Name: Utilizzando Sequence SECM arresto come uno strumento per isolare ribosoma Polipeptidi Bound (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Scopri come isolare complessi ribosoma-catena nascente (RNC) usando la sequenza di arresto SecM in E. coli. Questa tecnica permette di studiare l'elongazione della traduzione e il folding proteico co-traduzionale.

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Questo lavoro è stato finanziato dal programma Human Frontier Science concessione RGP0024.

1. Preparazione del DNA template e trascrizione in vitro <ol><li> Il gene di interesse viene clonato in qualsiasi T7 e / o ad esempio promotore SP6 base plasmide. Per ottenere RNC di interesse, C-terminale del polipeptide bersaglio viene esteso aggiungendo inducendo sequenza di arresto SECM FXXXXWIXXXXGIRAGP 7. Al fine di garantire che il frammento del polipeptide di interesse sarà estrudere fuori del tunnel ribosomiale, il C-terminale della proteina bersaglio deve essere ampliato di almeno 30 amminoacidi 12-14. Una glicina-serina linker flessibile ricco può essere introdotto tra la proteina e la sequenza arresto SECM evitare vincoli possibili conformazionali. </li><li> Per la trascrizione in vitro, DNA stampo deve essere linearizzato con l&#39;enzima di restrizione taglio a valle della ORF. Si deve verificare linearizzazione completa del DNA plasmide eseguendo il prodotto della digestione di restrizione elettroforesi su gel di agarosio. </li><li> Il plasma linearizzatoid è ulteriormente utilizzato per la reazione di trascrizione in vitro. Diversa concentrazione di DNA stampo può essere testato per identificare concentrazione ottimale di DNA necessarie per la trascrizione in vitro. Generalmente con Kit MEGAscript Ambion Trascrizione di alto rendimento (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY), 1 mg DNA linearizzato produce mRNA 40-60 mg. Trascrizione in vitro viene effettuata seguendo le istruzioni del fabbricante (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY) . </li><li> Dopo la trascrizione in vitro, mRNA viene purificato mediante precipitazione litio cloruro secondo le istruzioni del produttore (Ambion di MEGAscript alta Kit Trascrizione resa, Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY). </li><li> integrità mRNA è ulteriormente verificato mediante elettroforesi utilizzando acrilammide o gel di agarosio. </li></ol> 2. Traduzione in vitro Per la traduzione in vitro utilizzando l&#39;RTS 100 E. coli HY Kit (5 Prime, Gaithersburg, MD), attenersi alla seguente procedura: <ol><li> Preparare 100 pl di istruzione in produttore traduzione in vitro la reazione successivo. In breve, in acqua priva di nucleasi aggiungere 24 microlitri miscela di aminoacidi meno metionina (1 mM), 10 unità di inibitore della ribonucleasi (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), 20 uCi di sostanze radioattive [35 S] Biomedicals-metionina (MP, Solon, OH), 20 pl miscela di reazione, 24 microlitri tampone di ricostituzione e 24 pl di E. coli lisato. </li><li> Incubare la reazione a 30 ° C per 5 min a caldo pre la reazione di traduzione. Aggiungere 1-2 pg di mRNA alla reazione di traduzione e incubare a 30 ° C per 10-15 min. </li><li> Arrestare la reazione ponendo la reazione di traduzione in ghiaccio. </li></ol> 3. Isolamento del polipeptide nascente dalla reazione di traduzione in vitro <ol><li> Per isolare RNC, la reazione di traduzione è sovrapposto di 4,5 ml di saccarosio gradiente 5-30% in 20 mM HEPES pH 7-KOH0,5, 15 mM MgCl 2, 100 mM acetato di potassio, 1 mM DTT e centrifugati utilizzando Beckman Coulter SW55-Ti rotore a 41.000 rpm, 4 ° C per 2 ore. </li><li> Dopo centrifugazione, gradiente di saccarosio è frazionato per isolare diverse popolazioni ribosomali e le relative catene nascenti. La separazione viene monitorata utilizzando il sistema programmabile ISCO gradiente di densità con registrazione continua a 254 nm, utilizzando un rivelatore ISCO UA-6 assorbanza. </li><li> La frazione (s) contenente ribosomi 70S vengono raccolti e analizzati ulteriormente a seconda dello scopo dell&#39;esperimento. </li></ol> 4. Osservazione delle proteine ​​al ribosoma con Tris-tricina SDS PAGE Per verificare, se la proteina SECM estesa rimane attaccato agli anni &#39;70 ribosoma, frazioni del gradiente sono stati raccolti e trattati come segue: <ol><li> Proteine ​​in ciascuna frazione è stata precipitato per aggiunta di acido tricloroacetico (TCA) ad una concentrazione finale del 10% e incubate a 4 ° C overniGHT. </li><li> Dopo incubazione per una notte, i campioni sono stati centrifugati a 14.000 g per 15 minuti per precipitare la proteina. Dopo la centrifugazione supernatante è stato rimosso e il pellet lavata due volte con acetone soluzione contenente: 1 mM Tris-HCl pH 7,6 (4:1). Pellet è stato ulteriormente essiccati all&#39;aria e disciolto in SDS-PAGE tampone di caricamento. </li><li> Il campione trattato è stato risolto e analizzato mediante Tris-tricina SDS-PAGE. </li><li> Dopo l&#39;elettroforesi, gel sono stati fissati, essiccati sotto vuoto usando gel Dyer e sottoposto ad autoradiografia. La distribuzione dei polipeptidi nascenti stati osservati usando phosphoimaging. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Qui vi presentiamo un esperimento che descrive l&#39;isolamento del full-length bovina Gamma-B sonoro superiore cristallino stabilmente legata alle 70S dei ribosomi. La figura 1 illustra passaggi necessari per l&#39;isolamento di bovini Gamma-B cristallina RNC. Il C-terminale della Gamma-B sonoro superiore cristallino è stata estesa complessiva da 32 t aminoacidiO Assicurarsi che full-length estrude proteina fuori del tunnel ribosomale, questo include anche la sequenza SECM stallo posto al molto C-terminale del polipeptide di fusione. Seguendo traduzione in vitro, i ribosomi 70S sono stati isolati mediante centrifugazione gradiente di saccarosio (Figura 2.1). Al fine di garantire che la proteina rimane stabilmente legato al ribosoma, i 70S contenenti frazioni sono state riunite, dissalato, tampone scambiate e sottoposto ad una serie supplementare di centrifugazione gradiente di saccarosio (Figura 2.2). Il risultato illustrato nella figura 2 indica chiaramente che SECM può efficacemente indurre arresto traslazionale dei Gamma-B RNC cristallina. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4027/4027fig1.jpg" /> Figura 1. Spiegazione schematica i passi necessari per l&#39;isolamento di RNC. C-terminale di bovini Gamma-B sonoro superiore cristallino è stata prorogata dal 32 sequenza aminoacidica. Questa estesaC-terminale regioni comprende anche la sequenza SECM arresto. Gamma-B sonoro superiore cristallino con la sequenza SECM è stato clonato nel Pivex 2.3 (T7 based) plasmide. Per la trascrizione in vitro del DNA stampo è stato linearizzato con XbaI. Modello linearizzato è stato ulteriormente utilizzato per la trascrizione in vitro. Il T7 nel modello DNA è riconosciuto da RNA polimerasi T7 che trascrive le Gamma-B gene sonoro superiore cristallino a valle del promotore T7. mRNA è stato purificato usando cloruro di litio metodo di precipitazione. Il mRNA purificato è stato poi usato per traduzione in vitro. Dopo l&#39;incubazione, la reazione di traduzione è stato stratificato sopra del gradiente 5-30% di saccarosio e centrifugato in Beckman Coulter SW55-Ti rotore a 41.000 rpm, 4 ° C per 2 ore. <spuno class = &quot;pdflinebreak&quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4027/4027fig2.jpg" /> Figura 2. Isolamento dei bovini Gamma-B sonoro superiore cristallino RNC stabilmente legato al ribosoma 70S. 1 mRNA pg è stato miscelato in 100 microlitri di reazione E. coli sistema S30 estratto come descritto nella sezione protocollo con 20 uCi [35 S]-metionina e incubate a 30 ° C per 15 min. Dopo l&#39;incubazione, la reazione di traduzione è stato stratificato sopra del gradiente di saccarosio 5-30% in 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 15 mM MgCl 2, 100 mM di acetato di potassio, 1 mM DTT e centrifugato in Beckman Coulter SW55-Ti rotore a 41.000 rpm, 4 ° C per 2 ore. A seguito di velocità di sedimentazione, il gradiente è stato scaricato e il ribosoma Pro Tools LE è stato ottenuto. I dati sono stati registrati dal programma PeakTrak (gradiente di densità ISCO sistema gradiente di frazionamento). Le frazioni sono state raccolte, la proteina è stata TCA precipitata e ha deliberato 16,5% T, C 6% Tris-Tricine PAGE gel 15. Il gel è stato essiccato ed esposto per autoradiografia. Dopo l&#39;esposizione il gel è stato analizzato utilizzando Typhoon 9410 scanner imaging. La figura 2.1 mostra che il full-length Gamma-B sonoro superiore cristallino è presente in frazioni 70S dei ribosomi. Così, la sequenza SECM stallo consente l&#39;isolamento della stalla bovina Gamma-B cristallina RNC. I dati in Figura 2,2 indicano chiaramente che i RNC isolate sono infatti stabili. Nell&#39;esperimento corrente delle frazioni 70S dopo primo ciclo di centrifugazione gradiente di saccarosio sono state riunite e il saccarosio è stato rimosso usando Amicon Ultra-4 Unità di filtro centrifugo (Millipore), seguita da tampone scambio in soluzione contenente 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 15 mM MgCl 2, acetato di potassio 100 mM, DTT 1 mM. Questo campione è stato inoltre sottoposto ad una serie supplementare di centrifugazione attraverso gradiente 5-30% di saccarosio e frazionato. Ogni frazione è stata trattati ed analizzati come in Figura 2.1.

<ol><li>Fedorov, A. N., Baldwin, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cotranslational protein folding.</a> J. Biol. Chem. 272, 32715-32718 (1997).</li>
<li>Hardesty, B., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+a+nascent+peptide+on+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Nucleic+Acid+Res.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Folding of a nascent peptide on the ribosome.</a> Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66, 41-66 (2001).</li>
<li>Kramer, G., Boehringer, D., Ban, N., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+as+a+platform+for+co-translational+processing%2C+folding+and+targeting+of+newly+synthesized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The ribosome as a platform for co-translational processing, folding and targeting of newly synthesized proteins.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 589-597 (2009).</li>
<li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li>
<li>Cabrita, L. D., Dobson, C. M., Christodoulou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+on+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein folding on the ribosome.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 33-45 (2010).</li>
<li>Oliver, D., Norman, J., Sarker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Escherichia+coli+secA+by+cellular+protein+secretion+proficiency+requires+an+intact+gene+X+signal+sequence+and+an+active+translocon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Regulation of Escherichia coli secA by cellular protein secretion proficiency requires an intact gene X signal sequence and an active translocon.</a> J. Bacteriol. 180, 5240-5242 (1998).</li>
<li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosomal+exit+tunnel+functions+as+a+discriminating+gate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate.</a> Cell. 108, 629-636 (2002).</li>
<li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+monitor%2C+SecM%2C+undergoes+self-translation+arrest+in+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Secretion monitor, SecM, undergoes self-translation arrest in the cytosol.</a> Mol. Cell. 7, 185-192 Forthcoming.</li>
<li>Muto, H., Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+but+non+polypeptide+prolyl-tRNA+functions+in+the+A+site+for+SecM-mediated+ribosomal+stall%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded but non polypeptide prolyl-tRNA functions in the A site for SecM-mediated ribosomal stall.</a> Mol. Cell. 22, 545-552 (2006).</li>
<li>Cabrita, L. D., Hsu, S. T., Launay, H., Dobson, C. M., Christodoulou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+ribosome-nascent+chain+complexes+produced+in+vivo+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Probing ribosome-nascent chain complexes produced in vivo by NMR spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22239-22244 (2009).</li>
<li>Eichmann, C., Preissler, S., Riek, R., Deuerling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+structure+acquisition+of+nascent+polypeptides+monitored+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Cotranslational structure acquisition of nascent polypeptides monitored by NMR spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 9111-9116 (2010).</li>
<li>Kolb, V. A., Makeyev, E. V., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+activity+of+the+ribosome-bound+nascent+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide.</a> FEBS Lett. 378, 166-170 (1996).</li>
<li>Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+atomic+structure+of+the+large+ribosomal+subunit+at+2.4+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution.</a> Science. 289, 905-920 (2000).</li>
<li>Voss, N. R., Gerstein, M., Steitz, T. A., Moore, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+geometry+of+the+ribosomal+polypeptide+exit+tunnel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The geometry of the ribosomal polypeptide exit tunnel.</a> J. Mol. Biol. 360, 893-906 (2006).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li>
<li>Komar, A. A., Kommer, A., Krasheninnikov, I. A., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+folding+of+globin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cotranslational folding of globin.</a> J. Biol. Chem. 272, 10646-10651 (1997).</li>
<li>Keiler, K. C., Waller, P. R., Sauer, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+a+peptide+tagging+system+in+degradation+of+proteins+synthesized+from+damaged+messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA.</a> Science. 271, 990-993 (1996).</li>
<li>Evans, M. S., Ugrinov, K. G., Frese, M. A., Clark, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+stalled+ribosome+nascent+chain+complexes+produced+in+vivo+or+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Homogeneous stalled ribosome nascent chain complexes produced in vivo or in vitro.</a> Nat. Methods. 2, 757-762 (2005).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Per risultati riproducibili, la qualità e la concentrazione dei componenti utilizzati per la trascrizione e traduzione in vitro sono critiche. Abbiamo usato commercialmente disponibile la trascrizione in vitro ed estratti di traduzione e danno risultati efficaci e riproducibili, se maneggiato con cura. Qualità di mRNA può influenzare la traduzione, quindi è della massima importanza per testare l&#39;integrità di mRNA prima di utilizzarlo per traduzione in vitro. Il tempo di i...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / Kit </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 alta Kit Trascrizione rendimento </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> RTS 100 E.coli HY Kit </td><td> 5 Prime </td><td> 2401100 </td></tr><tr><td> Ribonucleasi Inhibitor </td><td> Invitrogen </td><td> 15518012 </td></tr><tr><td> Trans [35 S]-Label </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0151006 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-4 Unità centrifuga Filtro </td><td> Millipore </td><td> UFC801008 </td></tr><tr><td> Stoccaggio fosforo autoradiografia </td><td> GE Healthcare </td><td> Typhoon 9410 imager modalità variabile </td></tr><tr><td> Gradiente di densità di frazionamento Sistemi </td><td> Teledyne Isco, Inc. </td><td> ISCO programmabile densità del sistema Gradient </td></tr><tr><td> Gradiente di saccarosio Centrifugation </td><td> Beckman Coulter </td><td> Optima L-90 K Preparative ultracentrifuga </td></tr></tbody></table>

utilizzando sequence secm arresto come uno strumento per isolare ribosoma polipeptidi bound

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Numerose ricerche hanno fornito ampie evidenze che suggeriscono che le proteine ​​ripiegare nella cellula è un processo di co-traslazionale 1-5. Tuttavia, il percorso esatto che segue catena polipeptidica durante la co-traslazionale pieghevole per raggiungere la sua forma funzionale è ancora un enigma. Per comprendere questo processo e di determinare l&#39;esatta conformazione degli intermedi pieghevoli co-traslazionale, è necessario sviluppare tecniche che consentono l&#39;isolamento di RNC trasportano nascenti catene di dimensioni predeterminate per consentire loro ulteriori analisi strutturale. SECM (monitor secrezione) è un aminoacido 170 E. coli proteina che regola l&#39;espressione della valle Seca (guida secrezione) ATPasi nel SECM-seca operone 6. Nakatogawa e Ito originariamente scoperto che una sequenza amminoacidica 17 lungo (150-FSTPVWISQA QGIRA G P-166) nella regione C-terminale della proteina SECM è sufficiente e necessariocausare lo stallo di allungamento SECM a Gly165, producendo così peptidil-glicil-tRNA stabilmente legata alla ribosomiale P-site 7-9. Ancora più importante, è stato trovato che questa sequenza amminoacidica 17 lungo può essere fusa al C-terminale di qualsiasi proteina a lunghezza intera e / o troncato permettendo la produzione di RNC trasportano nascenti catene di dimensioni predeterminate 7. Così, quando fuse o inserito nella proteina bersaglio, la sequenza SECM stallo produce arresto del l&#39;allungamento della catena polipeptidica e genera RNC stabili in vivo sia in E. coli e in vitro in un sistema acellulare. Centrifugazione in gradiente di saccarosio è inoltre utilizzata per isolare RNC. I RNC isolati possono essere utilizzati per analizzare le caratteristiche strutturali e funzionali degli intermedi pieghevoli co-traslazionale. Recentemente, questa tecnica è stata utilizzata con successo per acquisire conoscenze nella struttura di alcune catene di ribosoma legati nascenti 10,11. Qui si descrive l&#39;isolamento di bovino Gamma-B sonoro superiore cristallino RNC fusa SECM e generato in un sistema di traduzione in vitro.

Descriviamo qui una tecnica che viene ora utilizzato di routine per isolare complessi ribosoma stabilmente legati a catena nascente (RNC). Questa tecnica sfrutta la scoperta che un 17 aminoacidi lungo &quot;sequenza di arresto&quot; SECM può fermare l&#39;allungamento traduzione in un procariota (<em&gt; E. coli</em&gt;) Del sistema, quando inserito (o fusa al C-terminale) di qualsiasi proteina.

Utilizzando Sequence SECM arresto come uno strumento per isolare ribosoma Polipeptidi Bound

Ricerche approfondite hanno fornito ampie prove suggerendo che il ripiegamento proteico nella cellula sia un processo co-traduzionale1-5. Tuttavia, l'esatto percorso...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare complessi ribosomiali SEC TED 70 S legati a catene nascenti, o RNC, prodotti durante la traduzione in un sistema acellulare in vitro. Questo viene ottenuto innanzitutto introducendo una sequenza di arresto SEC M lunga 17 amminoacidi all'estremità C-terminale del gene di interesse e clonandola a valle del promotore trascrizionale T7. Successivamente, l'mRNA viene trascritto mediante una reazione di trascrizione in vitro e quindi purificato.Quindi l'mRNA purificato viene tradotto in un sistema di estratto S 30 di E. coli con amminoacidi radioattivi per marcare la proteina sintetizzata o la polipeptide nascente. Infine, i complessi di catena nascente legati al secondo ribosoma Mr.Ed vengono isolati mediante centrifugazione su gradiente di saccarosio e frazionamento. In definitiva, i risultati ottenuti possono dimostrare che le catene nascenti sono stabilmente legate al ribosoma 70 S mediante analisi elettroforetica su gel dei polipeptidi marcati isolati dalle frazioni del gradiente.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'uso di mRNA privo di codone di stop, consiste nella garanzia di un'elevata efficienza nell'ancoraggio della catena polipeptidica nascente al ribosoma 70 S durante la traduzione e nel successivo passaggio di centrifugazione. Inoltre, a differenza della tecnologia del codone di stop assente, questo metodo può essere utilizzato con efficienza quasi uguale sia in sistemi in vitro che in vivo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del ripiegamento proteico traduttivo, come ad esempio in che modo e quanto precocemente durante la traduzione possano formarsi intermediari del ripiegamento traduttivo, e aiutare ulteriormente ad analizzarne la struttura mediante tecniche strutturali dirette o indirette.Approcci di analisi e determinazione Questa tecnica può aiutarci a decifrare il percorso del ripiegamento delle proteine sul ribosoma. In questo protocollo, abbiamo descritto l'isolamento di catene nascenti complete di cristallina gamma B legate ai ribosomi 70 S. Tuttavia, questa tecnica può essere utilizzata per l'isolamento di varie malattie di praticamente qualsiasi proteina di interesse.Questa strategia può essere adottata anche per isolare catene polipeptidiche troncate di natin derm Es. In generale, chi è nuovo a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà durante il passaggio di centrifugazione su gradiente di saccarosio. Tuttavia, per chi ha esperienza, ciò non dovrebbe rappresentare un problema. Abbiamo deciso di utilizzare una seconda sequenza di stallo per isolare i polipeptidi nascenti di gamma B cristallina legati al ribosoma 70S, dopo tentativi iniziali meno riusciti che prevedevano l'uso di mRNA privo del codone di stop.La tecnica successiva non è in grado di garantire la stabilità dei complessi ribosoma-catena nascente (RNC) durante i successivi passaggi di centrifugazione con la stessa efficienza della tecnica che prevede l'uso della sequenza di arresto SECM. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i passaggi relativi alla preparazione del gradiente e alla separazione degli RNC possono risultare difficili da apprendere e richiedono un certo livello di esperienza per ottenere risultati riproducibili. La dimostrazione della procedura sarà effettuata da uno studente laureando del mio laboratorio. Per eseguire la trascrizione e la traduzione in vitro, iniziare con un gene di interesse clonato in un qualsiasi plasmide basato su T7 e/o SP6 al fine di generare complessi ribosoma-catena nascente o RNC.Estendere il C-terminale del polipeptide bersaglio aggiungendo la sequenza induttrice di arresto proveniente da M, al fine di garantire che il frammento polipeptidico fuoriesca dal tunnel ribosomiale. Aggiungere un linker flessibile ricco di glicina e serina tra la proteina e la sequenza di arresto SEC M per preparare la trascrizione in vitro; utilizzare un enzima di restrizione che tagli a valle del frame di lettura aperto per linearizzare il DNA stampo ed eseguire un'elettroforesi su gel AROS per verificare la digestione completa del campione. Dopo aver verificato la concentrazione ottimale di DNA, utilizzare un kit di trascrizione ad alto rendimento seguendo le istruzioni del produttore per sintetizzare l'RNA messaggero.Utilizzare la precipitazione con cloruro di litio per purificare l'mRNA. Quindi eseguire un campione su un gel di acrilamide o aros per verificare la sua purezza. Per la traduzione in vitro.Utilizzando un sistema di e coli in acqua priva di nucleasi, aggiungere una miscela di aminoacidi da un millimolare, esclusa la metionina, 10 unità di inibitore della ribonucleasi, 20 microcurie di 35 s metionina, 20 microlitri di mix di reazione, 24 microlitri di buffer di ricostituzione e 24 microlitri di lisato di e coli. Prelasciare la reazione incubandola a 30 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi aggiungere da uno a due microgrammi di mRNA e incubare per ulteriori 10-15 minuti a 30 gradi Celsius.Interrompere la reazione ponendola sul ghiaccio per isolare i complessi di catena nascente legati ai ribosomi 70 S o ncs. Applicare la reazione di traduzione sopra 4,5 millilitri di un gradiente di saccarosio dal 5 al 30% in 20 millimoli di heaps, idrossido di potassio pH 7,5, 15 millimoli di magnesio, 100 millimoli di acetato di potassio e 1 millimole di DTT. Centrifugare a 41.000 giri al minuto per due ore a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, frazionare il gradiente di saccarosio utilizzando un sistema programmabile per gradienti di densità e un rivelatore di assorbanza impostato a 254 nanometri.Raccogliere le frazioni contenenti i ribosomi 70 S per ulteriori analisi al fine di determinare se la proteina allungata SEC M rimane associata al ribosoma 70 S. Precipitare la proteina in ciascuna frazione del gradiente aggiungendo acido tricloroacetico. Incubare i campioni tutta la notte a quattro gradi Celsius; il giorno successivo, centrifugare i campioni a 14.000 ×g per 15 minuti per ottenere il pellet proteico, quindi lavare i pellet in un rapporto di quattro a uno di acetone rispetto a tris 1 millimolare, HCl pH 7,6.Lasciare asciugare all'aria i pellet, quindi risospendere in tampone di caricamento per elettroforesi SDS-PAGE. Separare i campioni mediante elettroforesi SDS-PAGE in gel Tris-Tricine, quindi fissare e asciugare i gel e sottoporli ad autoradiografia e imaging fosfo-specifico come mostrato qui. Dopo la traduzione in vitro, i ribosomi 70 S sono stati isolati mediante centrifugazione su gradiente di saccarosio e frazionamento per garantire che la proteina gamma B cristallina rimanga stabilmente legata al ribosoma.Le frazioni contenenti il 70 s sono state raggruppate, desalate mediante scambio di tampone ed sottoposte a un ulteriore ciclo di centrifugazione su gradiente di saccarosio. I risultati qui presentati suggeriscono che SEC M può indurre in modo efficiente l'arresto traduttivo dei RNC della gamma B cristallina. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in una sola giornata lavorativa, fatta eccezione per l'analisi mediante elettroforesi su gel della catena nascente, che di solito prevede un passaggio di precipitazione con acido tricloroacetico (TCA) da eseguire durante la notte.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è ovviamente fondamentale evitare la contaminazione da RNA in ogni fase. La contaminazione da RNA può influenzare l'efficienza traduzionale dell'estratto e provocare il rilascio del polipeptide nascente dal ribosoma 70S. Seguendo questa procedura, è possibile ottenere NAST e polipeptidi di lunghezza predeterminata stabilmente legati al ribosoma 70S, a seconda dell'obiettivo finale.Questi complessi possono essere utilizzati per diversi scopi, come la determinazione della conformazione delle catene nascenti legate al ribosoma mediante approcci diretti e indiretti come NMR o FRET, oppure per testare il legame di fattori e ligandi dopo lo sviluppo del complesso. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia strutturale e del ripiegamento proteico, permettendo di esplorare la conformazione di proteine a lunghezza intera legate al ribosoma, nonché intermediari del ripiegamento co-traduzionale. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare e isolare polipeptidi nascenti strettamente legati al ribosoma 70 S, che possono essere successivamente utilizzati per rispondere a diverse domande nel campo del ripiegamento proteico traduzionale.Non dimenticare che lavorare con isotopi radioattivi e amminoacidi marcati, come ad esempio la metionina A 35, richiede precauzioni particolari e deve sempre essere tenuto in considerazione durante l'esecuzione di questa procedura.

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