Due metodi di Formazione Heterokaryon per scoprire fattori di restrizione HCV

Lo scopo di questa procedura è studiare l'impatto dei fattori di restrizione sul completamento del ciclo di replicazione del virus dell'epatite C in una qualsiasi linea cellulare, utilizzando due metodi che si basano sulla formazione di Heca. Per il primo metodo, iniziare coltivando cellule epatiche umane, nonché cellule impacchettanti Heal A e Hep 56 1D. Successivamente, trasfettare l'RNA del virus dell'epatite C (HCV) nelle cellule epatiche mediante elettroporazione. In seguito, fondere la linea cellulare con replicazione dell'HCV con la rispettiva linea cellulare impacchettante mediante polietilene glicole, nel secondo metodo di fusione. Il primo passaggio consiste nella produzione di una scorta di HCV ad alto titolo.

Successivamente, diverse linee cellulari vengono co-colture e la fusione cellulare viene indotta tramite trasfezione della glicoproteina del virus della foamy a prototipo. In seguito, i carioni etero vengono infettati con HCV. Dopo uno qualsiasi dei metodi di formazione dei carioni etero, si esegue la microscopia fluorescente per confermare la fusione e la produzione di particelle infettive viene quantificata.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che è utile per lo screening di un ampio pannello di linee cellulari e cellule primarie per l'espressione di fattori di restrizione dominanti specifici per HV. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali sulla specificità di specie e sui noms dell'HCV. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per facilitare la comprensione dei concetti alla base dei due sistemi di fusione, prima dell'induzione della fusione cellulare mediante polietilene glicole.

Le cellule HUH 7.5 vengono trasfettate con H-C-V-R-N-A seguendo protocolli standard e coltivate per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica il giorno successivo. Raccogliere le cellule HUH 7.5 trasfettate che ospitano il replicone subgenomico, nonché le cellule impacchettanti heal R e he 56 1D. Queste cellule impacchettanti sono state ingegnerizzate per esprimere in modo ectopico le proteine del virus dell'epatite C: core, E1, E2, P7 e NS2. Dopo la tripsinizzazione, risospendere le cellule in mezzo completo DMEM e diluire le sospensioni cellulari alle seguenti concentrazioni: HUH 7.5 a cinque volte 10 alla cinque cellule per millilitro e cellule heal e hep 56 1D a due volte 10 alla cinque cellule per millilitro.

Successivamente, preparare una piastra per colture a sei pozzetti con due o tre lamelle di vetro sterili per pozzetto. Per un'ulteriore analisi dell'efficienza di fusione, combinare un millilitro di cellule HUH 7.5 transfezionate con un millilitro di cellule d'imballaggio e seminare in un pozzetto della piastra a sei pozzetti; incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo 24 ore, verificare la densità cellulare.

La densità cellulare deve essere compresa tra il 60 e l'80% di confluenza prima dell'induzione della fusione cellulare, in modo che le cellule siano in prossimità tale da permettere la fusione delle membrane cellulari. Aspirare il mezzo dalle cellule in co-coltura e lavare una volta con un millilitro di PBS. Quindi aggiungere con attenzione 500 microlitri di polietilene glicole al 40% preriscaldato, o PEG 1,500. Aggiungere 500 microlitri di PBS in un altro pozzetto contenente cellule in co-coltura come controllo. Incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius per indurre la formazione di eterocarioni. Aspirare il PEG e aggiungere con attenzione due millilitri di PBS. Dopo un minuto, aspirare il PBS e aggiungere due millilitri di PBS fresco. Lavare con PBS da tre a cinque volte, per un minuto per ogni lavaggio, per rimuovere l'eccesso di PEG.

Infine, aggiungere due millilitri di DMEM, mezzo completo, in ogni pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 48 ore. 48 ore dopo la fusione. Raccogliere ogni SNAT e filtrare attraverso un filtro da 0,45 micron; dopo aver raccolto il surnatante della coltura cellulare, l'efficienza di fusione può essere determinata mediante immunofluorescenza. Lavare i pozzetti contenenti coprivetri una volta con un millilitro di PBS per un minuto.

Fissare le cellule con 600 microlitri di paraformaldeide al 3% in PBS per 15 minuti. Lavare tre volte con PBS per un minuto ogni lavaggio; dopo l'ultimo lavaggio, utilizzare pinzette per trasferire con attenzione i coverslip in una piastra a 24 pozzetti contenente cellule permeabili con 500 microlitri di Triton X-100 allo 0,5% in PBS per cinque minuti.

Successivamente lavare tre volte con PBS e applicare 250 microlitri di soluzione di anticorpo primario a ciascun pozzetto. Utilizzare un anticorpo anti-NS5A a una concentrazione di 0,5 microgrammi per millilitro e un anticorpo monoclonale umano anti-E2 a una concentrazione di 6,4 nanogrammi per millilitro. Incubare per 45 minuti a temperatura ambiente. Dopo 45 minuti, lavare tre volte con PBS.

Successivamente, aggiungere 250 microlitri di anticorpi secondari in ogni pozzetto; vengono utilizzati anticorpi secondari di capra anti-topo o capra anti-uomo IgG coniugati con Alexa Fluor 546 o Alexa Fluor 488 a una concentrazione di due microgrammi per millilitro. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Dopo 30 minuti, lavare una volta con PBS.

Successivamente, colorare i nuclei cellulari con 250 microlitri di DPI diluiti 1:3000 in PBS. Incubare per un minuto a temperatura ambiente al buio, lavare quattro volte con PBS e una volta con acqua. Infine, montare i coprioggetti al contrario su una goccia di FloraMount su un vetrino da microscopia e lasciarli asciugare al buio.

Per iniziare questa procedura, raccogliere e preparare sospensioni cellulari singole dei seguenti tipi cellulari. Linea cellulare epatica umana Luna NA che non esprime in modo endogeno CD81. Cellule da imballaggio He r e cellule Hep561D che esprimono stabilmente CD81 umano. Co-coltivare le cellule Luna n con le cellule he r in rapporto uno a uno e con le cellule Hep561D HCD81 in rapporto uno a due, ottenendo una densità cellulare totale di 1,5 × 10⁵ cellule per pozzetto da 12.

Incubare bene per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica il giorno seguente. Trasfettare transitoriamente le cellule con una proteina dell'involucro PFE altamente fusogena utilizzando Lipoctamino 2000 secondo le istruzioni del produttore. 30 ore dopo la trasfezione con la glicoproteina PFE, inoculare gli eterocarioni con 350 microlitri di un ceppo virale precedentemente preparato a un MOI di circa 2,3.

Incubare per 12 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica al mattino seguente. Lavare una volta con PBS e aggiungere un millilitro di mezzo DMEM completo per pozzetto; incubare per 48 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo 48 ore, raccogliere il sopernatante delle colture di eterocarion, filtrare il sopernatante attraverso un filtro da 0,45 micron. Successivamente, utilizzare il sopernatante per inoculare cellule HUH 7.5 seminate il giorno precedente in piastre a 96 pozzetti in un saggio di diluzione limite; incubare per 72 ore prima di quantificare la produzione di particelle infettive progenie.

La procedura per visualizzare gli eventi di fusione deve essere completata sei ore prima del lavaggio della coltura mista. Lavare le cellule aderenti una volta con cinque millilitri di PBS, quindi aggiungere quattro millilitri della soluzione DI appropriata per ogni piastra da 10 centimetri. Incubare le cellule per 45 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Lavare le cellule una volta con cinque millilitri di PBS per un minuto, quindi aggiungere il mezzo completo DMEM. Incubare per sei ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica prima della semina. Aggiungere un coverslip in ogni pozzetto della piastra a 12 pozzetti, quindi seminare e trasfettare le cellule, come mostrato in precedenza. A 30 ore dalla trasfezione, lavare delicatamente le cellule con un millilitro di PBS per un minuto, quindi fissare le cellule con 250 microlitri di paraformaldeide al 3% per 15 minuti a temperatura ambiente.

Lavare le cellule una volta con un millilitro di PBS per un minuto, quindi colorare con dappy per un minuto dopo aver lavato le cellule una volta con PBS e una volta con acqua. Montare coprioggetti, occhiali da sole, vetrini nel primo approccio per indagare l'impatto dei fattori di restrizione sul completamento del ciclo di replicazione dell'HCV. In eterocarioni, le cellule HUH 7.5 sono state inizialmente transfezionate in modo transitorio con un replicone subgenomico che esprime un transgene luciferasi e le proteine non strutturali dell'HCV, quindi coltivate in co-coltura e fuse a linee cellulari che esprimono le proteine strutturali core e le proteine accessorie dell'HCV. Un risultato rappresentativo è mostrato in questa figura: cellule o immunomarcate mediante anticorpi monoclonali diretti contro la proteina strutturale E2 e la proteina non strutturale NS5A.

Le immagini nei pannelli superiori mostrano che, dopo il trattamento con PEG, i segnali per MS five A e D due sono stati rilevati contemporaneamente nello stesso citoplasma, indicando una fusione autofusa. Al contrario, nei pannelli inferiori si osserva che, quando le cellule in co-coltura sono state trattate con PBS, non si è verificata alcuna fusione. Pertanto, non è stata osservata alcuna colocalizzazione di segnali. Per quantificare l'infecciosità virale, i supernatanti sono stati raccolti dalle co-colture a 48 ore dall'induzione della fusione ed utilizzati per inoculare cellule HUH 7.5 naive, destinate successivamente a saggi di luciferasi.

In questo grafico vengono visualizzati i valori medi di tre esperimenti indipendenti. La barra orizzontale grigia rappresenta lo sfondo per le unità di luce relative o RLU determinate in cellule HUH 7.5 non infette. In particolare, quando le cellule replicanti HUH 7.5 sono state fuse con linee cellulari naive o trattate con PBS come controllo, nessuna infettività è stata rilevata nei fluidi di coltura.

Tuttavia, quando la fusione cellulare tra la linea cellulare con replicone HUH 7.5 e le linee cellulari impacchettanti è stata indotta mediante PEG, particelle virali infettive sono state rilasciate nei fluidi di coltura. Ciò indica che la produzione del virus richiede la fusione cellulare e l'espressione di proteine virali nelle linee cellulari impacchettanti, in modo notevole non solo nei cari etero delle cellule di epatocarcinoma umano HUH 7.5, ma anche nei cari etero con cellule epatiche umane non epatiche e di topo, consentendo il rilascio virale, a indicare che l'assemblaggio e il rilascio non sono dominanti inibiti da possibili fattori di restrizione in questi tipi cellulari. In un approccio alternativo, la fusione di cellule somatiche è stata indotta dall'espressione di una glicoproteina virale dopo la coltivazione delle cellule.

I caroni etero sono stati visualizzati colorando linee cellulari separate con coloranti tracker per cellule prima della cocoltura e della trasfezione con le cellule proteiche. Le cellule sono state fissate e colorate con DPI 30 ore dopo la trasfezione, e nel presente figura è mostrato un risultato rappresentativo. La fusione di due tipi cellulari è indicata da un carone etero con distribuzione omogenea dei coloranti nel citoplasma, come illustrato qui. Al contrario, le immagini nel pannello inferiore mostrano l’assenza di cellule con citoplasma doppiamente colorato, indicando l’assenza di fusione cellulare.

Questo grafico finale mostra che tutti i fattori di ingresso dell'HCV sono espressi esclusivamente in etero-portatori di cellule Luna N con cellule hela o Hep 56 1D che esprimono CD 81 umano. In questo caso, le colture sono state inoculate con particelle infettive di HCV. I fluidi di coltura sono stati raccolti dopo 48 ore e il rilascio *de novo* di particelle dagli etero-portatori è stato determinato mediante saggio di diluizione limite, utilizzando come cellule bersaglio naive HUH 7.5. Sono riportati i valori medi di tre esperimenti indipendenti e la barra orizzontale grigia rappresenta il limite di rilevamento del saggio.

Come controllo, cellule lunar N sono state fuse con cellule lunar N, il che ha portato a livelli molto bassi di HCV infettivo, prossimi al limite di rilevamento. Risultati simili sono stati ottenuti quando cellule lunar N sono state fuse con cellule HEP 56 1D naive. In entrambi i casi, il CD 81 umano era assente, quindi l'HCV non poteva infettare in modo produttivo gli eteros.

Al contrario, è stata osservata una produzione de novo di progenie virale infettiva circa dieci volte superiore al livello di fondo del saggio in cellule lunar 10 trattate con heer e in cellule lunar hand fuse con cellule HEP 56 1D che esprimono CD 81 umano. Ciò indica che HCV ha completato con successo il suo ciclo di replicazione in RetroCars, escludendo così l'espressione di fattori restrittivi dominanti in queste linee cellulari. Una volta padroneggiata, l'intera procedura sperimentale può essere completata in una settimana se eseguita correttamente.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come generare etero carryon per l'identificazione di possibili fattori di restrizione HV. Non dimenticare che lavorare con il virus dell'epatite C può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come un'elevata sicurezza biologica devono sempre essere prese in considerazione durante l'esecuzione di questa procedura.