Name: Time-lapse imaging delle Migrazioni neuroblasti in fette acuta del prosencefalo topo adulto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Scopri l'imaging time-lapse della migrazione dei neuroblasti nel prosencefalo adulto del topo. Questo metodo utilizza microscopia a fluorescenza wide-field per analizzare le dinamiche migratorie in fette acute.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un Istituti canadesi di ricerca sulla salute (CIHR) concede ASJK è stato in parte sostenuto da una borsa di studio Université Laval. AS è il destinatario di un Canada Research Chair in neurogenesi postnatale.

<ol><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu. Rev. Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li>
<li>Kaneko, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+neurons+clear+the+path+of+astrocytic+processes+for+their+rapid+migration+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain.</a> Neuron. 67, 213-223 (2010).</li>
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<li>Snapyan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li>
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<li>Lledo, P. M., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+new+neurons+into+the+adult+olfactory+bulb%3A+joining+the+network%2C+life-death+decisions%2C+and+the+effects+of+sensory+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Integrating new neurons into the adult olfactory bulb: joining the network, life-death decisions, and the effects of sensory experience.</a> Trends Neurosci. 28, 248-254 (2005).</li>
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<li>Murase, S., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleted+in+colorectal+carcinoma+and+differentially+expressed+integrins+mediate+the+directional+migration+of+neural+precursors+in+the+rostral+migratory+stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Deleted in colorectal carcinoma and differentially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in the rostral migratory stream.</a> J. Neurosci. 22, 3568-3579 (2002).</li>
<li>Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+orientation+distinguishes+stem+cell+and+terminal+modes+of+neuron+production+in+the+early+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord.</a> Development. 134, 1943-1954 (2007).</li>
<li>Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+in+inferior+colliculus+of+the+GAD67-GFP+knock-in+mouse%3A+electrophysiological+and+morphological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties.</a> Neurosci. Res. 51, 475-492 (2005).</li>
<li>Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+Control+the+Development+of+the+Migration-Promoting+Vasculature+Scaffold+in+the+Postnatal+Brain+via+VEGF+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling.</a> J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).</li>
<li>Bovetti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+form+a+scaffold+for+neuroblast+migration+in+the+adult+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Blood vessels form a scaffold for neuroblast migration in the adult olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 27, 5976-5980 (2007).</li>
<li>Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonic+activation+of+GLUK5+kainate+receptors+decreases+neuroblast+migration+in+whole-mounts+of+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone.</a> J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).</li>
<li>Nam, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+features+of+postnatal+subventricular+zone+cell+motility%3A+a+two-photon+time-lapse+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study.</a> J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).</li>
<li>Kim, Y., Comte, I., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+subventricular+zone+stem+and+progenitor+cells+are+sessile+and+epidermal+growth+factor+receptor+negatively+regulates+neuroblast+migration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Adult mouse subventricular zone stem and progenitor cells are sessile and epidermal growth factor receptor negatively regulates neuroblast migration.</a> PLoS One. 4, e8122(2009).</li>
<li>Bortone, D., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCC2+expression+promotes+the+termination+of+cortical+interneuron+migration+in+a+voltage-sensitive+calcium-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner.</a> Neuron. 62, 53-71 (2009).</li>
<li>Comte, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-3+maintains+cell+motility+from+the+subventricular+zone+to+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb.</a> J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La mirati corretta dei precursori neuronali alle regioni cerebrali appropriate è un processo fondamentale alla base il corretto montaggio e la funzione dei circuiti neurali. La grande maggioranza delle cellule migrano durante lo sviluppo embrionale e nel cervello postnatale solo in alcune regioni, come la OB, giro dentato e cervelletto, spostamento neuronale avviene ancora. I meccanismi orchestrando la migrazione delle cellule nel cervello postnatale rimangono, tuttavia, poco conosciuto. La conoscenza dei meccanismi e l...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> Sigma </td><td> S9378 </td></tr><tr><td> Glucosio (ACSF) </td><td> EMD </td><td> DX0145-3 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S9625 </td></tr><tr><td> KCI </td><td> Sigma </td><td> P9541 </td></tr><tr><td> MGCI 2 x6H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2670 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S5761 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 xH 2 O </td><td> EMD </td><td> SX0710-1 </td></tr><tr><td> CACI 2 x2H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3881 </td></tr><tr><td> Destrano TexasRed </td><td> Invitrogen </td><td> D1864 </td></tr><tr><td> Destrano CascadeBlue </td><td> Invitrogen </td><td> D1976 </td></tr><tr><td> Glucosio (soluzione 40X) </td><td> Sigma </td><td> G8769 </td></tr><tr><td> Sodio pyruvat </td><td> Gibco </td><td> 11360-070 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170-112 </td></tr><tr><td> DNasi I </td><td> Sigma </td><td> D-5025 </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Gibco </td><td> 25300-054 </td></tr><tr><td> Media Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> BSA </td><td> EMD </td><td> 2930 </td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> Life Technologies </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Ketamina / Xylazina </td><td> CDMV </td><td> 5230 </td></tr><tr><td> Pipetta Pasteur </td><td> VWR </td><td> 14672-380 </td></tr><tr><td> 15 ml tubo conico </td><td&gt; Sarstedt </td><td> 62.553.205 </td></tr><tr><td> Provetta da 50 ml </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.205 </td></tr><tr><td> Vetro capillari (iniezione stereotassica) </td><td> WPI </td><td> 4878 </td></tr><tr><td> Olio di paraffina </td><td> EMD </td><td> PX0045-3 </td></tr><tr><td> Proviodine </td><td> Rougier </td><td> 65655-1370 </td></tr><tr><td> Suturare </td><td> Stoelting </td><td> 50487 </td></tr><tr><td> Anafen </td><td> CDMV </td><td> 11508 </td></tr><tr><td> Siringa da 20 cc </td><td> VWR </td><td> SS-20L2 </td></tr><tr><td> Petri </td><td> VWR </td><td> 25384-094 </td></tr><tr><td> Agar </td><td> Laboratoire Mat </td><td> AP-0108 </td></tr><tr><td> Colla </td><td> Permabond </td><td> 910 </td></tr><tr><td> 95% O 2/5% di CO 2 </td><td> Linde </td><td> 24068835 </td></tr><tr><td> Lama &lt;/ Td&gt; <td> WPI </td><td> 501901 </td></tr><tr><td> Rete nylon </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0198 </td></tr><tr><td> Centrifuga </td><td> Eppendorf </td><td> 5702 000.019 </td></tr><tr><td> Pipettare estrattore </td><td> Sutter Instrument </td><td> P-97 </td></tr><tr><td> Nanolitri iniettore </td><td> WPI </td><td> B203MC4 </td></tr><tr><td> Apparato di iniezione stereotassica </td><td> WPI </td><td> 502900 </td></tr><tr><td> Trapano sistema Micro </td><td> WPI </td><td> 501819 </td></tr><tr><td> Vibratomo </td><td> Thermo Scientific </td><td> 920110 </td></tr><tr><td> Ampio campo di microscopio a fluorescenza </td><td> Olimpo </td><td> BX61WIF </td></tr><tr><td> Telecamera CCD </td><td> Fotometrici </td><td> CS-HQ2-D </td></tr><tr><td> Ultra-quiet immagini camera </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 64-1487 </td></tr><tr><td> PH-1Serie 20 riscaldatore piattaforma </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 64-0284 </td></tr><tr><td> Sistema di riscaldamento </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-344B </td></tr><tr><td> 40X acqua obiettivo ad immersione </td><td> Olimpo </td><td> 1-UM587 </td></tr><tr><td> 10 volte più acqua di obiettivo ad immersione </td><td> Olimpo </td><td> 1-UM583 </td></tr><tr><td> Lambda DG-4 </td><td> Sutter Instruments </td><td> DG-4/OF </td></tr><tr><td> MetaMorph software </td><td> Molecular Devices </td><td> 40000 </td></tr><tr><td> Imaris software </td><td> Bitplane </td><td> BPI-IM70-F1 </td></tr></tbody></table>

time-lapse imaging delle migrazioni neuroblasti in fette acuta del prosencefalo topo adulto

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

Vi è un sostanziale corpo di prove che indicano che i nuovi neuroni funzionali sono costitutivamente generati da un pool endogeno delle cellule staminali neurali nelle aree riservate del cervello dei mammiferi adulti. Neuroblasti Newborn dalla zona subventricolare (SVZ) migrano lungo il torrente migratorio rostrale (RMS) per la loro destinazione finale nel bulbo olfattivo (OB) 1. Nel RMS, neuroblasti migrano tangenzialmente in catene ensheathed da processi astrocitari 2,3 utilizzando vasi sanguigni come supporto strutturale e una fonte di fattori molecolari richiesti per la migrazione 4,5. Nel OB, neuroblasti staccare dalle catene e migrano radialmente negli strati differenti bulbari dove si differenziano in interneuroni e integrare nella rete esistente 1, 6. In questo manoscritto si descrive la procedura per la migrazione delle cellule di controllo in fettine acute del cervello dei roditori. L&#39;uso di sezioni acute permette assessmento di migrazione cellulare nel microambiente che somiglianti a condizioni in vivo e nelle regioni del cervello che sono di difficile accesso per l&#39;imaging in vivo. Inoltre, evita condizione lunga coltura come nel caso di colture organotipiche e cellule che possono eventualmente alterano le proprietà di migrazione delle cellule. Precursori neuronali in fettine acute possono essere visualizzate utilizzando ottiche DIC o proteine ​​fluorescenti. Etichettatura virale dei precursori neuronali nel SVZ, innesto neuroblasti da topi reporter nella SVZ di topi wild-type, e l&#39;utilizzo di topi transgenici che esprimono la proteina fluorescente in neuroblasti sono tutti i metodi adatti per la visualizzazione neuroblasti e dopo la loro migrazione. Il metodo seguito, tuttavia, non consente di singole celle essere monitorati per lunghi periodi di tempo a causa della elevata densità di cellule marcate. Abbiamo utilizzato un ampio campo di microscopio fluorescente verticale dotato di una fotocamera CCD per ottenere un intervallo di acquisizione relativamente rapido (uno image ogni 15 o 30 secondi) per identificare in maniera affidabile la fase stazionaria e migratori. Una identificazione precisa della durata delle fasi stazionarie e migratorio è cruciale per l&#39;interpretazione univoca dei risultati. Abbiamo anche eseguito più z-step acquisizioni per monitorare la migrazione neuroblasti in 3D. Ampio campo di imaging a fluorescenza è stato ampiamente utilizzato per visualizzare migrazione neuronale 7-10. Qui, descriviamo protocollo dettagliato per l&#39;etichettatura di neuroblasti, l&#39;esecuzione in tempo reale di video-imaging della migrazione neuroblasti in fettine acute del proencefalo topo adulto, e analizzare la migrazione cellulare. Mentre il protocollo descritto esemplificato la migrazione dei neuroblasti del RMS adulto, può anche essere utilizzata per seguire la migrazione cellulare nel cervello embrionale e postnatale precoce.

Si descrive un protocollo per tempo reale videoimaging della migrazione neuronale nel proencefalo mouse. La migrazione di viralmente-etichettati o innestate precursori neuronali è stata registrata in fettine acute vivo utilizzando ampio campo dell&#39;imaging fluorescente con un intervallo di acquisizione relativamente rapido per studiare le diverse fasi di migrazione cellulare, comprese le durate delle fasi stazionaria e migrazione e la velocità di migrazione.

Time-lapse imaging delle Migrazioni neuroblasti in fette acuta del prosencefalo topo adulto

Esiste un consistente corpo di prove che indica come nuovi neuroni funzionali siano generati costantemente da un pool endogeno di cellule staminali neurali...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare la migrazione dei neuroblasti in sezioni acute del cervello di topo adulto. Questo viene ottenuto innanzitutto etichettando i precursori neuronali nella zona subventricolare adulta da cinque a otto giorni dopo l'etichettatura dei neuroblasti, quindi preparando sezioni acute del cervello del topo. Successivamente, viene effettuata l'acquisizione di immagini in time-lapse della migrazione dei neuroblasti.Infine, la microscopia in tempo reale a campo chiaro viene utilizzata per mostrare la dinamica della migrazione dei neuroblasti in sezioni acute. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dello sviluppo neuronale studiando il ruolo di diversi segnali molecolari e dei meccanismi cellulari coinvolti nella migrazione cellulare. Attualmente, questo approccio può fornire informazioni sui processi fisiologici che regolano la migrazione neurale nel cervello adulto, ma può essere applicato anche in altri sistemi, ad esempio per lo studio della migrazione neurale nel cervello ischemico e durante lo sviluppo embrionale.Iniziare questa procedura preparando un liquido cerebrospinale artificiale a base di saccar

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Questo protocollo descrive un saggio organotipica fetta ottimizzato per il cervello postnatale e ad alta risoluzione time-lapse imaging di migrazione neuroblasti nel flusso migratorio rostrale.

Un saggio Slice organotipica per High-Resolution Time-Lapse Imaging della migrazione neuronale nel cervello postnatale

Source: Wiegreffe, C., et. al.,  Time-lapse Imaging confocale di neuroni in migrazione in una coltura di fette organotipiche del cervello embrionale di topo utilizzando In Utero Elettroporazione. J. Vis. Exp. (2017) Questo video mostra la microscopia confocale time-lapse per osservare la migrazione radiale del neurone corticale dalla zona subventricolare alla placca corticale tramite scaffold gliali radiali in fette di cervello embrionale di topo trasdotte.

Imaging time-lapse della migrazione radiale dei neuroni corticali in fette di cervello embrionale di topo trasdotto

Migrazione neuroblasti è un evento fondamentale nella neurogenesi postnatale. Descriviamo un protocollo per l'etichettatura efficiente dei neuroblasti di elettroporazione in vivo postnatale e la successiva visualizzazione della loro migrazione utilizzando time-lapse imaging di fette di cervello acuto. Includiamo una descrizione per l'analisi quantitativa delle dinamiche neuroblasti di monitoraggio video.

In vivo postnatale elettroporazione e Time-lapse imaging di migrazione neuroblasti in mouse acuta Fette cervello

Questo protocollo fornisce istruzioni per l'osservazione diretta dei migratori radiali di neuroni corticali. Nell'utilizzo dell'elettroporazione uterina, la coltura organotipica della fetta e l'imaging confocale a tempo intervallo sono combinati per studiare direttamente e dinamicamente gli effetti di sovraespressione o di downregolazione di geni di interesse nei neuroni migratori e di analizzare la loro differenziazione durante lo sviluppo.

Impressione confocale dei migratori dei neuroni nella cultura di fetta organotipica del cervello embrionale del mouse usando<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione

Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, i neuroni e le cellule gliali hanno origine nella zona ventricolare che riveste il ventricolo e migrano verso la superficie del cervello. Molti geni sono coinvolti in questo processo. Questo protocollo introduce la tecnica per l'imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali.

Imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali in fette di cervello embrionale di topo

Risonanza magnetica (MRI) è diventato uno strumento sempre più popolare per l'esame del fenotipo di topi geneticamente modificati. Questo articolo illustra i metodi necessari per raggiungere high-throughput fenotipizzazione di topi geneticamente modificati utilizzando più-mouse risonanza magnetica.

Multiple-topo Imaging neuroanatomici Risonanza Magnetica

Il video presente mostra un metodo che sfrutta la combinazione di elettroporazione e microscopia confocale per eseguire l'imaging in diretta su singole cellule progenitrici neurali nel proencefalo zebrafish via di sviluppo.

Time-lapse immagini dal vivo di relazione clonale cellule progenitrici neurali in via di sviluppo Zebrafish proencefalo

Un metodo per caricare zona subventricolare (SVZ) cellule con coloranti di calcio indicatori per l'attività di registrazione di calcio è descritto. Il post-natale SVZ contiene cellule ravvicinate comprese le cellule progenitrici neurali e neuroblasti. Piuttosto che utilizzare loading bagno abbiamo iniettato il colorante dalla pressione all'interno del tessuto consentendo una migliore diffusione colorante.

Preparazione di acuta fette zona subventricolare for Imaging di calcio

La preparazione di fettine cerebrali acute di ippocampo isolato, così come le registrazioni elettrofisiologiche simultanee di astrociti e neuroni...

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Anche se il sistema nervoso periferico (PNS) è in grado di riparare significativo dopo l'infortunio, poco si sa circa i meccanismi cellulari e molecolari che regolano questo fenomeno. Utilizzando vivo, zebrafish transgenico e riproducibile saggio resezione del nervo, siamo in grado di studiare i comportamenti delle cellule gliali dinamici durante la degenerazione dei nervi e la rigenerazione.

Motor Nerve transezione e Time-lapse imaging di gliali comportamenti delle cellule in vivo Zebrafish

Scopri l'imaging time-lapse della migrazione dei neuroblasti nel prosencefalo adulto del topo. Questo metodo utilizza microscopia a fluorescenza wide-field per analizzare le dinamiche migratorie in fette acute.

Time-lapse imaging delle Migrazioni neuroblasti in fette acuta del prosencefalo topo adulto

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