Purificazione per affinità di Complessi virus influenzali ribonucleoproteina dalla cromatina delle cellule infettate

Filamento liconegativo, virus a RNA. Il genoma dei virus influenzali è confezionato sotto forma di complessi proteici nucleari virali rib, o VR nps in cui il genoma a singolo filamento è incapsulato dalla proteina nucleare e associato al complesso della curcuma polimerasi costituito dalle subunità PA PB uno e PB due per purificare i complessi intatti dalle cellule di mammifero infette. Le cellule Hela vengono incubate con il virus dell'influenza ricombinante marcato con strept.

Una volta che il virus entra nelle cellule, l'RNA virale viene sintetizzato nei nuclei dopo l'infezione, le cellule vengono bugie utilizzando un detergente e frazionate in frazioni nucleari citoplasmatiche e di cromatina utilizzando la centrifugazione e il protocollo della frazione della cromatina basato sull'assalto. Infine, i VRP marcati con strept sono purificati per affinità da ciascuna frazione L'analisi della composizione proteica e dell'RNA del VR NPS purificato mediante colorazione con argento dimostra che utilizzando questo protocollo anche in modo stretto, i VRP legati alla cromatina possono essere isolati. Intatto. Quindi, uno dei principali vantaggi del nostro protocollo rispetto ai metodi standard per la purificazione dell'affinità dei complessi proteici nucleari delle costole del virus dell'influenza è che, utilizzando il nostro metodo, è possibile purificare VR NPS dalla cromatina delle cellule infette, che è nota per essere il sito di sintesi dell'mRNA del virus dell'influenza.

Quindi il nostro metodo potrebbe essere utilizzato per rispondere a domande relative alla regolazione della replicazione e della trascrizione virale, come, ad esempio, quali fattori virali o cellulari, ma anche quali modifiche post-traduzionali sono necessarie, ad esempio, per la sintesi dell'mRNA virale o anche per la sintesi dell'RNA genomico virale. Quindi i ricercatori nuovi a questo metodo potrebbero incontrare qualche difficoltà perché il frazionamento subnucleare è molto sensibile alle condizioni biochimiche e può anche variare notevolmente tra le diverse linee cellulari. Inizia questo protocollo con guarire le nostre cellule che sono state infettate dal virus dell'influenza, RWSN PB due streptococco, che ha un tag streptococco geneticamente fuso al C terminale della subunità PB due a una molteplicità di infezione di tre.

Lavare le celle una volta con PBS freddo, quindi aggiungere 12 millilitri di PBS freddo e rimuoverle dal piatto. Utilizzando un raschietto di gomma. Trasferire le celle in una provetta conica da 50 millilitri e pellettizzarle per centrifugazione.

L'aspetto più difficile di questa procedura è il protocollo di frazionamento cellulare. I nuclei cellulari sono molto sensibili alle procedure di omogeneizzazione e miscelazione e, se eseguite in modo errato, possono facilmente rovinare un estratto di cromatina. Quindi è molto importante seguire non solo le tecniche di omogeneizzazione, ma anche la gestione generale dei lisati, come mostriamo qui.

Dopo l'aspirato di centrifuga, il PBS e il Resus, sospendono il pellet cellulare in 10 millilitri di tampone di saccarosio freddo. Collegare un puntale per pipetta da 200 microlitri a una pipetta di plastica per siero da 10 millilitri e far passare le cellule attraverso di essa per rompere i grumi di cellule. Incubare la sospensione con ghiaccio per 10 minuti.

Capovolgere periodicamente le cellule delicatamente per risospenderle. Quindi, aggiungere non IET P 40 a una concentrazione finale dello 0,5% e agitare ad alta velocità per 15 secondi, centrifugare immediatamente per 10 minuti a 3, 500 volte G a quattro gradi Celsius in una centrifuga da tavolo. Dopo la centrifuga, rimuovere il supinato e trasferirlo in un tubo conico da 15 millilitri.

Conservare il supinato a quattro gradi Celsius. Questa è una frazione citoplasmatica. Il pellet dovrebbe essere più piccolo e più bianco del pellet della cella originale, come mostrato qui.

Se il protocollo verrà completato in un secondo momento, conservare il pellet della cella a quattro gradi Celsius. In caso contrario, continuare lavando il pellet in cinque millilitri di saccarosio freddo, tampone e centrifugando come prima. Una volta completata la centrifuga, scartare il supinato e risospendere il pellet, che contiene i nuclei in 1,5 millilitri di tampone di estrazione plasmatica nucleare fredda.

Trasferire il pellet risospeso in un omogeneizzatore da danza da quattro millilitri di vetro raffreddato con un pestello aderente e omogeneizzare i nuclei con 20 colpi. Evitando la formazione di schiuma, la resistenza dovrebbe aumentare dopo circa 10 colpi. Per confermare un'omogeneizzazione efficiente, esaminare il campione al microscopio a contrasto di fase.

I nuclei non dovrebbero più essere rotondi, ma avere forme irregolari e apparire come se fossero scoppiati. Una volta omogeneizzati i nuclei, trasferirli in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Incubare l'omogeneizzato su una ruota rotante a quattro gradi Celsius per 20 minuti.

Quindi centrifugare a 16.000 volte G in una microcentrifuga per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifuga, trasferire il supinato, che è la frazione plasmatica nucleare, in una provetta da 1,5 millilitri e conservarlo a quattro gradi Celsius. Quindi Reese sospende il pellet in 1,5 millilitri di digestione, preriscaldare il tampone a 37 gradi Celsius.

Quindi incubare la frazione per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere 42 microlitri di cloruro di sodio a cinque molari per portare la concentrazione finale di cloruro di sodio a 150 millimolari, quindi incubare per 20 minuti su ghiaccio. Centrifugare a 16.000 volte, G in una microcentrifuga a quattro gradi Celsius per 10 minuti.

Dopo la centrifuga, rimuovere il supinato e conservarlo a quattro gradi Celsius. Questa è la frazione CH uno 50. Reeses piega il pellet in 1,5 millilitri di tampone freddo ad alto contenuto di sale e incuba per 20 minuti sul ghiaccio.

Centrifugare a 16.000 volte, G in una microcentrifuga a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Dopo la centrifuga, rimuovere il surnatante e conservarlo a quattro gradi Celsius. Questa è la frazione CH 500.

Estrarre le frazioni risparmiate durante il protocollo di frazionamento e metterle sul ghiaccio. Quindi, alla frazione citoplasmatica, aggiungere 300 microlitri di cloruro di sodio a cinque molari. Quindi trasferire 100 microlitri di streptococco T confezionato in perle Sphero per frazione in una provetta conica da 15 millilitri.

Aggiungere 10 volumi di tampone per il lavaggio dello streptococco alle perline. Capovolgere la provetta per mescolare e centrifugare per cinque minuti a 1000 volte. G in una centrifuga da tavolo, scartare l'sna.

Ripetere il lavaggio del tampone due volte, quindi piegare il pellet in un volume uguale di tampone di lavaggio per streptococco, aggiungere 200 microlitri di morsa di streptococco lavato agire in liquame di perline a ciascuna frazione. Ruotare i tubi per un'ora a quattro gradi Celsius. Quindi centrifugare le provette per un minuto a 1000 volte G di quattro gradi Celsius, scartare il supinato.

Quindi aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio alle perle per le perle incubate con la frazione citoplasmatica in una provetta da 15 millilitri. Aggiungere il tampone di lavaggio e trasferire le perline in un tubo da 1,5 millilitri. Lavare le perle per un minuto, quindi centrifugare le provette per un minuto a 1000 volte G a quattro gradi Celsius.

Ripetere due volte dopo l'ultima fase di lavaggio. Rimuovere tutte le tracce del tampone di lavaggio utilizzando una punta piatta per pipetta. Quindi aggiungere 100 microlitri di tampone elucian e mescolare delicatamente e posizionare i tubi sul ghiaccio per 15 minuti.

Durante l'incubazione, mescolare di tanto in tanto le perle picchiettando delicatamente il fondo delle provette. Dopo 15 minuti sono passati la centrifuga a scelta per un minuto a 1000 volte G a quattro gradi centigradi. Raccogli la Senna contenente i VRP etichettati con lo streptococco eluito.

Lui, le nostre cellule sono state infettate con il ceppo del virus dell'influenza, WSN per nove ore, e i lisati frazionati sono stati analizzati mediante fioritura occidentale come mostrato qui. L'isolamento nucleare delicato estrae in modo efficiente le proteine citoplasmatiche come la tubulina, evitando il rilascio di abbondanti proteine nucleari. Si noti che la frazione cromatinica estratta con un basso contenuto di sale è arricchita in proteine importanti per la trascrizione.

Mentre l'alta frazione salina contiene principalmente nucleosomi per determinare la composizione proteica della frazione citoplasmatica eluita, le NPS V delle cellule R infettate per nove ore con virus non marcato, RWSN o RWSN PB due streptococco sono state analizzate mediante colorazione con argento come mostrato per un eluato citoplasmatico. Qui c'è un alto rapporto tra NP e PA, PB uno, PB due, come evidenziato dalla banda maggiore sopra i 55 kilodalton rispetto alle bande tra 95 e 100 kilodalton, suggerendo che la maggior parte dello streptococco PB 2 viene purificato come parte di un VRNP completamente formato, o in altre parole, viene catturata poca polimerasi solubile per confrontare le rese relative. VR: NPS purificato dopo nove ore dall'infezione con RWSN, PB, due streptococco o RWSN o argento colorato come mostrato in questo gel colorante d'argento v RMP può essere purificato da tutte e quattro le frazioni cellulari dopo nove ore dall'infezione.

La più alta concentrazione di v RMPs si trova nel plasma nucleare, sebbene porzioni considerevoli possano anche essere purificate dal citoplasma e dalla cromatina. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come purificare alte rese di complessi ribonucleoproteici intatti del virus dell'influenza dal nucleo delle cellule infette. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di utilizzare tamponi puliti e di evitare di esporre inutilmente i campioni a temperatura ambiente perché in questo modo è possibile evitare la degradazione sia dell'RNA che delle proteine, nonché evitare lo smontaggio del complesso proteico.

E non dimenticare che lavorare con un virus influenzale infettivo può essere pericoloso. Tutte le fasi devono essere eseguite sotto un banco di lavoro di livello di biosicurezza due fino a quando NP 40 non è stato aggiunto ai lisati.