Name: Un modello umano tube di Falloppio per le Indagini su C. trachomatis Infezioni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Scopri un modello ex vivo delle tube di Falloppio umane per studiare le infezioni da C. trachomatis. Questo metodo permette di analizzare i danni cellulari indotti dal patogeno e le risposte infiammatorie croniche.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla DFG-Cluster of Excellence &quot;Infiammazione al Interfaces&quot; (RA-Se, RA-D). Siamo grati per l&#39;assistenza tecnica di ottima Kristin Wischnat.

1. Preparazione del magazzino Chlamydia trachomatis serovar D <ol><li> Infect confluenti 175 centimetri 2 pallone di coltura cellulare contenente cellule HeLa-229 con 4 ml C. D trachomatis in SPG tampone. </li><li> Incubare per un&#39;ora a 37 ° C durante agitazione costante. </li><li> Aggiungere 20 ml di DMEM con 10% FCS e 240 cicloeximide pl. </li><li> Incubare in un incubatore umidificato per 48 ore a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Aggiungere 5 palline di vetro sterili ml, si stringono forte per staccare e distruggere C. trachomatis ospitare 229 cellule HeLa-. </li><li> Raccogliere il surnatante e aggiungere un altro 5 ml di perline di vetro sterili. </li><li> Roccia tre volte per 1 min a distruggere tutte le cellule HeLa-229 e il rilascio C. trachomatis. </li><li> Centrifugare per 5 min a 1000 RPMI e 4 ° C per eliminare i detriti cellulari. </li><li> Raccogliere il surnatante per l&#39;infezione da 8 a 10 175 cm 2 di coltura cellulare palloni g confluentirown con 229 cellule HeLa. </li><li> Incubare ogni pallone con 4 ml di tampone SPG e 4 ml di surnatante dal precedente infezione per un&#39;ora a 37 ° C con costante agitazione. </li><li> Dopo un&#39;ora aggiungere 15 ml di DMEM con 10% FCS e 230 pl cicloeximide seguita da 48 ore di incubazione a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Aggiungere 5 ml di perline di vetro sterili, agitare per rimuovere e distruggere C. trachomatis ospitare 229 cellule HeLa-. </li><li> Raccogliere il surnatante e aggiungere un altro 5 ml di perline di vetro sterili. </li><li> Roccia tre volte per 1 min a distruggere tutte le cellule HeLa-229 e il rilascio C. trachomatis. </li><li> Centrifugare per 5 min a 1000 RPMI a 4 ° C per sbarazzarsi di detriti cellulari. </li><li> Raccogliere il surnatante. </li><li> Riempire 40 ml di surnatante in provette da 50 ml Falcon, centrifugare per 99 min con 11.000 RPMI. </li><li> Dopo la centrifugazione scartare il surnatante e lavare il pellet con 1 ml SPG buffer. </li><li> Omogeneizzare lapellet in 1 ml e SPG aliquota 20 pl in uno, 1 5 ml tubo Eppendorf, conservare a -70 ° C fino all&#39;uso. Attività biologica dello stock preparato è stato confermato in uno stabilito HeLa-229 modello di infezione delle cellule. </li></ol> 2. Preparazione dei diritti dell&#39;uomo e delle tube di Falloppio <ol><li> Conservare i tubi di Falloppio umani (HFT) da donne sottoposte a isterectomia subito dopo l&#39;intervento chirurgico in RPMI contenente 5% FCS senza antibiotici in 4 ° C fino alla preparazione. Il protocollo è stato approvato dal Comitato Etico dell&#39;Università di Lubecca (09-153). Le donne inclusi nello studio (età 34 fino al 53) non avevano una storia di precedenti C. trachomatis infezione. Tessuti delle tube di Falloppio sono stati raccolti presso la sterilizzazione peripartum su richiesta materna durante il parto cesareo o durante l&#39;isterectomia a causa di fibromi uterini sintomatici nella fase luteale. Tutti HFT sono risultati negativi per C. trachomatis da PCR. </li><li> Sezionare il HFT in una capsula di Petri contenente RPMI con5% FCS senza antibiotici. Durante l&#39;intera lavorazione del tessuto deve essere immersa in media per evitare l&#39;essiccazione. </li><li> Tagliare ed eliminare il tessuto connettivo e tessuto distrutto durante l&#39;intervento. </li><li> Dopo la dissezione aprire il HFT con cura con un piccolo bisturi. </li><li> Per ulteriori esperimenti di preparare pezzi di tessuto nella dimensione di 0,5 cm x 0,5 cm fino a 1 cm x 1 cm. </li><li> Per i campioni HFT negozio di infezione in 1 ml RPMI contenente il 5% FCS senza antibiotici. I campioni sono stati infettati con HFT 5.5x10 5 IFU (unità formanti inclusione) di C. trachomatis. </li><li> Incubare campione HFT in 37 ° C, 5% CO 2 e 21% O 2, così come in 37 ° C, 5% di CO 2 e 2% O 2 per 24 h. </li><li> Dopo il tempo di incubazione prelevare il campione e conservarlo in fissativo Monti per almeno tre giorni a 4 ° C fino al SEM / TEM preparazione. </li></ol> 3. Preparazione del campione HFT per TEM <ol><li> PerTEM rimuovere dal campione fissativo Monti e tagliare 2 x 2 mm a 4 mm x 5 pezzi. Il tessuto rimanente può essere utilizzato per SEM. </li><li> Lavare pezzi con tampone sodio cacodilato, pH 7,35 per 1 h. </li><li> Incubare in 1% (w / v) tetrossido di osmio in aqua dest. durante la notte. </li><li> Rimuovere tetrossido di osmio in eccesso tramite lavaggio 6x5 min in tampone sodio cacodilato, pH 7,35. </li><li> Rimuovere l&#39;acqua incubando in concentrazioni crescenti di etanolo in acqua (v / v) (30% per 2 h, 40% per 2 h, 50% per 2 h, 60% per 2 h, 70% durante la notte, 80% per 2 h, 90% per 1 h, 95% per 1 h, 100% per 1 h. </li><li> Lavare etanolo per 2 x 15 min in ossido di propilene e successivamente trasferire ad una miscela di 50% (v / v) Araldite preparata di fresco (inclusi tutti i componenti) in propilene e incubare durante la notte. </li><li> Trasferimento Araldite preparata (inclusi tutti i componenti) per almeno 1 h. </li><li> Trasferimento a formelle piatto e riempire con Araldite. </li><li> Lasciare indurire per Aralditealmeno 48 ore a 60 ° C </li><li> Dopo il taglio del campione incorporato taglio semi sezioni sottili (700 nm) su un ultramicrotomo utilizzando coltelli di vetro o un coltello isto diamanti e macchia con macchia di Richardson. </li><li> Tagliare ultra-sottili sezioni (circa 70 nm) con un coltello di diamante e il trasferimento alle reti in rame (ad esempio 150 maglie quadrate). </li><li> Stain ultra-sottili sezioni con acetato di uranile 0,5% (w / v) in aqua dest. seguita da 3% (w / v) citrato di piombo in acqua distillata. in sezione di coloratori automatico. In alternativa, le sezioni possono essere colorate manualmente lasciando griglie 15 min in una soluzione satura di acetato di uranile centrifugato in aqua dest. seguita da citrato di piombo 0,3% (w / v) in aqua dest. </li></ol> 4. Preparazione del campione HFT per SEM <ol><li> Per rimuovere SEM campione dal fissativo Monti, orientare con epitelio rivolto verso l&#39;alto su un foglio di 1 x 1.5 centimetri di sughero e stabilire la posizione utilizzando aghi di insetti. </li><li> Trasferimento campione sul sughero cestelli metallici adatti elavare per 30 min in tampone sodio cacodilato, pH 7,35. </li><li> Rimuovere l&#39;acqua incubando campione in crescente concentrazione di acetone / acqua (v / v) 30% per 6 h, 40% per 6 h, 60% per 8 h, 70% durante la notte, 80% per 2 h, 90% per 2% e 100 h per tutta la notte (essere estremamente cauti per mantenere campione continuamente sommerso). </li><li> Trasferimento a fresco acetone 100% e campione secco mediante essiccazione punto critico (temperatura 40 ° C, pressione 80 bar). </li><li> Rimuovere aghi, sughero e di campioni di colla con l&#39;epitelio rivolto verso l&#39;alto sul monte campione SEM dotati di una scheda di carbonio conduttivo con cemento conduttivo di carbonio. Utilizzare liquido argento conduttiva per migliorare la conducibilità tra il monte e la scheda di carbonio conduttivo. </li><li> Preparare un rivestimento conduttivo platino, oro o palladio del campione con una polverizzazione spalmatrice. </li></ol> 5. La colorazione di sezioni sottili con Semi Stain Richardson <ol><li> Lasciate semi sezioni sottili a secco sul vetrino. </li><li> Colorazione con sezioni soluzione colorante a 60 ° C per 1-2 min. </li><li> Lavare in acqua distillata. </li><li> Sezioni a secco e applicare il coprioggetto. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi All&#39;interno del modello umano Falloppio infezione tubo siamo stati in grado di visualizzare differenze nella morfologia epiteliale tra i controlli non infetti (Figura 1) e il C. trachomatis - Tubi infetti (Figura 2), in condizioni normossica. Caratteristici differenze morfologiche implicita patogeni indotta gonfiore e lisi delle cellule epiteliali del tubo di Falloppio che non potevano essere rilevati in non-infetti controlli. Uso semi sezioni sottili e microscopia elettronica a trasmissione siamo stati in grado di dimostrare intracellulare C. inclusione formazione trachomatis in ex vivo infettato tessuto umano Falloppio tubo (Figura 3, 5) ma non in non-infette controlli (Figura 4). Come concentrazione di ossigenozioni del tratto genitale femminile sono già bassi in condizioni fisiologiche 11, e diminuire ulteriormente nel corso di un processo infiammatorio abbiamo indagato anche il nostro modello in condizioni di ipossia. I risultati preliminari indicano il modello è utile per analizzare la crescita Chlamydia e la progenie in varie concentrazioni di ossigeno. Chlamydia danno indotto cellule epiteliali deve essere separato da artefatti che sono mediati attraverso incauto preparazione e la manipolazione delle tube di Falloppio prima dell&#39;infezione (Figura 6). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Microscopio elettronico a scansione (SEM) di un non-umano infetto Falloppio dopo un giorno di incubazione in un mezzo di controllo (freccia verde mostrano delle cellule ciliate, freccia blu mostrano non-cellule ciliate). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Elettronico a scansione micros<html> copia (SEM) di un ex vivo C. trachomatis infezione umana tube di Falloppio uno dopo l&#39;infezione giorno (freccia bianca inclusione segno di rottura). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Semi sezioni sottili mostrano tipiche inclusioni intracellulari (frecce bianche) 1g dopo l&#39;infezione delle tube di Falloppio umana con C. trachomatis ex vivo. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) di un non-umano infetto tube di Falloppio dopo un giorno di incubazione in mezzo di controllo. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) di un ex vivo C. trachomatis infezione umana tube di Falloppio uno dopo l&#39;infezione giorno (frecce bianche segnano inclusioni clamidia). ve_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Microscopio elettronico a scansione (SEM) di epitelio tube di Falloppio danneggiate attraverso la preparazione e la gestione incauta del campione (bianco frecce marchio distrutto tessuto epiteliale).

<ol><li>Dean, D., Suchland, R. J., Stamm, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+long-term+cervical+persistence+of+Chlamydia+trachomatis+by+omp1+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Evidence for long-term cervical persistence of Chlamydia trachomatis by omp1 genotyping.</a> J. Infect. Dis. 182, 909-916 (2000).</li>
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<li>Roth, A., Konig, P., van, Z. G., Klinger, M., Hellwig-Burgel, T., Daubener, W., Bohlmann, M. K., Rupp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+abrogates+antichlamydial+properties+of+IFN-gamma+in+human+fallopian+tube+cells+in+vitro+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hypoxia abrogates antichlamydial properties of IFN-gamma in human fallopian tube cells in vitro and ex vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19502-19507 (2010).</li>
<li>Wyrick, P. B., Knight, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-exposure+of+infected+human+endometrial+epithelial+cells+to+penicillin+in+vitro+renders+Chlamydia+trachomatis+refractory+to+azithromycin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Pre-exposure of infected human endometrial epithelial cells to penicillin in vitro renders Chlamydia trachomatis refractory to azithromycin.</a> J. Antimicrob. Chemother. 54, 79-85 (2004).</li>
<li>Van Voorhis, W. C., Barrett, L. K., Sweeney, Y. T., Kuo, C. C., Patton, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+Chlamydia+trachomatis+infection+of+Macaca+nemestrina+fallopian+tubes+produces+a+Th1-like+cytokine+response+associated+with+fibrosis+and+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Repeated Chlamydia trachomatis infection of Macaca nemestrina fallopian tubes produces a Th1-like cytokine response associated with fibrosis and scarring.</a> Infect. Immun. 65, 2175-2182 (1997).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Visualizzazione dei patogeni indotta da un danno al tessuto infetto è arduo e spesso limitata alle procedure sperimentali nei topi. Abbiamo stabilito un ex modello di infezione in vivo umani tube di Falloppio per analizzare C. trachomatis infezioni del tratto superiore dell&#39;apparato genitale femminile. Con l&#39;uso di questo metodo, siamo stati in grado di visualizzare C. trachomatis - danni per la salute umana indotta epitelio tube di Falloppio entro un giorno dopo l&#39;infezione. Rigonfiamento cellulare e lisi erano tipiche alterazioni morfologiche che sono stati osservati in C. trachomatis - infetti tube di Falloppio, ma non in non-infetti controlli. Le analisi hanno rivelato che TEM clamidie implementare un tipico ciclo di sviluppo intracellulare nei tessuti infetti, che mostra le inclusioni di grandi dimensioni con corpi elementari re-differenziati, ma anche piccole inclusioni con corpi reticolati allargata che potrebbero indicare la persistenza. Tuttavia, il quadro morfologico da sola non è sufficiente per discriminare tra replinfezioni icating e persistente, che sono caratterizzati da un ridotto metabolismo e una maggiore resistenza agli antibiotici 10. Distruzione dell&#39;epitelio in infetti tube di Falloppio o è dovuto alla rottura di C. trachomatis - infettate le cellule epiteliali dopo il completamento del ciclo di sviluppo e il rilascio intracellulare di malattie infettive corpi elementari o il rilascio di citochine pro-infiammatorie 8. Patogeni indotta danni ai tessuti e le reazioni immunitarie host-indotti contro C. trachomatis dovrebbero essere i principali fattori che portano alla perdita della funzione delle cellule epiteliali, fibroblasti e rimodellamento infertilità tubarica, infine in vivo 8,11. Uno dei limiti principali di questo modello è l&#39;assenza di cellule infiammatorie che ostacola l&#39;analisi degli effetti secondari al iniziale C. infezione da trachomatis dell&#39;epitelio tuba di Falloppio. Tuttavia, il modello è appropriate per indagare diverse condizioni ambientali (ad esempio il contenuto di ossigeno) e l&#39;iniziale host-risposta immunitaria acuta in C. infezioni trachomatis 8,9. Ulteriori progetti sono da stabilire un modello per i test degli antimicrobici nei confronti di C. trachomatis in interi tubi di Falloppio umani e di caratterizzare gli stati metaboliche dei diversi stadi di sviluppo osservate nell&#39;epitelio delle tube di 2 fotoni microscopia laser scanning.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> PAA </td><td> E15-843 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> PAA </td><td> R15-802 </td><td></td></tr><tr><td> FCS </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td><td></td></tr><tr><td> Cicloeximide </td><td> Sigma - Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SPG Buffer </td><td> vario </td><td></td><td> vedi ricetta qui sotto </td></tr><tr><td> Fissativo Monti </td><td> vario </td><td></td><td> vedi ricetta qui sotto </td></tr><tr><td> di sodio cacodilato tampone </td><td> vario </td><td></td><td> vedi ricetta qui sotto </td></tr><tr><td> Richardson di macchia </td><td> vario </td><td></td><td> vedi ricetta qui sotto </td></tr></tbody></table> Ricette: 1. SPG Buffer <ol><li> Aggiungere 75 g di saccarosio. </li><li> Aggiungere 2,47 g di fosfato disodico. </li><li> Aggiungere 0,36 g di fosfato monosodico. </li><li> Aggiungere 0,72 g di acido glutammico. </li><li> Riempire a 1 l con acqua distillata. </li><li> Regolare il pH a 7,3. </li></ol> 2. 0,1 M tampone cacodilato di sodio, pH 7,35. <ol><li> Aggiungere 42,80 g di sale di sodio dell&#39;acido dimethylarsenic. </li><li> Aggiungere 68,46 g di saccarosio. </li><li> Riempire a 1 l con acqua distillata. per ottenere di sodio 0,2 M tampone cacodilato. </li><li> Prima di usare la soluzione diluita con acqua distillata. a concentrazione desiderata e regolare il pH a 7,35 se necessario. </li></ol> 3. Fissativo Monti <ol><li> Aggiungere 156 ml di 0,12 M tampone sodio cacodilato. 3,2 Aggiungere 25 ml 25% di glutaraldeide in aqua dest. </li><li> Aggiungere 19 ml10% paraformaldeide in aqua dest. </li><li> Aggiungere 3 ml 3% CaCl 2 in aqua dest. </li><li> Regolare il pH a 7,35 e riempire con acqua distillata. 312 ml di soluzione finale. </li></ol> 4. Richardson macchia <ol><li> Mescolare parti uguali di blu di metilene 1% in 1% di soluzione acquosa di borace e l&#39;1% Azur II in aqua dest. </li></ol>

un modello umano tube di falloppio per le indagini su<em&gt; c. trachomatis</em&gt; infezioni

A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

Infezioni del tratto genitale con Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) sono le più frequenti malattie sessualmente trasmesse nelle donne in tutto il mondo. Gioco inefficiente o persistenza dei patogeni può portare a salire infezioni del tratto superiore dell&#39;apparato genitale e si suppone di provocare danni cronica infiammatoria a 1,2 tessuti infetti. Di conseguenza, gravi sequele cliniche come la malattia infiammatoria pelvica (PID), occlusione tubarica e infertilità può verificarsi 3,4. La maggior parte della ricerca con C. trachomatis è stata condotta in linee cellulari epiteliali (ad esempio HEp-2 e cellule HeLa-229) o nei topi. Tuttavia, come coltura cellulare i modelli base, essi non riflettono la fisiologia del tessuto nativo, né la fisiopatologia della C. trachomatis infezioni del tratto genitale in vivo 5. Ulteriori limitazioni sono dati dal fatto che centrali cascata di segnalazione (per es IFN-γ mediated JAK / STAT pathway di segnalazione) che controllano la crescita intracellulare da Chlamydia sono fondamentalmente diverse tra i topi e gli esseri umani 6,7. Noi e gli altri quindi istituito un intero modello di tuba di Falloppio organo di indagare le interazioni dirette tra C. trachomatis e umano di Falloppio tubo di cellule ex vivo 8,9. Per questo scopo, umani tube da donne sottoposte a isterectomia sono stati raccolti e infettati con C. trachomatis sierotipo D. Entro 24 ore dopo l&#39;infezione, dove campioni analizzati mediante microscopia elettronica a scansione (SEM) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per rilevare Chlamydia trachomatis mediato danno epiteliale e C. trachomatis formazione di inserimento nel tessuto di Falloppio.

Si descrivono un<em&gt; Ex vivo infezione</em&gt; Modello per la visualizzazione delle interazioni dirette da agenti patogeni batterici con cellule umane tuba di Falloppio. L&#39;intero modello di tessuto organo è stato istituito per indagare<em&gt; C. trachomatis</em&gt; Patologia indotta al tubo di Falloppio femminile in &quot;vita-come&quot; condizioni.

Un modello umano tube di Falloppio per le Indagini su<em&gt; C. trachomatis</em&gt; Infezioni

Le infezioni del tratto genitale causate da Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) rappresentano la malattia sessualmente trasmissibile più frequente nelle donne a livello mondiale. L'inefficienza...

Chlamydia trachomatis è un batterio gram-negativo obbligato intracellulare. Esistono diversi sierovari di Chlamydia noti per causare infezioni dell'occhio o del tratto genitale. Le infezioni del tratto genitale da Chlamydia trachomatis rappresentano la malattia sessualmente trasmissibile più frequente a livello mondiale.Sono presenti con una prevalenza di quasi 3 milioni di infezioni segnalate nell'Unione Europea dal 1990 al 2009. Nel 2009 sono stati riportati quasi 400.000 casi. Sebbene la sanità pubblica e l'educazione sessuale siano in costante miglioramento, si osserva un aumento del tasso di nuove infezioni genitali da clamidia, passando da 70.000 casi nel 1990 a 400.000 casi nel 2009.Il 75% di tutte le nuove infezioni viene segnalato nei giovani di età compresa tra i 15 e i 24 anni. Si ritiene che le conseguenze cliniche siano dovute a un'eliminazione inefficace dei patogeni, che può portare a infezioni ascendenti dal tratto genitale inferiore a quello superiore, causando successivamente danni infiammatori cronici al tessuto infetto. Dal 10 al 30% delle donne infette da chlamydia tracheitis sviluppa una malattia infiammatoria pelvica (PID), e fino al 50% dei casi di PID è attribuibile a infezioni da chlamydia tracheitis.Di conseguenza, in il 50% dei pazienti con infertilità tubarica e nel 40% dei pazienti con gravidanza ectopica, Chlamydia trachomatis viene identificata come agente patogeno causale. In una donna sana e non infetta, l'uovo fecondato migra attraverso la tuba di Falloppio fino all'utero, dove si sviluppa fino al parto. Nei pazienti infetti, Chlamydia può risalire dal tratto genitale inferiore fino alla tuba di Falloppio, innescando processi infiammatori cronici.Si ritiene che il danno alle cellule epiteliali indotto dai patogeni e la perdita delle funzioni centrali delle cellule epiteliali causino infine l'occlusione tubarica, portando a una riduzione o all'abolizione completa del trasporto dell'ovulo dalle ovaie all'utero. A tale scopo, vengono prelevate e conservate tube di Falloppio umane da donne sottoposte a isterectomia. Le tube vengono dissezionate e aperte con attenzione.In base al set-up sperimentale, vengono tagliati in piccoli campioni e infettati con corpi elementari infettivi di Chlamydia trachomatis per un periodo di 24-48 ore dopo i rispettivi intervalli temporali. I campioni vengono fissati con fissativo di Monty per almeno tre giorni fino alla successiva preparazione. Conservare immediatamente dopo l'intervento i tubi uterini umani (HFT) prelevati da donne sottoposte a isterectomia.In RPMI contenente 5% di FCS senza antibiotici a quattro gradi Celsius fino alla preparazione. Dissezionare la tuba di Falloppio umana in una piastra di Petri contenente RPMI con 5% di FCS senza antibiotici durante l'intero processo. Il campione deve essere immerso nel mezzo per evitare l'essiccazione; rimuovere e scartare il tessuto connettivo e i tessuti danneggiati durante l'intervento chirurgico.Dopo la dissezione, aprire con attenzione l'HFT utilizzando un piccolo bisturi. Evitare danni al tessuto causati da un uso imprudente di pinzette e bisturi. Preparare piccoli pezzi di tessuto di dimensioni pari a cinque per cinque millimetri per l'infezione; conservare il campione di HFT in un millilitro di RPMI contenente il 5% di FCS senza antibiotici e aggiungere C track.Il campione di corpi elementari OMAS HFT viene incubato fino a 48 ore a 37 gradi Celsius, 5%CO2 e 20%O2 all'interno di un normale incubatore oppure in un ambiente a bassa concentrazione di ossigeno, inferiore al 5%O2, in una camera da ipossia. Dopo i rispettivi tempi di incubazione, i campioni vengono raccolti e conservati nel fissativo di Monty per almeno tre giorni a quattro gradi Celsius, in attesa della preparazione per microscopia elettronica a scansione o a trasmissione. Il tessuto fissato viene tagliato in piccoli pezzi, lavato e incubato con 1%osse e tetrossido durante tutta la notte.Dopo diversi passaggi di lavaggio e asciugatura, i campioni disidratati vengono trasferiti nell'aite appena preparato e polimerizzati per 48 ore a 60 gradi Celsius. Dopo la sagomatura, sezioni semisottili e ultrasottili vengono tagliate e trasferite rispettivamente su vetrini o griglie. Dopo la colorazione, le sezioni semisottili possono essere esaminate al microscopio ottico per la microscopia elettronica a trasmissione.Rimuovere il campione dal fissativo di Monty e tagliarlo in pezzi di dimensioni massime di due per due per cinque millimetri. Dopo il lavaggio e l'incubazione nel buffer diluente di sodio CCO, lavare con tetroxido di osmio, disidratare e trasferire il campione in una miscela al 50% di ossido di propilene e aite per tutta la notte. Il giorno successivo, trasferire in aite appena preparata per almeno un'ora.Quindi trasferire negli stampi piani e riempire con aite, lasciando polimerizzare il composto aerato per 48 ore a 60 gradi Celsius. Dopo aver rifinito il campione incluso, tagliare sezioni semisottili di circa 700 nanometri o sezioni ultrasottili di 70 nanometri utilizzando un ultramicrotomo dotato di un coltello di vetro o, preferibilmente, di un coltello al diamante. Le sezioni semisottili e ultrasottili vengono analizzate mediante microscopia ottica ed elettronica a trasmissione. Per la microscopia elettronica a scansione.I campioni vengono fissati con l'epitelio rivolto verso l'alto su lastre di sughero, lavati e disidratati utilizzando concentrazioni crescenti di acetone. Dopo l'essiccazione in un essiccatore a punto critico, i campioni vengono trasferiti su un supporto per campioni al microscopio elettronico a scansione (SEM) e rivestiti con platino, oro o palladio mediante uno sputter coater. Successivamente, sono pronti per essere analizzati al microscopio elettronico a scansione per la microscopia elettronica a scansione.Rimuovere il campione dal fissativo di Monty e posizionare il frammento di tessuto con l'epitelio rivolto verso l'alto su un foglio di sughero, fissandolo in posizione con aghi entomologici. Dopo aver lavato con tampone caco diluente, sottoporre il campione a un trattamento con acetone e quindi essiccarlo in un essiccatore a punto critico. Dopo il trasferimento del campione dal sughero al portacampione per microscopia elettronica a scansione (SEM), applicare un rivestimento conduttivo di platino, oro o palladio utilizzando uno sputter coater; trasferire quindi il campione sputterizzato in un microscopio elettronico a scansione per ulteriori analisi.L'elevata incidenza di infezioni da lumus nelle donne e le enormi conseguenze cliniche delle infezioni al ascendenti costituiscono la motivazione per intensificare la ricerca di base e traslazionale in questo ambito. Abbiamo utilizzato un modello di tessuto ex vivo della tuba uterina umana precedentemente sviluppato dal gruppo di St. Perus, al fine di caratterizzare morfologicamente i danni cellulari indotti da Chlamydia nella tuba uterina. Mediante l'uso di questo metodo, si osserva la formazione di inclusioni intracellulari in diverse fasi di sviluppo, evidenziando sia infezioni replicanti sia persistenti.Tuttavia, mancano ancora evidenze sperimentali della presenza di clamidia persistente nel tessuto della tuba uterina umana, e sono necessarie ulteriori analisi per la clamidia, la prole e la regolazione positiva della trascrizione dei geni della persistenza. Una delle principali limitazioni di questo modello è l'assenza di cellule infiammatorie, che ostacola l'analisi degli effetti secondari dovuti all'infezione iniziale da KLA di tipo glaucomatoso. Tuttavia, questo modello sembra adatto per analizzare condizioni ambientali come il contenuto di ossigeno nel contesto del danno alle cellule epiteliali della tuba uterina, e per studiare la risposta immunitaria iniziale dell'ospite contro l'infezione acuta di tipo glaucomatoso.Uno degli obiettivi futuri è quello di stabilire un modello più articolato per i test di MIC delle CTU nel modello di tessuto della tuba uterina umana a pH, e di utilizzare questo modello per definire effettivamente le diverse fasi di sviluppo dei CLI dal punto di vista metabolico, ricorrendo alla tecnica della microscopia a scansione laser a due fotoni.

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