Una piattaforma espressione conveniente e generale per la produzione di proteine ​​secrete da cellule umane

In questo video, descriviamo una procedura efficiente in termini di tempo e costi per l'espressione di proteine secrete da cellule Durant HEC 2 9 3 T. Inizialmente, una coltura di cellule HEC 2 9 3 T cofluente al 40% viene preparata in una piastra a sei mondi. Una miscela di trasfezione viene quindi prodotta diluendo il succo genico, quindi analizzando i plasmidi in terreno privo di siero.

La miscela di trasfezione viene depositata sulle cellule, che vengono poi incubate a 37 gradi Celsius per consentire l'espressione proteica. Il rilevamento della proteina nell'agente supan può essere eseguito mediante western blot. Una volta identificato un costrutto adatto, la procedura può essere scalata utilizzando fabbriche di celle a 10 strati.

Le cellule vengono trasfettate utilizzando PEI come trasfezione. I reagenti e le proteine possono essere raccolti dai surnatanti della coltura utilizzando la filtrazione a flusso tangenziale seguita dalla cromatografia di affinità. In definitiva, questa piattaforma consente l'espressione di un'ampia gamma di macromolecole in quantità di milligrammi.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'espressione di cellule di insetti basate sul virus balo, è che un gran numero di costrutti può essere sottoposto a screening e ingrandito per l'espressione con risultati ottenuti nel giro di tre settimane. A dimostrare questa procedura sarà Hello Aiden per Shada Zini e Jonathan Cook. Tre studenti laureati del mio laboratorio: Iniziare seminando 250.000 cellule HEC 2,9,3 T per pozzetto in un volume di un millilitro in una piastra a sei pozzetti, aggiungere un millilitro per pozzetto di DMEM integrato con pentre FBS al 10% e agitare la piastra per disperdere le cellule in modo uniforme.

Quindi incubare le cellule per una notte in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Una volta che le cellule raggiungono una cofluenza di circa il 40%, sostituire il SUP natum con due millilitri di terreno fresco per preparare la miscela di trasfezione. Prima aliquotare 90 microlitri di DMEM libero dal siero in un tubo di orph eend.

Quindi aggiungere tre microlitri di succo genetico, il reagente di trasfezione mescola delicatamente il contenuto della provetta e incubarlo a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, aggiungi 10 microlitri di un brodo da 100 nanogrammi per microlitro del plasmide purificato mini prep, DNA. Da trasfettare.

Mescolare il contenuto del tubo e lasciarlo riposare a temperatura ambiente per 15 minuti. Per eseguire la trasfezione, depositare la miscela sulle cellule HEC 2 9 3 T. Goccia a goccia, gonfiare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente la miscela di trasfezione.

Quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius. 24 ore dopo, aggiungere un millilitro di terreno fresco a ciascun pozzetto e incubare per altre 48 ore. Tre giorni dopo la trasfezione, raccogliere il supinato e rilevare i livelli di espressione della proteina di interesse mediante western blot.

Una volta identificato un costrutto appropriato, la procedura di trasfezione può essere ampliata. Utilizzando 10 fabbriche di celle a strati, riempire una fabbrica di celle con 1,2 litri di DMEM integrato con il 5% di FBS. Quindi aggiungere 200 milioni di cellule HEC 2 9 3 T, distribuendo le cellule in modo uniforme su tutti gli strati.

Quattro fiasche di coltura cellulare quadrata T da 225 centimetri cresciute al 100% di fluenza contengono circa 200 milioni di cellule. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius durante la notte. Preparare la miscela di trasfezione in un matraccio T 75 diluendo 840 microgrammi di DNA in 84 millilitri di sterile una volta. Pbs.

Aggiungere 2,5 millilitri di milligrammo per millilitro, soluzione di ioni polietilene o PEI e incubare la miscela a temperatura ambiente per 15 minuti. La soluzione dovrebbe diventare torbida. Quindi, versare lentamente la miscela di trasfezione nella fabbrica di cellule e distribuirla accuratamente.

Livelli generali. Aggiungere acido valproico alla concentrazione finale di quattro millimolari. Ciò aumenterà le rese di espressione una volta aggiunta la miscela di trasfezione.

Incubare la coltura a 37 gradi Celsius per quattro giorni per consentire l'espressione proteica. Raccogliere il terreno quattro giorni dopo la trasfezione e pulire immediatamente la fabbrica di celle per il riutilizzo, centrifugare il terreno raccolto a 6.000 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius e filtrarlo attraverso un apparecchio filtrante sottovuoto a tazza sterica da 0,22 micron per rimuovere qualsiasi particolato. Quindi utilizzare il sistema di filtrazione a flusso tangenziale centrato mate per concentrare il surnatante a 75 millilitri.

Una volta che il surnatante è concentrato, la proteina di interesse può essere purificata mediante cromatografia di affinità. In questo esperimento, abbiamo purificato le subunità HA tached del dominio extracellulare dei due recettori AAL umani utilizzando il sistema su larga scala qui descritto, seguito da cromatografia anti THA ad alta affinità. Come mostrato in questa analisi della pagina SDS colorata kumasi.

I domini extracellulari dell'interleuchina, due subunità del recettore alfa e gamma, migrano ai pesi molecolari di 40 kilodalton e 46 kilodalton. L'eterogeneità dei glicani EnLink presenti su IL due R alfa e IL due R gamma ha causato l'allargamento della banda sul gel della pagina SDS. La banda di peso molecolare più alta rappresenta la BSA contaminante.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esprimere proteine da colture cellulari umane utilizzando fabbriche di cellule a 10 strati. Non dimenticare che le cellule T HC 2 93 sono considerate a rischio biologico e devono essere maneggiate al livello di biosicurezza due. Si prega di indossare sempre indumenti protettivi individuali adeguati e le superfici devono essere disinfettate secondo le linee guida istituzionali e governative.