Registrazione ottica di attività neurale suprathreshold con risoluzione singola cellula e single-picco

L'obiettivo generale dell'esperimento FollowMe è quello di registrare l'attività di picco neurale da un gran numero di neuroni. Ciò si ottiene osservando l'aumento della concentrazione intracellulare di calcio in un soma neuronale associato a ciascun potenziale d'azione utilizzando la microscopia a fluorescenza nella prima fase. L'eccitazione a due fotoni e un principio di scansione ad accesso casuale vengono utilizzati per registrare segnali fluorescenti di calcio da 40 neuroni somato con un'elevata risoluzione spaziale e temporale.

Nella seconda fase, i tempi precisi dei picchi vengono estratti dai segnali fluorescenti utilizzando un algoritmo di deconvoluzione. Questa tecnica può essere utilizzata per registrare l'attività di picco di decine di neuroni. I dati di spiking possono quindi essere utilizzati per misurare l'informazione reciproca, la propagazione del segnale tra le popolazioni neuronali o le correlazioni neuronali.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come le registrazioni di micro elettrodi, è che è possibile registrare l'attività di picco dei neuroni da un gran numero di neuroni di una popolazione locale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla funzione corticale a livello di reti locali di neuroni, come l'importanza della ricerca di correlazioni di informazioni e i cambiamenti nella dinamica delle reti con plasticità cortico Per l'eccitazione a due fotoni, viene utilizzato un sistema laser a impulsi infrarossi con impulsi a femtosecondi. È necessaria un'elevata potenza di uscita del laser per compensare le grandi perdite introdotte dai componenti ottici del sistema.

Un predicatore per sistema costituito da due prismi impartisce una dispersione di velocità di gruppo negativa sugli impulsi laser prima dei deflettori ottici per compensare la dispersione temporale introdotta dagli AOD: due AOD, con grandi aperture, deviano il raggio laser in due dimensioni. Una classificazione di diffrazione riflettente con 100 scanalature per millimetro è posizionata 13 centimetri dietro gli AOD per compensare la dispersione spaziale introdotta dagli AOD. Quando si utilizzano impulsi laser brevi, il raggio laser viene diretto con due telescopi relè nella porta della fotocamera di un microscopio verticale.

Le iridi sono posizionate a intervalli regolari per l'allineamento dei componenti ottici. Un divisore di fascio dicroico davanti all'obiettivo trasmette la luce di eccitazione infrarossa al campione e riflette la luce di fluorescenza del campione su un rivelatore. I rivelatori a fluorescenza epi e trans raccolgono il segnale di fluorescenza attraverso l'obiettivo e i filtri in vetro colorato del condensatore sono posizionati davanti ai rivelatori per evitare che la luce di eccitazione raggiunga i rivelatori.

Gli angoli di deflessione A OD sono controllati da un computer dotato di una scheda convertitore analogico digitale, che a sua volta aziona oscillatori controllati in tensione. Il segnale proveniente dai fotomoltiplicatori viene trasmesso attraverso un filtro passa-basso di Butterworth con una frequenza di taglio di 100 kilohertz e viene digitalizzato da un convertitore analogico digitale a una frequenza di clock di 156,25 kilohertz prima di essere memorizzato su un computer per l'analisi, l'allineamento e il rumore elettrico viene testato registrando la distribuzione dei segnali fluorescenti con e senza luce laser a basso e alto guadagno dei fotomoltiplicatori, Oltre che con e senza indicatore, la scansione ad accesso casuale con e senza indicatore si basa sul rilevamento di aumenti intracellulari del calcio. Il primo passo del protocollo consiste nel colorare un gran numero di neuroni con la forma Esther di un indicatore di calcio mediante iniezione in bolo.

Successivamente, registra l'attività del soma in ogni neurone in quattro posizioni per 6,4 microsecondi in ciascuna posizione. Per selezionare i neuroni di interesse, acquisire un full frame composto da 256 x 256 pixel. Quindi selezionare manualmente i centri dei neuroni da registrare all'interno di questa immagine.

Tre punti a due micron di distanza attorno a ciascun centro vengono aggiunti automaticamente dal software di controllo in ogni ciclo. Il segnale fluorescente viene registrato dalle quattro posizioni in tutti i 40 neuroni. La registrazione da tutti i neuroni in un ciclo richiede 1,536 millisecondi.

Ripeti questa registrazione sequenziale di tutti i 40 neuroni per cinque secondi. Il rilevamento dei picchi da segnali fluorescenti di calcio somatico si basa su un elevato rapporto segnale/rumore. Un elevato rapporto segnale/rumore può essere ottenuto aumentando l'intensità di eccitazione.

Tuttavia, l'intensità di eccitazione può essere aumentata solo fino a un certo limite a causa del danno alla foto. Esiste solo una finestra molto piccola di intensità di eccitazione in cui il danno fotografico è basso e il rapporto segnale/rumore è sufficiente per rilevare singoli picchi al fine di garantire che i segnali registrati rientrino nella finestra di rilevamento di picchi elevati. Durante un esperimento, vengono utilizzati una serie di software di analisi online sviluppati dal nostro laboratorio.

Successivamente, calcola il tasso approssimativo di fotoni per neurone da una breve finestra temporale di rumore di base di circa 100-200 millisecondi. Il numero di fotoni e il tasso di fotoni vengono calcolati dai valori di fluorescenza adattando la distribuzione delle variazioni di fluorescenza relative con questa equazione, quindi calcolando la fluorescenza di base dalla stessa finestra temporale e tracciandola in funzione del tempo o delle prove. Mantieni il declino medio della linea di base al di sotto di 0,0002 al secondo regolando la potenza del laser.

Perché il rilevamento dei picchi diminuisce rapidamente quando si supera questo limite. Successivamente, verificare le posizioni somatiche dei neuroni ogni 10-20 minuti acquisendo un'immagine a pieno formato. Se necessario, regolare le posizioni di registrazione.

I segnali fluorescenti risultanti dall'attività neurale spesso mangiano in tempo a causa del lungo decadimento del transitorio del calcio. In questa procedura, viene utilizzato un metodo di deconvoluzione per i picchi e i tempi dei picchi dai segnali fluorescenti. Qui utilizziamo un algoritmo genetico per determinare il modello di treno spike più probabile che si adatta al segnale fluorescente registrato.

Ad ogni iterazione dell'algoritmo, la massima verosimiglianza si avvicina asintoticamente al suo massimo che è dato dal rumore delle registrazioni di fluorescenza. Nelle popolazioni omogenee di neuroni, il segnale del calcio evocato dalla spike può variare tra i neuroni. Per l'analisi non supervisionata di grandi set di dati, abbiamo progettato un algoritmo che tiene conto della variazione del segnale di calcio evocato dalla spike da neurone a neurone per evitare un gran numero di rilevamenti di falsi positivi.

La distribuzione congiunta dell'ampiezza e la costante di tempo di decadimento del transiente di calcio evocato da un singolo picco sono registrate in una serie separata di esperimenti dallo stesso tipo di neuroni nelle stesse condizioni sperimentali. Per tenere conto dei lenti cambiamenti di base e per ridurre i costi computazionali della deconvoluzione, le registrazioni più lunghe sono divise in diverse tracce più brevi da uno a cinque secondi per ogni neurone in ogni registrazione, l'algoritmo di deconvoluzione può testare un gran numero di modelli fino a 1 milione di modelli diversi o più per accelerare la deconvoluzione Un esperimento è deconvoluto su un massimo di 10 computer diversi. In parallelo.

Dopo la deconvoluzione, i dati dei picchi vengono analizzati e ispezionati. Il tempo di peristimolo, l'istogramma, la probabilità di picco e la frequenza di attivazione dei neuroni sono calcolati in modo automatico. Ecco gli esempi di un segnale fluorescente registrato a una velocità di eccitazione molto bassa e l'altro a una frequenza di eccitazione molto alta all'interno della finestra di rilevamento.

Si noti che ogni esempio mostra la risposta a un picco. Qui è mostrata una micrografia fotografica di una fetta acuta del cervello e due pipette di stimolazione posizionate nella stessa colonna corticale. Nel quarto strato, questi mostrano le risposte neurali per gli stimoli ripetitivi e questo grafico mostra le informazioni reciproche di Shannon segnalate dalla popolazione registrata di neuroni.

Ecco la misura della propagazione dell'attività di super threshold spiking tra diverse popolazioni di neuroni corticali. Questi sono i picchi rilevati nei neuroni corticali, risposta alla stimolazione elettrica delle fibre corticali thal. Quando si registra l'attività neuronale utilizzando la scansione ad accesso casuale, è molto importante registrare all'interno della finestra di rilevamento.

Altrimenti, è molto facile ritrovarsi con set di dati inutilizzabili. Il rilevamento ottico dei picchi è ancora agli inizi. C'è molto margine di miglioramento.

Con alcuni miglioramenti, registriamo da un numero ancora maggiore di neuroni. Con altri miglioramenti, saremo anche in grado di registrare negli animali svegli e in comportamento.