Isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale e il loro uso nello studio della trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cellule endoteliali umane di alta qualità e utilizzarle per esaminare i meccanismi che regolano la trasemigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso. Questo viene realizzato isolando e seminando innanzitutto cellule endoteliali da vena ombelicale umana. Il secondo passaggio consiste nel suddividere le cellule in camere IBD.

In seguito, neutrofili umani appena isolati vengono fatti scorrere su cellule endoteliali attivate, inducendo il rotolamento dei neutrofili, l'adesione ferma e la trasmissionrazione. L'ultimo passaggio consiste nel quantificare la trasmissionrazione mediante microscopia video. Infine, la microscopia fluorescente e la microscopia in campo chiaro possono essere utilizzate per valutare la trasmissionrazione dei neutrofili attraverso le cellule endoteliali attivate.

L'isolamento delle cellule endoteliali è facile da descrivere, ma difficile da apprendere in parte perché richiede la visualizzazione della vena ombelicale in alcuni passaggi chiave. Per questo motivo, la dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale. Questo metodo ci aiuterà a comprendere domande fondamentali nel campo dell'infiammazione, come il modo in cui il reclutamento dei leucociti avviene in condizioni di flusso, e permetterà una migliore comprensione del comportamento delle cellule endoteliali in condizioni di flusso.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul reclutamento dei neutrofili durante l'infiammazione, può essere applicato anche a popolazioni rare di leucociti come le cellule natural killer e gli eosinofili. A dimostrazione di questa procedura, insieme a Ritu Sharma, c'è Hong Jang, un tecnico del mio laboratorio. Almeno un'ora prima della procedura, preriscaldare e quindi incubare una fiasca T 75 con gelatina a 37 gradi Celsius.

Quindi iniziare la procedura di isolamento delle cellule endoteliali all'interno della cappa a flusso laminare utilizzando un paio di forbici per tagliare il cordone ombelicale dalla placenta. Dopo aver indossato guanti sterili, esaminare attentamente il cordone e scartare eventuali porzioni che contengono coaguli di sangue o che sono danneggiate a causa della pinzatura del cordone durante il parto. Successivamente, identificare le due arterie e la singola vena presenti nel cordone.

Successivamente, inserire delicatamente una cannula con un rubinetto a due vie collegato in un'estremità della vena, quindi posizionare una pinza intorno alla cannula per fissarla saldamente in posizione. Una delle parti più difficili della procedura è la perfusione del cordone ombelicale. Per garantire che questa operazione venga eseguita correttamente, perfondere il cordone con un eccesso di tampone e osservare il flusso finché non diventa limpido.

Perfondere la vena con tampone del cordone fino a quando il flusso in uscita non diventa limpido, quindi clampare l'estremità del cordone. A volte, durante la perfusione, si rivela un piccolo foro perché i medici hanno prelevato sangue dal cordone ombelicale. In queste situazioni, è possibile utilizzare pinze emostatiche per ostruire il foro e continuare la perfusione mentre si isolano le cellule endoteliali.

È estremamente importante dosare con precisione il tempo di trattamento con la collaghenasi. Un tempo troppo breve non consente di isolare un numero sufficiente di cellule endoteliali, mentre un tempo eccessivo può causare la contaminazione da cellule muscolari lisce o danneggiare le cellule endoteliali. Successivamente, perfondere la vena con collaghenasi appena preparata e riscaldata.

Chiudere il rubinetto e incubare il cordone in un becher contenente tampone caldo per cordone. Dopo 10 minuti, rimuoverlo e massaggiare delicatamente il cordone per staccare le cellule endoteliali dalla parete del lume venoso. Svuotare la soluzione in un tubo contenente cinque millilitri di terreno per cellule endoteliali o ECM, lavando il cordone due volte con tampone per cordone per rimuovere eventuali cellule residue.

Ora centrifugare le cellule per 10 minuti a 350 × g a temperatura ambiente, rimuovere il soprannatante e quindi risospendere il pellet in 10 millilitri di mezzo per cellule endoteliali. Trasferire le cellule nel flacone T75 rivestito con gelatina e coltivare le cellule endoteliali durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% CO₂. Il giorno successivo, agitare delicatamente il flacone per staccare eventuali globuli rossi.

Quindi rimuovere il soprannatante e lavare la coltura di cellule endoteliali con HBSS tiepido. Dopo aver rimosso l'HBSS, nutrire le cellule con 10 millilitri di ECM tiepido. Successivamente, esaminare le cellule al microscopio per accertarsi che i globuli rossi siano stati rimossi e per valutare il grado di confluenza e la morfologia delle cellule endoteliali.

Continuare a cambiare il mezzo ogni tre giorni fino a quando le cellule non raggiungono la confluenza. A questo punto, suddividere le cellule utilizzando una soluzione di tripsina ed EDTA. Successivamente, raccogliere le cellule staccate e risospendere in ECM.

Infine, ricoprire ogni pozzetto di una camera IBD con gelatina. Rimuovere l'eccesso di gelatina e quindi aggiungere 1,5 × 10⁶ per millilitro della sospensione di cellule endoteliali in ogni pozzetto della camera. Iniziare inducendo l'upregolazione dell'espressione sulla superficie cellulare di molecole di adesione e di attivazione incubando le cellule endoteliali con un opportuno stimolante mentre le cellule endoteliali vengono attivate.

Isolare i neutrofili dal sangue periferico di volontari umani sani mediante centrifugazione su gradiente di densità come precedentemente pubblicato, quindi sospendere le cellule a una concentrazione di 1 × 10⁶ per millilitro in HBSS più albumina umana. Dopo aver predisposto il microscopio, collegare la camera IBD contenente le cellule endoteliali stimolate al tubo del microscopio. Selezionare l'obiettivo a contrasto di fase 10x, quindi impostare la pompa a siringa per aspirare e avviare il flusso di HBSS al tensio tagliente desiderato.

Fermare brevemente il flusso ruotando il rubinetto a tre vie sul lato di uscita in posizione chiusa e passando dalla linea di ingresso di HBSS ai neutrofili isolati. Riavviare il flusso ruotando nuovamente il rubinetto in posizione aperta. Quindi iniziare la registrazione utilizzando una telecamera CCD collegata a un registratore DVD.

Avviare il cronometro. Quando i neutrofili entrano nella camera dopo quattro minuti, ripassare all'HBSS per evitare l'adesione di nuovi neutrofili. Se si desiderano dati sulle interazioni totali, sul rotolamento e sull'adesione ferma, utilizzare un obiettivo 10x a contrasto di fase.

Obiettivo: acquisire sei campi casuali per 10 secondi ciascuno tra il quarto e il quinto minuto. Infine, passare a un obiettivo 40x e registrare un singolo campo visivo al momento di interesse. Dopo la perfusione dei neutrofili a 10 minuti, acquisire da cinque a dieci campi visivi casuali.

Le cellule endoteliali non stimolate non supportano il reclutamento dei neutrofili. Pertanto, le figure seguenti mostrano neutrofili che interagiscono con cellule endoteliali stimolate dal TNF alpha. Si noti il neutrofilo aderente indicato dalla freccia gialla e il neutrofilo in transmigrazione indicato dalla freccia bianca.

La traslocazione dei neutrofili può avvenire a livello delle giunzioni cellulari o attraverso le cellule endoteliali stesse. Per differenziare tra queste due condizioni, le cellule endoteliali sono state marcate con un anticorpo anti VE coerente. Come mostrato qui in rosso, la traslocazione viene valutata come paracellulare o transcellulare.

In questo modello, praticamente tutta la trasmissione avviene per via paracellulare, come dimostrato da questa figura che mostra la sovrapposizione delle due figure precedenti. In questo primo dei tre grafici, le interazioni dei neutrofili sono state esaminate e misurate utilizzando il software ImageJ. Si noti che si sono verificate significativamente più interazioni tra neutrofili e cellule endoteliali attivate dal TNF-alfa rispetto al controllo con cellule endoteliali non stimolate.

Le cellule interagenti totali sono state ulteriormente caratterizzate come rotolanti, aderenti saldamente o in transmigrazione, come in precedenza. È stata osservata una transmigrazione significativamente maggiore dei neutrofili nei pozzetti contenenti cellule endoteliali attivate, dopo l'isolamento delle cellule endoteliali. Altri metodi, come il western blotting, la PCR in tempo reale e la misura della resistenza endoteliale, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande relative alla biologia delle cellule endoteliali dopo lo sviluppo.

Questo metodo aiuterà i ricercatori nel campo dell'infiammazione e della biologia vascolare a comprendere come avvenga il reclutamento dei leucociti in condizioni di flusso in un sistema modello umano. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare cellule endoteliali da vena ombelicale umana e utilizzarle per studiare la trasemigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso mediante una camera di flusso.