Utilizzando Sequence SECM arresto come uno strumento per isolare ribosoma Polipeptidi Bound

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare complessi ribosomiali SEC TED 70 S legati a catene nascenti, o RNC, prodotti durante la traduzione in un sistema acellulare in vitro. Questo viene ottenuto innanzitutto introducendo una sequenza di arresto SEC M lunga 17 amminoacidi all'estremità C-terminale del gene di interesse e clonandola a valle del promotore trascrizionale T7. Successivamente, l'mRNA viene trascritto mediante una reazione di trascrizione in vitro e quindi purificato.

Quindi l'mRNA purificato viene tradotto in un sistema di estratto S 30 di E. coli con amminoacidi radioattivi per marcare la proteina sintetizzata o la polipeptide nascente. Infine, i complessi di catena nascente legati al secondo ribosoma Mr.Ed vengono isolati mediante centrifugazione su gradiente di saccarosio e frazionamento. In definitiva, i risultati ottenuti possono dimostrare che le catene nascenti sono stabilmente legate al ribosoma 70 S mediante analisi elettroforetica su gel dei polipeptidi marcati isolati dalle frazioni del gradiente.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'uso di mRNA privo di codone di stop, consiste nella garanzia di un'elevata efficienza nell'ancoraggio della catena polipeptidica nascente al ribosoma 70 S durante la traduzione e nel successivo passaggio di centrifugazione. Inoltre, a differenza della tecnologia del codone di stop assente, questo metodo può essere utilizzato con efficienza quasi uguale sia in sistemi in vitro che in vivo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del ripiegamento proteico traduttivo, come ad esempio in che modo e quanto precocemente durante la traduzione possano formarsi intermediari del ripiegamento traduttivo, e aiutare ulteriormente ad analizzarne la struttura mediante tecniche strutturali dirette o indirette.

Approcci di analisi e determinazione Questa tecnica può aiutarci a decifrare il percorso del ripiegamento delle proteine sul ribosoma. In questo protocollo, abbiamo descritto l'isolamento di catene nascenti complete di cristallina gamma B legate ai ribosomi 70 S. Tuttavia, questa tecnica può essere utilizzata per l'isolamento di varie malattie di praticamente qualsiasi proteina di interesse.

Questa strategia può essere adottata anche per isolare catene polipeptidiche troncate di natin derm Es. In generale, chi è nuovo a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà durante il passaggio di centrifugazione su gradiente di saccarosio. Tuttavia, per chi ha esperienza, ciò non dovrebbe rappresentare un problema. Abbiamo deciso di utilizzare una seconda sequenza di stallo per isolare i polipeptidi nascenti di gamma B cristallina legati al ribosoma 70S, dopo tentativi iniziali meno riusciti che prevedevano l'uso di mRNA privo del codone di stop.

La tecnica successiva non è in grado di garantire la stabilità dei complessi ribosoma-catena nascente (RNC) durante i successivi passaggi di centrifugazione con la stessa efficienza della tecnica che prevede l'uso della sequenza di arresto SECM. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i passaggi relativi alla preparazione del gradiente e alla separazione degli RNC possono risultare difficili da apprendere e richiedono un certo livello di esperienza per ottenere risultati riproducibili. La dimostrazione della procedura sarà effettuata da uno studente laureando del mio laboratorio. Per eseguire la trascrizione e la traduzione in vitro, iniziare con un gene di interesse clonato in un qualsiasi plasmide basato su T7 e/o SP6 al fine di generare complessi ribosoma-catena nascente o RNC.

Estendere il C-terminale del polipeptide bersaglio aggiungendo la sequenza induttrice di arresto proveniente da M, al fine di garantire che il frammento polipeptidico fuoriesca dal tunnel ribosomiale. Aggiungere un linker flessibile ricco di glicina e serina tra la proteina e la sequenza di arresto SEC M per preparare la trascrizione in vitro; utilizzare un enzima di restrizione che tagli a valle del frame di lettura aperto per linearizzare il DNA stampo ed eseguire un'elettroforesi su gel AROS per verificare la digestione completa del campione. Dopo aver verificato la concentrazione ottimale di DNA, utilizzare un kit di trascrizione ad alto rendimento seguendo le istruzioni del produttore per sintetizzare l'RNA messaggero.

Utilizzare la precipitazione con cloruro di litio per purificare l'mRNA. Quindi eseguire un campione su un gel di acrilamide o aros per verificare la sua purezza. Per la traduzione in vitro.

Utilizzando un sistema di e coli in acqua priva di nucleasi, aggiungere una miscela di aminoacidi da un millimolare, esclusa la metionina, 10 unità di inibitore della ribonucleasi, 20 microcurie di 35 s metionina, 20 microlitri di mix di reazione, 24 microlitri di buffer di ricostituzione e 24 microlitri di lisato di e coli. Prelasciare la reazione incubandola a 30 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi aggiungere da uno a due microgrammi di mRNA e incubare per ulteriori 10-15 minuti a 30 gradi Celsius.

Interrompere la reazione ponendola sul ghiaccio per isolare i complessi di catena nascente legati ai ribosomi 70 S o ncs. Applicare la reazione di traduzione sopra 4,5 millilitri di un gradiente di saccarosio dal 5 al 30% in 20 millimoli di heaps, idrossido di potassio pH 7,5, 15 millimoli di magnesio, 100 millimoli di acetato di potassio e 1 millimole di DTT. Centrifugare a 41.000 giri al minuto per due ore a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, frazionare il gradiente di saccarosio utilizzando un sistema programmabile per gradienti di densità e un rivelatore di assorbanza impostato a 254 nanometri.

Raccogliere le frazioni contenenti i ribosomi 70 S per ulteriori analisi al fine di determinare se la proteina allungata SEC M rimane associata al ribosoma 70 S. Precipitare la proteina in ciascuna frazione del gradiente aggiungendo acido tricloroacetico. Incubare i campioni tutta la notte a quattro gradi Celsius; il giorno successivo, centrifugare i campioni a 14.000 ×g per 15 minuti per ottenere il pellet proteico, quindi lavare i pellet in un rapporto di quattro a uno di acetone rispetto a tris 1 millimolare, HCl pH 7,6.

Lasciare asciugare all'aria i pellet, quindi risospendere in tampone di caricamento per elettroforesi SDS-PAGE. Separare i campioni mediante elettroforesi SDS-PAGE in gel Tris-Tricine, quindi fissare e asciugare i gel e sottoporli ad autoradiografia e imaging fosfo-specifico come mostrato qui. Dopo la traduzione in vitro, i ribosomi 70 S sono stati isolati mediante centrifugazione su gradiente di saccarosio e frazionamento per garantire che la proteina gamma B cristallina rimanga stabilmente legata al ribosoma.

Le frazioni contenenti il 70 s sono state raggruppate, desalate mediante scambio di tampone ed sottoposte a un ulteriore ciclo di centrifugazione su gradiente di saccarosio. I risultati qui presentati suggeriscono che SEC M può indurre in modo efficiente l'arresto traduttivo dei RNC della gamma B cristallina. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in una sola giornata lavorativa, fatta eccezione per l'analisi mediante elettroforesi su gel della catena nascente, che di solito prevede un passaggio di precipitazione con acido tricloroacetico (TCA) da eseguire durante la notte.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è ovviamente fondamentale evitare la contaminazione da RNA in ogni fase. La contaminazione da RNA può influenzare l'efficienza traduzionale dell'estratto e provocare il rilascio del polipeptide nascente dal ribosoma 70S. Seguendo questa procedura, è possibile ottenere NAST e polipeptidi di lunghezza predeterminata stabilmente legati al ribosoma 70S, a seconda dell'obiettivo finale.

Questi complessi possono essere utilizzati per diversi scopi, come la determinazione della conformazione delle catene nascenti legate al ribosoma mediante approcci diretti e indiretti come NMR o FRET, oppure per testare il legame di fattori e ligandi dopo lo sviluppo del complesso. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia strutturale e del ripiegamento proteico, permettendo di esplorare la conformazione di proteine a lunghezza intera legate al ribosoma, nonché intermediari del ripiegamento co-traduzionale. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare e isolare polipeptidi nascenti strettamente legati al ribosoma 70 S, che possono essere successivamente utilizzati per rispondere a diverse domande nel campo del ripiegamento proteico traduzionale.

Non dimenticare che lavorare con isotopi radioattivi e amminoacidi marcati, come ad esempio la metionina A 35, richiede precauzioni particolari e deve sempre essere tenuto in considerazione durante l'esecuzione di questa procedura.