Neuroimaging funzionale con l'impiego dell'ecografia emato-encefalica e la barriera di Turbativa del Manganese-enhanced MRI

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di ottenere immagini dell'attività neuronale del topo mediante risonanza magnetica potenziata dal manganese. Questo viene effettuato stimolando unilateralmente la vibrazione e mappando la risposta neuronale nella corteccia del campo barile controlaterale. Il primo passo consiste nell'assemblare e calibrare il sistema ad ultrasuoni, composto da un trasduttore ad ultrasuoni non focalizzato azionato da un generatore di segnale e da un amplificatore per l'esperimento.

Dopo un'iniezione intraperitoneale di manganese, la barriera ematoencefalica viene aperta mediante ultrasuoni e microbolle, consentendo al manganese di entrare nel parenchima cerebrale. Successivamente, il topo viene sottoposto a un paradigma di stimolazione neuronale, che determina un maggiore accumulo di manganese nelle regioni cerebrali più attive. Infine, vengono ottenute immagini mediante risonanza magnetica che mostrano differenze regionali nell'intensità dell'immagine RM pesata in T1, in base ai diversi livelli di accumulo di manganese nel cervello.

In neuroscienze, il topo è il sistema modello predominante per lo studio delle basi genetiche e molecolari dello sviluppo cerebrale e delle malattie neurologiche. Questa tecnica fornisce uno strumento non invasivo per la mappatura dell'attività neurale in questi modelli murini. La disrupzione ultrasonica della barriera ematoencefalica può essere utilizzata non solo per veicolare manganese nel parenchima cerebrale ai fini dell'imaging neurofunzionale, ma anche per somministrare una vasta gamma di altri composti nel parenchima cerebrale, inclusi agenti di contrasto a base di gadolinio o chemioterapici.

Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà nell'effettuare la calibrazione del sistema ecografico e nel maneggiare i microbolle. La procedura sarà dimostrata da ciascuno dei tecnici presenti nel nostro laboratorio. Il sistema ecografico è costituito da un trasduttore ecografico a elemento singolo con un diametro sufficientemente ampio da coprire il cervello del topo e una frequenza centrale nell'intervallo di due megahertz.

Il trasduttore è azionato da un generatore di segnale e da un amplificatore di potenza da 50 decibel, che produce la sequenza di impulsi ultrasonici. Calibrare il sistema ultrasonico in un serbatoio pieno d'acqua. Posizionare l'idrofono sul fondo del serbatoio e disporre il trasduttore sopra di esso mediante una piattaforma di traslazione a tre assi.

Applicare quindi una breve serie di impulsi sinusoidali al trasduttore e regolare lo stadio per individuare la risposta massima, che dovrebbe trovarsi al centro del fascio ultrasuonico e nel fuoco naturale del trasduttore. Successivamente, effettuare diverse misurazioni della pressione acustica in un intervallo di tensioni di ingresso e utilizzare una regressione lineare per stimare la relazione tra tensione di ingresso e pressione acustica. Determinare l'ampiezza dell'impulso necessaria per generare una pressione acustica negativa massima di circa 0,36 megapascal.

In questo passaggio, anestetizzare l'animale somministrando l'isoflurano attraverso il cono nasale. L'apparato del cono nasale deve fissare la testa dell'animale in modo preciso e affidabile nella stessa posizione ogni volta; il nostro dispositivo mantiene la testa nel cranio in posizione piatta durante l'esperimento. Un cuscino pneumatico serve per monitorare la frequenza respiratoria e titolare l'anestetico in modo da mantenere una frequenza respiratoria compresa tra 85 e 125 atti respiratori al minuto. Allo stesso tempo, monitorare la temperatura dell'animale mediante una sonda rettale e mantenere la temperatura corporea utilizzando una lampada riscaldante o aria soffiata.

In seguito, inserire un catetere nella vena della coda e un catetere intraperitoneale nell'animale. Il passaggio successivo consiste nel tagliare i peli per dimostrare la stimolazione unilaterale del VII paio e mappare la risposta neuronale nella corteccia del campo barile controlaterale. Recidere il VII paio controlaterale il più vicino possibile alla superficie cutanea senza irritare il follicolo o la pelle circostante.

Quindi trasferire l'animale sul sistema di ultrasuoni e applicare il gel ecografico al cuoio capelluto, posizionando il sottile foglio di plastica inferiore contenente una colonna d'acqua sulla testa. Attraversare la colonna d'acqua con un bastoncino di ovatta per eliminare eventuali bolle d'aria intrappolate nel gel ecografico. Successivamente, posizionare la sonda ecografica nell'acqua alla sua distanza focale naturale direttamente sopra il cervello del topo e passare il dito sulla sonda per rimuovere eventuali bolle d'aria rimaste intrappolate.

In seguito, produrre le microsfere lipidiche di Perrin agitando il flacone nell'agitatore per 45 secondi durante il lavoro. Lasciare il flacone a temperatura ambiente, ma conservarlo in frigorifero dopo l'ultimo utilizzo della giornata e prima del primo utilizzo successivo. Nei giorni successivi, agitare nuovamente il flacone conservato nell'agitatore.

Successivamente, iniettare 0,5 millimoli per chilogrammo di cloruro di manganese per via intraperitoneale e attendere 10 minuti per consentirne la distribuzione. Poi agitare manualmente il flacone di microbolle per un minuto al fine di risospendere le microsfere. Successivamente prelevare 30 microlitri più il volume morto del catetere.

Attenzione a non iniettare aria nel flaconcino poiché ciò degraderebbe le microbolle residue. Avviare immediatamente la sequenza di impulsi ecografici e iniettare le microsfere attraverso il catetere nella vena della coda con il minimo ritardo possibile. Continuare la sonificazione per tre minuti.

Quindi spegnere il sistema ad ultrasuoni. Dopo che il livello di manganese nel cervello si è stabilizzato per circa 40 minuti, spegnere l'isoflurano e rimuovere il cono nasale. A questo punto, iniziare il paradigma di stimolazione neuronale per mappare la corteccia del campo dei barili.

Muovere un pennello con un movimento circolare a una frequenza compresa tra uno e cinque hertz attraverso la matrice vibrazionale controlaterale per 90 minuti. Riprendere l’anestesia dopo la stimolazione, quindi continuare a mantenere la temperatura corporea e titolare il livello di isoflurano a una frequenza respiratoria compresa tra 85 e 125 atti respiratori al minuto. Successivamente, posizionare il topo in una bobina per MRI e trasferirla al sistema di risonanza magnetica.

Quindi acquisire le immagini pesate in DT con elevata risoluzione tridimensionale come mostrato qui. La rottura della barriera emato-encefalica dopo la somministrazione di un agente di contrasto che abbrevia il tempo T1, come il manganese o un agente a base di gadolinio, determina un aumento del segnale nel parenchima cerebrale nelle immagini pesate in T1, rispetto ai cervelli in cui non è stato eseguito BOMA. Nella prima colonna sono riportate le mappe dell'attività neuronale generate mediante stimolazione unilaterale del risi in sette animali.

Le mappe di differenza in due posizioni diverse mostrano un segnale MRI aumentato controlaterale rispetto alla stimolazione mediante brissy. Nella seconda colonna, le mappe dei valori p indicano la significatività relativa di queste differenze. Nella terza colonna, i corrispondenti diagrammi dell'atlante cerebrale mostrano che queste regioni attive corrispondono al campo dei baffi della corteccia sensoriale primaria.

Con la pratica, questa tecnica può essere eseguita in circa due ore, più la durata della simulazione. Durante l'esecuzione della procedura, è importante ricordarsi di agitare il flaconcino di microbolle prima dell'iniezione e fare attenzione a non iniettare aria nel flaconcino. Inoltre, è fondamentale assicurarsi che non rimangano bolle d'aria intrappolate nel gel ecografico o sotto la sonda ecografica.

Per questa dimostrazione, abbiamo scelto di stimolare i vibrisse, ma è evidente che questa tecnica può essere adattata per studiare qualsiasi stimolo di interesse. Al termine della procedura, l'animale può riprendersi completamente, consentendo studi longitudinali.