Utilizzando Sequence SECM arresto come uno strumento per isolare ribosoma Polipeptidi Bound

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i complessi a catena nascente o RNC legati ai ribosomi SEC TED 70 prodotti durante la traduzione in un sistema privo di cellule in vitro. Ciò si ottiene introducendo prima una sequenza di stallo SEC M lunga 17 aminoacidi all'estremità terminale C del gene di interesse e clonandola a valle del promotore trascrizionale T sette. Successivamente, l'mRNA viene trascritto utilizzando una reazione di trascrizione in vitro e quindi purificato.

Quindi l'mRNA purificato viene tradotto in un sistema di estratto di S 30 E coli con amminoacidi radioattivi per marcare la proteina sintetizzata o il polipeptide nascente. Infine, i secondi complessi di catene nascenti legati ai ribosomi di Mr.Ed sono isolati mediante saccarosio, gradiente, centrifugazione e frazionamento. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano che le catene nascenti sono stabilmente legate al ribosoma 70 s mediante analisi elettroforesi su gel dei polipeptidi marcati isolati dalle frazioni del gradiente.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'uso di mRNA privo di codone stock è che in essa garantisce con elevata efficienza l'adesione della catena polipeptidica nascente al ribosoma 70 s durante la traduzione e la successiva fase di centrifugazione. Inoltre, a differenza della tecnologia a cordone no stop, questo metodo può essere utilizzato con un'efficienza quasi uguale sia nel sistema in vitro che in vivo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del ripiegamento translazionale delle proteine, come ad esempio quanto precocemente durante la traduzione potrebbero formarsi vari intermedi di ripiegamento tranlazionale e aiutare ulteriormente ad analizzare la loro struttura utilizzando la struttura diretta o indiretta.

Approcci di indagine e determinazione Questa tecnica può aiutarci a decifrare il percorso del ripiegamento delle proteine sul ribosoma. In questo protocollo, abbiamo descritto l'isolamento di catene nascenti cristalline bine gamma B a lunghezza intera legate al ribosoma 70 s. Ma questa tecnica può essere utilizzata per l'isolamento di varie malattie di praticamente qualsiasi proteina di interesse.

Questa strategia può essere adottata anche per isolare le catene polipeptidiche troncate della natina del derma Es.Generalmente i nuovi individui a questo metodo possono avere difficoltà durante la fase di centrifugazione del gradiente di saccarosio. Tuttavia, per la prima esperienza, questo non dovrebbe essere un problema. Abbiamo deciso di utilizzare la seconda sequenza di stallo per isolare i polipeptidi nascenti cristallini gamma B legati a 70 come ribosoma dopo i tentativi iniziali, meno riusciti, che hanno comportato l'uso di mRNA privo di cordone di arresto.

La tecnica successiva non è stata in grado di garantire la stabilità degli RNC durante le successive fasi di centrifugazione con la stessa efficienza della tecnica che prevede l'uso della sequenza di arresto SECM. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi che coinvolgono la preparazione del gradiente e la separazione dell'RNC possono essere difficili da apprendere e richiede un certo livello di esperienza per garantire risultati riproducibili La dimostrazione della postura sarà uno studente laureato del mio laboratorio per eseguire la trascrizione e la traduzione in vitro. Inizia con un gene di interesse che viene clonato in qualsiasi plasmide basato su T sette e/o SP sei per generare complessi a catena nascente di ribosomi o RNC.

Estendere l'estremità C del polipeptide bersaglio aggiungendo la sequenza che induce l'arresto da M per garantire che il frammento di polipeptide venga estruso dal tunnel ribosomiale. Aggiungere un linker ricco di glicina siriana flessibile tra la proteina e la sequenza di arresto SEC M per prepararsi alla trascrizione in vitro, enzima di restrizione dell'utente che taglierà a valle del frame di lettura aperto per linearizzare il DNA stampo eseguire l'elettroforesi su gel AROS per verificare la completa digestione del campione. Dopo aver verificato la concentrazione ottimale di DNA, utilizzare un kit di trascrizione ad alto rendimento secondo le istruzioni del produttore per sintetizzare l'RNA messaggero.

Utilizzare la precipitazione del cloruro di litio per purificare l'mRNA. Quindi eseguire un campione su un gel di acrilammide o aros per verificarne la purezza. Per la traduzione in vitro.

Utilizzando un sistema di e coli in acqua priva di nucleasi, aggiungere una miscela di un millimolare di aminoacidi meno metionina, 10 unità di inibitore della ribonucleasi 20, micro curie di 35 s metionina, 20 microlitri di miscela di reazione, 24 microlitri di tampone di ricostituzione e 24 microlitri di e coli. Lisato. Preriscaldare la reazione incubandola a 30 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi aggiungere uno o due microgrammi di mRNA e incubare per altri 10-15 minuti a 30 gradi Celsius.

Fermare la reazione mettendola su ghiaccio per isolare i complessi a catena nascente legati ai ribosomi 70 s o ncs. Sovrapporre la reazione di traslazione su 4,5 millilitri di un gradiente di saccarosio dal 5 al 30% in cumuli di 20 millimolari. Idrossido di potassio pH 7,5 15 millimolare di magnesio, 100 millimolare di acetato di potassio e una centrifuga DTT millimolare a 41.000 giri/min per due ore a quattro gradi Celsius dopo la centrifugazione, frazionano il gradiente di saccarosio utilizzando un sistema di gradiente di densità programmabile e un rivelatore di assorbanza impostato a 254 nanometri.

Raccogliere le frazioni contenenti ribosomi 70 s per ulteriori analisi per determinare se la proteina estesa SEC M rimane attaccata al ribosoma 70 s. Precipitare la proteina in ogni frazione di gradiente aggiungendo acido tricloroacetico. Incubare i campioni durante la notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo, centrifugare i campioni a 14.000 volte G per 15 minuti per pellettare la proteina, lavare i pellet in un rapporto di quattro a uno di acetone per un tris millimolare, HCL pH 7,6.

Asciugare i pellet all'aria, quindi risospenderli nel buffer di caricamento della pagina SDS. Risolvere i campioni con la pagina SDS tris Trice, quindi fissare e asciugare i gel e sottoporli a radiografia automatica e imaging fosfometrico come mostrato qui. Dopo la traduzione in vitro, i ribosomi 70 S sono stati isolati mediante saccarosio, gradiente, centrifugazione e frazionamento per garantire che la proteina cristallina gamma B rimanga stabilmente legata al ribosoma.

Le frazioni contenenti 70 s sono state raggruppate, desalinizzate, scambiate e sottoposte a un ulteriore ciclo di centrifugazione in gradiente di saccarosio. I risultati qui presentati suggeriscono che SEC M può indurre in modo efficiente l'arresto traduzionale degli RNC cristallini gamma B. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un giorno lavorativo ad eccezione dell'analisi elettroforesi su gel della catena nascente, che di solito comporta una fase di precipitazione del TCA durante la notte.

Durante il tentativo di questa procedura, è ovviamente fondamentale evitare la contaminazione degli RNA in qualsiasi fase. La contaminazione da RNS può influenzare l'efficienza traduzionale dell'estratto e portare al rilascio di polipeptide nascente dal 70° ribosoma. Seguendo questa procedura, si possono ottenere NAST e polipeptidi di lanxess predeterminati legati stabilmente al 70° ribosoma a seconda dell'obiettivo finale.

Questi complessi possono essere utilizzati per vari scopi come la determinazione della conferma delle catene nascenti legate ai ribosomi utilizzando approcci diretti e indiretti come NMR o fre, o testando il legame di fattori e ligando dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia strutturale e del ripiegamento delle proteine per esplorare la conferma delle proteine a lunghezza intera legate al ribosoma, nonché degli intermedi di ripiegamento traslazionale cot. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare e isolare il polipeptide nascente, legato stabilmente al ribosoma 70 s, che può essere ulteriormente utilizzato per rispondere a varie domande nel campo del ripiegamento delle proteine translazionali.

Non dimenticare che lavorare con isotopi radioattivi e acidi amminici marcati, come, ad esempio, la metionina A 35, richiede precauzioni speciali e dovrebbe essere sempre preso in considerazione durante l'esecuzione di questa procedura.