tr><tr><td> Esogene 4000 + </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ultrasuoni accoppiamento gel </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SAFHS Indicatore </td><td> Smith &amp; Nephew Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> hVIN-1 </td><td> Sigma </td><td> V9264 </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488-coniugato anti-topo </td><td> Stratech Scientific </td><td> 715-485-150 </td><td></td></tr><tr><td> TRITC marcato phalloidin &lt;/ Td&gt; <td> Sigma </td><td> P1951 </td><td></td></tr><tr><td> Prolungare reagente oro antifade </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> inibitore della proteasi completa (EDTA libero) </td><td> Roche </td><td> 056 489 001 </td><td> 100 × magazzino costituito da tablet conservati a -20 ° C </td></tr><tr><td> PAK glutatione-agarosio perline </td><td> Costruire descrizione e la preparazione in 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Pescatore </td><td> G/0650/17 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Apollo Scientific </td><td> BI8181 </td><td> Fai stock 1M e il pH a 7.4 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Pescatore </td><td> S/0160/65 </td><td></td></tr><tr><td> NP40 </td><td> Sigma </td><td> I3021 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio desossicolato </td><td> Sigma </td><td> D6750 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> E4378 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;induzione di segnali di adesione-dipendenti utilizzando ultrasuoni a bassa intensità

Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound

In organismi multicellulari, il comportamento cellulare è dettata dalle interazioni con la matrice extracellulare. Conseguenze della matrice impegno vanno dalla regolazione della migrazione e proliferazione cellulare, alla secrezione e anche la differenziazione. I segnali base di ciascuno di questi processi complessi derivano dalle interazioni molecolari di recettori della matrice extracellulare sulla superficie della cellula. Le integrine sono i recettori prototipici e fornire un collegamento meccanico tra la matrice extracellulare e il citoscheletro, nonché avviare alcune delle cascate di segnalazione adesione-dipendenti. Tuttavia, è sempre più evidente che recettori transmembrana aggiuntivi operato lungo le integrine di regolare sia la stessa integrina e segnali a valle. La più elegante di questi esempi è il proteoglicano transmembrana, Syndecan-4, che coopera con 5 α β 1-integrina durante l&#39;adesione alla fibronectina. Modelli in vivo demonstrmangiò l&#39;importanza della segnalazione Syndecan-4, come Syndecan-4-topi knockout presentano ritardo di guarigione a causa di 1,2 inefficiente la migrazione dei fibroblasti. In animali di tipo selvatico, la migrazione di fibroblasti verso una ferita viene attivato dalla comparsa di fibronectina che fuoriesce da danneggiato capillari e viene depositato mediante macrofagi nel tessuto danneggiato. Quindi c&#39;è grande interesse per scoprire le strategie che aumentano fibronectina-dipendenti di segnalazione e potrebbe accelerare i processi di riparazione. I componenti integrina-mediati e Syndecan-4-mediata di fibronectina-dipendenti segnalazione possono essere separate da stimolando le cellule con frammenti di fibronectina ricombinanti. Anche se l&#39;impegno integrina è essenziale per l&#39;adesione cellulare, fibronectina alcuni segnali dipendenti sono regolate da Syndecan-4. Syndecan-4 attiva il segnale di Rac1 protrusiva 3, provoca integrina redistribuzione 1, trigger reclutamento di molecole del citoscheletro, come vinculin, di focale4 adesioni, e induce così 3 direzionale di migrazione. Abbiamo cercato strategie alternative per l&#39;attivazione di tali segnali e ha scoperto che a bassa intensità ultrasuoni pulsato (LIPUS) in grado di simulare gli effetti di Syndecan-4 di fidanzamento 5. In questo protocollo si descrive il metodo di 30 mW / cm 2, 1,5 MHz ultrasuoni, impulsi a 1 kHz (Fig. 1) può essere applicato a fibroblasti in coltura (Fig. 2) per indurre Rac1 attivazione e la formazione di adesione focale. Stimolazione ad ultrasuoni viene applicato per un massimo di 20 minuti, in quanto questa combinazione dei parametri è stato trovato per essere più efficace per l&#39;accelerazione di riparazione delle fratture clinica 6. Il metodo utilizza frammenti di fibronectina ricombinanti per impegnare 5 α β 1-integrina, senza impegno di Syndecan-4, e richiede l&#39;inibizione della sintesi proteica cicloeximide per bloccare deposizione di matrice supplementare dai fibroblasti., L&#39;effetto positivo of ultrasuoni sui meccanismi di riparazione è ben documentata 7,8, e per comprendere l&#39;effetto molecolare degli ultrasuoni nella cultura dovremmo essere in grado di affinare la tecnica terapeutica per migliorare gli esiti clinici.

Questo protocollo descrive la stimolazione dei fibroblasti in coltura a bassa intensità ultrasuoni pulsato, che guida la formazione di adesione focale e Rac1 attivazione imitando l&#39;impegno del recettore transmembrana matrice, Syndecan-4. Questo approccio consente di indagine di una tecnica di successo clinico a livello cellulare, fornendo così opportunità per la raffinazione della terapia.

L&#39;induzione di segnali di adesione-dipendenti utilizzando ultrasuoni a bassa intensità

Negli organismi multicellulari, il comportamento cellulare è dettato dalle interazioni con la matrice extracellulare. Le conseguenze dell'impegno della matrice variano da...

L'obiettivo generale di questa procedura è comprendere i meccanismi molecolari attraverso cui gli ultrasuoni pulsati a bassa intensità o il lipo influenzano la migrazione cellulare e quindi accelerano la riparazione dei tessuti. Questo viene ottenuto innanzitutto trattando le cellule con ciclo eide per due ore al fine di prevenire l'espressione *de novo* di proteine e quindi l'autostimolazione delle cellule. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'allestire cellule distaccate per due ore su superfici che sono state rivestite con un ligando matriciale attentamente definito.Il terzo passaggio consiste nello stimolare le cellule con ultrasuoni, accoppiando tramite gel le piastre di coltura cellulare agli emettitori di ultrasuoni. I risultati possono mostrare variazioni nella formazione delle adesioni focali indotte dalla stimolazione a ultrasuoni, mediante colorazione delle cellule per cullina e actina, e variazioni temporali nell'attivazione di RAC1 attraverso il saggio di pull-down per RAC1 attivo e successiva analisi western blot. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande fondamentali nel campo della segnalazione dell'adesione, come ad esempio se la manipolazione fisica delle cellule possa sostituire stimoli chimici quali fattori di crescita o l'actina fibrillare.E come fa questa manipolazione fisica a innescare la migrazione cellulare? Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle ferite croniche, poiché comprendendo come gli ultrasuoni possano influenzare il comportamento cellulare, potremmo essere in grado di perfezionare i trattamenti per accelerare la chiusura delle ferite in individui con difetti di guarigione, come pazienti anziani o diabetici. Per saggi biochimici, rivestire direttamente i pozzetti di piastre di plastica da 3,5 centimetri con ligando dell'integrina.Per l'immunofluorescenza, far bollire le lamelle di vetro tre volte in acqua milli Q. Quindi posizionare quattro lamelle in ciascuna piastra da 3,5 centimetri e derivatizzare le lamelle di vetro per garantire un efficiente rivestimento del ligando aggiungendo due millilitri di solfato di MBS uno millimolare a ciascun pozzetto, lasciare procedere la reazione per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi lavare le superfici derivatizzate tre volte con PBS. Ora ricoprire il vetro derivatizzato con due millilitri di ligando per integrina.Aggiungere il ligando in ogni pozzetto e incubare le piastre durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, preparare la BSA mono-particolata riscaldando la BSA all'1%, disciolta in PBS, a 85 gradi Celsius per 13 minuti. Lasciare raffreddare, quindi filtrare attraverso un filtro da 0,45 micron. In primo luogo, lavare le superfici rivestite con il ligando tre volte con PBS; in secondo luogo, bloccare le superfici con la BSA mono-particolata preparata per 30 minuti.Per controllare l'ambiente della matrice durante tutto l'esperimento, la sintesi proteica deve essere bloccata aggiungendo 25 microgrammi per millilitro di cyclo heide a fibroblasti all'80% di confluenza per due ore. Lavare le cellule trattate con cyclo heide con PBS, lisare le cellule e raccoglierle in pellet. Sospendere nuovamente le cellule in soluzione A-D-M-E-M a una concentrazione finale di 10.000 cellule per millilitro con l'aiuto di un emocitometro.Ora incubare le cellule risospese a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Quindi risciacquare le piastre tre volte con PBS prima di seminare due millilitri della sospensione cellulare in ciascuna. Lasciare le cellule aderire per due ore a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica; iniziare riscaldando l'array dell'emettitore a ultrasuoni e il gel di accoppiamento.Dopo averlo riscaldato, applicare una piccola quantità di gel di accoppiamento, delle dimensioni di un pisello, su ogni emettitore per verificare che sia funzionante. Utilizzando un rilevatore a diodo indicatore ad ultrasuoni, far sì che il gel accoppi l'emettitore al rilevatore. Se l'emettitore è funzionante, il DDE si illuminerà.Il dispositivo ha impostazioni fisse e fornisce ultrasuoni a 1,5 megahertz pulsati a un kilohertz, erogando un'intensità di 30 milliwatt per centimetro quadrato. Il dispositivo si disattiverà automaticamente dopo 20 minuti. Posizionare le pozzette sull'array dell'emettitore, reinserire l'array in un incubatore e attendere 10 minuti per l'equilibrazione della temperatura, quindi accendere il segnale ad ultrasuoni sull'alimentatore.Il segnale agli ultrasuoni si disattiverà dopo 20 minuti. Simulare il regime terapeutico se sono richiesti tempi di stimolazione più brevi. Le piastre possono essere rimosse dall'array al momento opportuno.Per tempi di stimolazione più lunghi, le piastre devono essere lasciate sull'array e lasciate sviluppare. L'emettitore potrebbe essere riavviato, ma non abbiamo osservato ulteriori benefici quando lo abbiamo fatto. In tutti i casi, le piastre non stimolate devono essere utilizzate come controllo negativo.Per l'analisi della formazione delle adesioni focali, applicare un segnale ultrasuonico di 20 minuti su coprioggetti rivestiti con S, quindi incubarli per ulteriori 40 minuti a 37 gradi Celsius. Questo consente lo sviluppo delle adesioni focali. Successivamente, aspirare il mezzo.Applicare due millilitri di fissativo e attendere 14 minuti. Rimuovere il fissativo per aspirazione e risciacquare delicatamente le cellule tre volte con PBS. Applicare il PBS lungo il bordo del pozzetto e far diffondere dolcemente la soluzione.Dopo averli sciacquati accuratamente, trasferire ogni coprivetrino dal pozzetto di 3,5 centimetri a una piastra a 24 pozzetti per la successiva colorazione immunofluorescente. Al termine del periodo di stimolazione desiderato, aspirare il mezzo e risciacquare le cellule con PBS su ghiaccio, quindi lisare le cellule nel tampone di lisi appropriato per il saggio biochimico prescelto. Tipicamente, analizziamo un'attivazione mediante saggio di pull-down dell'effettore.In particolare, questo metodo potrebbe essere utilizzato per l'analisi biochimica di qualsiasi via di segnalazione. In questo protocollo, descriviamo l'induzione di vinky e delle adesioni focali colorate e dell'attività di RAC one mediante ultrasuoni negli esperimenti sulle adesioni focali. La condizione basale è che i fibroblasti adesi su un ligando dell'integrina alpha five beta one non formano adesioni contenenti finkel a meno che un secondo recettore di connessione ai fibroni, syndicate four, non venga attivato mediante l'aggiunta di un ligando solubile.Tuttavia, la stimolazione con ultrasuoni induce la formazione di adesioni focali in misura pari all'attivazione di syncom quattro, indicando che la stimolazione ad ultrasuoni può sostituire alcuni componenti della via di segnalazione indipendente dal fibrin collo. Come sviluppo del saggio di base, mostriamo lo stesso esperimento ripetuto con fibroblasti privi di INDICUM quattro. Questi fibroblasti rispondono ancora agli ultrasuoni ma non rispondono al ligando di INDICUM quattro.Ciò dimostra che gli ultrasuoni possono effettivamente aggirare la necessità di alcuni recettori delle fibre andum. Per l'esperimento biochimico, mostriamo che gli ultrasuoni possono indurre l'attivazione di RAC1 mediante un saggio di precipitazione con pull-down. L'analisi dei livelli di RAC1 attivo a 0, 10, 30 e 60 minuti dall'inizio della stimolazione con ultrasuoni rivela che l'attività di RAC1 raggiunge un picco tra i 10 e i 30 minuti prima di tornare al livello basale. La quantificazione dei lisati grezzi per cullina garantisce un caricamento equivalente tra i diversi punti temporali.Il risultato ricorda l'attivazione di RAC1 da parte dell'engagement di syndecan-4, ma è leggermente più prolungata rispetto all'attivazione indotta da fibronectina. Pertanto, sono generalmente necessari da otto a dieci ripetizioni per ottenere dati significativi. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di eliminare stimoli aggiuntivi bloccando completamente la sintesi proteica con cicloesimide, evitando contaminazioni del mezzo di coltura nell'esperimento ed evitando l'eccessivo affollamento delle cellule che porta a contatti cellula-cellula seguendo questa procedura.Altri metodi, come i saggi di guarigione della ferita mediante graffio, possono essere utilizzati per indagare ulteriori domande, ad esempio: come gli ultrasuoni avviano la migrazione cellulare?

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