Estrazione RNA da cellule Neuroprecursor Utilizzando il Bio-Rad RNA totale Kit

Ciao, sono Josh Sh, studente laureato del laboratorio del dottor Ed Maki presso l'Università della California di Irvine. Vi mostrerò come estrarre l'RNA da cellule precursori neuronali utilizzando il kit BioRad To RNA Mini. Utilizzo questo kit da diversi anni ormai in questo laboratorio e mi ha sempre fornito risultati costanti con rese elevate.

Le cellule che utilizziamo sono cellule precursori neuro-encefaliche Eton e mezzo, acutamente dissociate da cortecce embrionali, e le seminiamo di solito in una piastra da coltura tissutale a 24 pozzetti, trattata e rivestita con PD L e laminina; le semino a una densità di centomila cellule per pozzetto. Prima di iniziare, devo ricordarvi che dovete lavorare su un banco appositamente dedicato al lavoro sull'RNA. La prima cosa da fare è assicurarsi che il banco per l'RNA sia pulito.

Il modo corretto per pulire il bancone è utilizzare questo RNA zap. Fondamentalmente, elimina qualsiasi RNA poiché l'RA distrugge i tuoi RNA. Un'altra cosa importante è indossare sempre i guanti quando si esegue l'estrazione, perché la pelle è ricca di questi RNA.

Quindi è assolutamente da evitare. Ok, quello che ho qui è il kit mini per RNA totale BioRad. Ne ho estratto il contenuto, quindi lasciatemi mostrarvi di cosa si tratta.

La prima cosa è che abbiamo un PBS trattato con X dep C e un etanolo trattato con DEP al 70%. Abbiamo una soluzione per l'estrazione di RNA totale a cui è stato aggiunto etanolo Dan me in maiuscolo. La seconda è una soluzione di lavaggio a bassa stringenza a cui è stato aggiunto etanolo al 100%, il lavaggio ad alta stringenza, la soluzione di diluizione del DNA, il DNA stesso e l'eluizione di RNA totale.

Soluzione che verrà posta nel blocco riscaldante a 70 gradi. Gli altri materiali necessari sono provette con tappo da 1,5 ml. Queste non devono contenere DNA o inibitori, quindi assicurarsi di utilizzare provette prive di tali sostanze.

E abbiamo due provette da 2 ml senza tappo. E la cosa più importante di tutte sono le colonnine per RNA. Senza di esse, non è possibile eseguire le estrazioni di RNA.

Per assemblare queste colonne, è necessaria la colonna per RNA e i due tappi senza filettatura da due millilitri; basta unirli in questo modo e si sarà pronti per procedere. Ok, e l'ultima cosa di cui abbiamo sempre bisogno sono queste cellule. Le cellule utilizzate qui sono cellule neurali precore Eton e mezzo.

Sono stati acutamente dissociati da cortecce embrionali. Sono stati coltivati per alcuni giorni in mezzo Temple. Ho prelevato le cellule dall'incubatrice a 37 gradi.

Questo protocollo è specifico per cellule aderenti. Queste cellule sono state coltivate su piastre da coltura tessutale trattate con 0,4 pozzetti, rivestite con PDL e laminina. Ora prenderò un tubo da vuoto e chiederò di aspirare il mezzo di coltura.

E il passaggio successivo consiste nell'aggiungere circa 500 microlitri di SEA PBS dep. E ancora una volta, dobbiamo utilizzare punte filtranti. Il PBS, infatti, ha la funzione di rimuovere il mezzo di coltura.

Quindi non si desidera che alcun componente del mezzo entri nella colonna per RNA o interferisca con l'estrazione dell'RNA, altrimenti non si otterranno rese elevate. Bene? Aspirerò rapidamente il PBS perché le cellule staminali neurali non tollerano il PBS. Ora aggiungerò 350 microlitri di buffer di lisi a ciascun campione.

Bene, ancora, assicurati di avere etanolo al 70% nel buffer di lisi. Ora pipetterò su e giù il buffer di lisi 15 volte per assicurarmi che le cellule siano lisate, in modo da poter recuperare il contenuto di RNA.

Ora aggiungerò etanolo al 70% in ogni pozzetto; dopo aver aggiunto 350 microlitri di questo etanolo al 70%, aspirerò e rilascerò il liquido in ciascun pozzetto 10 volte. Ho aspirato e rilasciato 10 volte in ciascun pozzetto. Ora imposterò la mia pipetta su oltre 700 microlitri, poiché il volume totale di ogni pozzetto è di 700 microlitri.

Successivamente, dopo aver prelevato il materiale superiore a 700 microlitri, lo distribuirò in una colonna per RNA. Dopo aver aggiunto il contenuto nella colonna, passerò alla centrifuga ed eseguirò una centrifugazione per 30 secondi a velocità massima. Dopo la prima centrifugazione del lisato della durata di 32 secondi, scarterò il filtrato versandolo in un contenitore vuoto.

O cosa fanno altre persone è prendere un tubo di scarico e aspirare il filtrato. Successivamente, aggiungerai 700 microlitri del tampone di lavaggio a bassa stringenza. E ancora una volta, assicurati di aggiungere l'etanolo al suo interno.

Ora lo centrifugerò per 30 secondi a velocità massima. Dopo aver centrifugato il tampone di lavaggio a bassa stringenza, scarterò il filtrato. Ok? Poi preparerò la D, la soluzione di DNA.

Quindi, per ogni campione aggiungerete cinque microlitri di DNA. Nel nostro caso, in realtà aliquotiamo il DNA prima di iniziare questa procedura, poiché si tratta nuovamente di un enzima.

È preferibile conservarli sotto forma di aliquote. Se li conservate interi, i cicli di congelamento e scongelamento distruggeranno l'attività enzimatica. Quindi, dopo aver aggiunto i cinque microlitri di DNA, li diluirò con 75 microlitri di soluzione diluente per il DNA.

Dopo aver aggiunto ciò, il volume totale sarà di 80 microlitri di soluzione di DNA. Ora aggiungerò 80 microlitri di soluzione di DNA in ogni campione. Assicurarsi che il liquido venga depositato direttamente sulla membrana della colonna.

Quindi si desidera che la soluzione di DNA impregni la membrana. In questo modo si eliminerà il DNA. Di conseguenza, si aumenterà il rendimento di RNA.

Dopo aver aggiunto i DNA, lascerai la colonna a temperatura ambiente per 15 minuti, in modo che l'enzima possa svolgere il suo lavoro. E ancora una volta, incuberai per 15 minuti. Bene, il timer è spento.

Dopo l'incubazione di 15 minuti, procederò alla centrifugazione per 30 secondi a velocità massima al fine di raccogliere i DNA. Ok, dopo aver centrifugato per 30 secondi per rimuovere i DNA, eliminerò il filtrato. Ora aggiungerò 700 microlitri di un buffer ad elevata stringenza per eliminare eventuali residui di DNA.

E poi, dopo aver aggiunto questo, centrifugerò nuovamente per altri 30 secondi. Al termine della centrifugazione, eliminerò il filtrato ad alta stringenza, scartandolo semplicemente versandolo in un contenitore. Quindi aggiungeremo 700 microlitri di tampone a bassa stringenza.

Questa volta, lo centrifugerò per un minuto a velocità massima al Centri Beach. Dopo il primo lavaggio a bassa stringenza della durata di un minuto, scarterò il filtrato. E questa volta non aggiungerò nulla, ma centrifugerò nuovamente per altri due minuti al fine di eliminare il residuo di bassa stringenza, poiché la soluzione a bassa stringenza contiene etanolo, il quale ridurrebbe il rendimento di RNA.

Ora prelevo il buffer di eluizione dal blocco riscaldante a 70 gradi. Per ricordarvi, assicuratevi, prima di iniziare l'esperimento, che il buffer di eluizione sia a 70 gradi e che venga mantenuto caldo per aumentare l'efficienza del rendimento di RNA. Quindi ho già pronte le colonne.

Sono stati prelevati dalla centrifuga. Quindi, nei prossimi passaggi, vengono rimossi le colonne. Ok, eliminerò i tubi del cappuccio e li trasferirò in questi tubi cat.

Aggiungerai 50 microlitri del buffer Lucian in ogni colonna. Assicurati che il buffer di eluizione raggiunga la membrana in modo che venga assorbito completamente. In caso contrario, non otterrai un buon rendimento di RNA.

Ora lasciate riposare la colonna per uno o due minuti per assicurarvi che l'eluente impregni completamente la membrana della colonna. Bene, è passato un minuto. Ora posso portarla alla centrifuga.

Ora metterò le colonne nella centrifuga. Le centrifugerò per un minuto a velocità massima. Questo è l'ultimo passaggio di centrifugazione, durante il quale raccoglierete l'eluato o l'RNA in queste provette con tappo.

Ora, dopo l'ultima centrifugazione, prelevare il contenuto, rimuovere la colonna, scartarla, chiudere il tubo e conservarlo a -80 °C; successivamente è possibile utilizzarlo come desiderato. Ho appena estratto l'RNA utilizzando il kit RNA di BioRad. Ora procederò a misurare la concentrazione dell'RNA estratto, oppure posso leggere l'OD mediante uno spettrofotometro.

Quindi, questo è quello che vi mostrerò. Per prima cosa, dobbiamo preparare una miscela di diluizione. Sarà una diluizione uno a cinque.

Mescoleremo il nostro RNA con acqua purificata MQ. Per prima cosa, preparerò un bianco. Prenderò due microlitri della soluzione di eluizione che abbiamo utilizzato inizialmente per eluire il nostro RNA e aggiungerò otto microlitri di acqua molecolare. Va bene?

Questo è quindi il nostro bianco. Ora preparerò il campione, che conterrà due microlitri di RNA di interesse.

Aggiungeremo nuovamente otto microlitri di acqua MQ. In questo modo si otterrà un diluizione uno a cinque, giusto? Ho questo vialino di vetro in cui inserirò i miei campioni e caricherò il vialino nello spettrometro.

Quindi andiamo a effettuare la misurazione. Prima di misurare l'OD dei campioni di RNA, dovrò pulire il mio vete. Di nuovo, ecco il vete di vetro.

Non si deve mai toccare la parte anteriore. Altrimenti lascereste impronte e otterrei misurazioni errate. Quindi, quello che farò per prima cosa è lavare la chiave di vetro con acqua doppia distillata deionizzata.

Poi prenderò un tubo da vuoto. Aspirerò l'acqua. Dopo questo lavaggio, lo laverò con etanolo al 95%, quindi userò nuovamente un tubo da vuoto per rimuovere l'etanolo.

Ora sono pronto per caricare il mio campione bianco. Abbiamo bisogno prima del bianco per normalizzare le nostre letture. Preleverò quindi 10 microlitri della miscela che abbiamo appena preparato.

Mescolerò quindi la nostra soluzione su e giù per ottenere una buona miscela. La porterò poi al velocimetro spettrale. Questa è la macchina con sonda Ultra Spec 3000, e misureremo la concentrazione di RNA.

Quindi aprire la macchina e inserire il campione in uno di questi supporti. Modificheremo i programmi in modo da leggere solo l'RNA. Ok, ancora una volta, abbiamo effettuato una diluizione uno a cinque.

Quindi vogliamo impostare il nostro fattore di diluizione a cinque. Ok, sono pronto per iniziare. Premo "esegui" per riferire il bianco.

Bene, ora è stato azzerato. Quindi siamo pronti per misurare il nostro campione. Ora rimuoverò il supporto in vetro.

Preleverò il contenuto del bianco. Nuovamente, lo laverò con acqua DIS doppia. Lo laverò con etanolo al 95%.

Ora sono pronto a caricare 10 microlitri del nostro campione di interesse. Quindi, ancora una volta, assicurarsi di mescolare bene il campione. Caricarlo quindi nel vetrino di vetro.

Ora siamo pronti per la lettura. Dopo aver misurato l'OD, un buon valore di resa dovrebbe presentare un rapporto di assorbanza dell'RNA a 260 su 280 di circa 2. E la resa è di circa 144 microgrammi per millilitro.

Anche se la macchina indica 72 microgrammi per millilitro, dobbiamo moltiplicare questo valore per due a causa della lunghezza dimezzata nei nostri campioni, due centimetri. Vi abbiamo mostrato come estrarre l'RNA da cellule precursori neuronali. Ancora una volta, stiamo utilizzando il kit Total Mini RNA di BioRad. Abbiamo provato altri kit e questo è il migliore che utilizziamo in base alla sua efficienza.

Questo fornisce RNA di alta qualità. Se utilizzi questo kit, otterrai risultati di alta qualità come quelli che otteniamo sempre.