Un modello umano tube di Falloppio per le Indagini su

Chlamydia trachomatis è un batterio gram-negativo obbligato intracellulare. Esistono diversi sierovari di Chlamydia noti per causare infezioni dell'occhio o del tratto genitale. Le infezioni del tratto genitale da Chlamydia trachomatis rappresentano la malattia sessualmente trasmissibile più frequente a livello mondiale.

Sono presenti con una prevalenza di quasi 3 milioni di infezioni segnalate nell'Unione Europea dal 1990 al 2009. Nel 2009 sono stati riportati quasi 400.000 casi. Sebbene la sanità pubblica e l'educazione sessuale siano in costante miglioramento, si osserva un aumento del tasso di nuove infezioni genitali da clamidia, passando da 70.000 casi nel 1990 a 400.000 casi nel 2009.

Il 75% di tutte le nuove infezioni viene segnalato nei giovani di età compresa tra i 15 e i 24 anni. Si ritiene che le conseguenze cliniche siano dovute a un'eliminazione inefficace dei patogeni, che può portare a infezioni ascendenti dal tratto genitale inferiore a quello superiore, causando successivamente danni infiammatori cronici al tessuto infetto. Dal 10 al 30% delle donne infette da chlamydia tracheitis sviluppa una malattia infiammatoria pelvica (PID), e fino al 50% dei casi di PID è attribuibile a infezioni da chlamydia tracheitis.

Di conseguenza, in il 50% dei pazienti con infertilità tubarica e nel 40% dei pazienti con gravidanza ectopica, Chlamydia trachomatis viene identificata come agente patogeno causale. In una donna sana e non infetta, l'uovo fecondato migra attraverso la tuba di Falloppio fino all'utero, dove si sviluppa fino al parto. Nei pazienti infetti, Chlamydia può risalire dal tratto genitale inferiore fino alla tuba di Falloppio, innescando processi infiammatori cronici.

Si ritiene che il danno alle cellule epiteliali indotto dai patogeni e la perdita delle funzioni centrali delle cellule epiteliali causino infine l'occlusione tubarica, portando a una riduzione o all'abolizione completa del trasporto dell'ovulo dalle ovaie all'utero. A tale scopo, vengono prelevate e conservate tube di Falloppio umane da donne sottoposte a isterectomia. Le tube vengono dissezionate e aperte con attenzione.

In base al set-up sperimentale, vengono tagliati in piccoli campioni e infettati con corpi elementari infettivi di Chlamydia trachomatis per un periodo di 24-48 ore dopo i rispettivi intervalli temporali. I campioni vengono fissati con fissativo di Monty per almeno tre giorni fino alla successiva preparazione. Conservare immediatamente dopo l'intervento i tubi uterini umani (HFT) prelevati da donne sottoposte a isterectomia.

In RPMI contenente 5% di FCS senza antibiotici a quattro gradi Celsius fino alla preparazione. Dissezionare la tuba di Falloppio umana in una piastra di Petri contenente RPMI con 5% di FCS senza antibiotici durante l'intero processo. Il campione deve essere immerso nel mezzo per evitare l'essiccazione; rimuovere e scartare il tessuto connettivo e i tessuti danneggiati durante l'intervento chirurgico.

Dopo la dissezione, aprire con attenzione l'HFT utilizzando un piccolo bisturi. Evitare danni al tessuto causati da un uso imprudente di pinzette e bisturi. Preparare piccoli pezzi di tessuto di dimensioni pari a cinque per cinque millimetri per l'infezione; conservare il campione di HFT in un millilitro di RPMI contenente il 5% di FCS senza antibiotici e aggiungere C track.

Il campione di corpi elementari OMAS HFT viene incubato fino a 48 ore a 37 gradi Celsius, 5%CO2 e 20%O2 all'interno di un normale incubatore oppure in un ambiente a bassa concentrazione di ossigeno, inferiore al 5%O2, in una camera da ipossia. Dopo i rispettivi tempi di incubazione, i campioni vengono raccolti e conservati nel fissativo di Monty per almeno tre giorni a quattro gradi Celsius, in attesa della preparazione per microscopia elettronica a scansione o a trasmissione. Il tessuto fissato viene tagliato in piccoli pezzi, lavato e incubato con 1%osse e tetrossido durante tutta la notte.

Dopo diversi passaggi di lavaggio e asciugatura, i campioni disidratati vengono trasferiti nell'aite appena preparato e polimerizzati per 48 ore a 60 gradi Celsius. Dopo la sagomatura, sezioni semisottili e ultrasottili vengono tagliate e trasferite rispettivamente su vetrini o griglie. Dopo la colorazione, le sezioni semisottili possono essere esaminate al microscopio ottico per la microscopia elettronica a trasmissione.

Rimuovere il campione dal fissativo di Monty e tagliarlo in pezzi di dimensioni massime di due per due per cinque millimetri. Dopo il lavaggio e l'incubazione nel buffer diluente di sodio CCO, lavare con tetroxido di osmio, disidratare e trasferire il campione in una miscela al 50% di ossido di propilene e aite per tutta la notte. Il giorno successivo, trasferire in aite appena preparata per almeno un'ora.

Quindi trasferire negli stampi piani e riempire con aite, lasciando polimerizzare il composto aerato per 48 ore a 60 gradi Celsius. Dopo aver rifinito il campione incluso, tagliare sezioni semisottili di circa 700 nanometri o sezioni ultrasottili di 70 nanometri utilizzando un ultramicrotomo dotato di un coltello di vetro o, preferibilmente, di un coltello al diamante. Le sezioni semisottili e ultrasottili vengono analizzate mediante microscopia ottica ed elettronica a trasmissione. Per la microscopia elettronica a scansione.

I campioni vengono fissati con l'epitelio rivolto verso l'alto su lastre di sughero, lavati e disidratati utilizzando concentrazioni crescenti di acetone. Dopo l'essiccazione in un essiccatore a punto critico, i campioni vengono trasferiti su un supporto per campioni al microscopio elettronico a scansione (SEM) e rivestiti con platino, oro o palladio mediante uno sputter coater. Successivamente, sono pronti per essere analizzati al microscopio elettronico a scansione per la microscopia elettronica a scansione.

Rimuovere il campione dal fissativo di Monty e posizionare il frammento di tessuto con l'epitelio rivolto verso l'alto su un foglio di sughero, fissandolo in posizione con aghi entomologici. Dopo aver lavato con tampone caco diluente, sottoporre il campione a un trattamento con acetone e quindi essiccarlo in un essiccatore a punto critico. Dopo il trasferimento del campione dal sughero al portacampione per microscopia elettronica a scansione (SEM), applicare un rivestimento conduttivo di platino, oro o palladio utilizzando uno sputter coater; trasferire quindi il campione sputterizzato in un microscopio elettronico a scansione per ulteriori analisi.

L'elevata incidenza di infezioni da lumus nelle donne e le enormi conseguenze cliniche delle infezioni al ascendenti costituiscono la motivazione per intensificare la ricerca di base e traslazionale in questo ambito. Abbiamo utilizzato un modello di tessuto ex vivo della tuba uterina umana precedentemente sviluppato dal gruppo di St. Perus, al fine di caratterizzare morfologicamente i danni cellulari indotti da Chlamydia nella tuba uterina. Mediante l'uso di questo metodo, si osserva la formazione di inclusioni intracellulari in diverse fasi di sviluppo, evidenziando sia infezioni replicanti sia persistenti.

Tuttavia, mancano ancora evidenze sperimentali della presenza di clamidia persistente nel tessuto della tuba uterina umana, e sono necessarie ulteriori analisi per la clamidia, la prole e la regolazione positiva della trascrizione dei geni della persistenza. Una delle principali limitazioni di questo modello è l'assenza di cellule infiammatorie, che ostacola l'analisi degli effetti secondari dovuti all'infezione iniziale da KLA di tipo glaucomatoso. Tuttavia, questo modello sembra adatto per analizzare condizioni ambientali come il contenuto di ossigeno nel contesto del danno alle cellule epiteliali della tuba uterina, e per studiare la risposta immunitaria iniziale dell'ospite contro l'infezione acuta di tipo glaucomatoso.

Uno degli obiettivi futuri è quello di stabilire un modello più articolato per i test di MIC delle CTU nel modello di tessuto della tuba uterina umana a pH, e di utilizzare questo modello per definire effettivamente le diverse fasi di sviluppo dei CLI dal punto di vista metabolico, ricorrendo alla tecnica della microscopia a scansione laser a due fotoni.