Time-lapse imaging delle Migrazioni neuroblasti in fette acuta del prosencefalo topo adulto

Si descrive un protocollo per tempo reale videoimaging della migrazione neuronale nel proencefalo mouse. La migrazione di viralmente-etichettati o innestate precursori neuronali è stata registrata in fettine acute vivo utilizzando ampio campo dell'imaging fluorescente con un intervallo di acquisizione relativamente rapido per studiare le diverse fasi di migrazione cellulare, comprese le durate delle fasi stazionaria e migrazione e la velocità di migrazione.

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare la migrazione dei neuroblasti in fette acute del cervello di topo adulto. Ciò si ottiene etichettando prima i precursori neuronali nella zona subventricolare adulta da cinque a otto giorni dopo la marcatura dei neuroblasti, preparando fette acute del topo per il cervello. Successivamente, viene eseguita l'imaging time lapse della migrazione dei neuroblasti.

In definitiva, la microscopia in tempo reale a campo largo viene utilizzata per mostrare le dinamiche della migrazione dei neuroblasti nelle fette acute. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo neuronale studiando il ruolo di diversi segnali molecolari e i meccanismi cellulari che coinvolgono la migrazione cellulare. Ora questo metodo può fornire informazioni sui processi fisiologici che regolano la migrazione neurale in un adulto per il cervello, ma può anche essere applicato in altri sistemi come lo studio della migrazione neurale nel cervello ischemico e durante lo sviluppo embrionale.

Iniziare questa procedura preparando un liquido cerebrospinale artificiale a base di saccarosio per tagliare le fette e un liquido cerebrospinale a base di cloruro di sodio a 32 gradi Celsius per mantenere le fette fino all'imaging, quindi ossigenare le soluzioni gorgogliandole continuamente con il 95% di ossigeno, il 5% di anidride carbonica. Successivamente, anestetizzare il topo con il neuroblasto marcato in fluorescenza utilizzando ketamina xilazina per via interale. Quindi preparare rapidamente la soluzione di taglio ghiacciata a freddo con un aspetto gelatinoso utilizzando azoto liquido.

Successivamente, prelevare da 15 a 20 millilitri di soluzione per taglio a freddo con una siringa da 20 cc e perfondere il topo intra Cardi. Se i vasi sanguigni devono essere etichettati invece di perfondersi con la soluzione di taglio, iniettare 200 microlitri di destrano rosso Texas a una concentrazione di 10 milligrammi per millilitro, trans Cardi nel ventricolo sinistro del cuore e attendere due o tre minuti prima di decapitare il topo dopo la perfusione transcardiaca, decapitare rapidamente il topo, immergere rapidamente la testa nella soluzione di taglio ghiacciata e spostarla al vibrato. Taglia il cranio con le forbici lungo la sutura sagittale dal cervelletto al bulbo olfattivo.

Successivamente, rimuovere delicatamente i lembi cranici utilizzando un paio di pinze Successivamente, asportare la parte coccolosa del cervello usando un bisturi. Quindi fai due tagli sagittali sulla parte più laterale di ciascun emisfero e taglia il cervello lungo la fessura intra emisferica. Quindi rimuovere delicatamente il cervello usando una spatola e metterlo in una soluzione di taglio a freddo ghiacciata.

Posizionare i due emisferi separatamente su un blocco di agar al 4% con il lato dorsale a contatto con l'agar. Successivamente, incolla il blocco con il lato tagliato lateralmente dei due emisferi alla piattaforma di una Vibram con il lato mediale rivolto verso l'alto. Successivamente, posiziona la piattaforma nella camera Vibram.

Riempilo con la soluzione di taglio. Quindi mantenere la soluzione ossigenata durante la preparazione della fetta facendola gorgogliare con il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica. Preparare ora le sezioni di 250 micron di spessore con il vibratore.

Per ottenere sezioni di alta qualità, è necessario utilizzare una bassa velocità di taglio e vibrazioni della lama ad alta frequenza. Non appena una fetta viene rilasciata dalla lama, rimuoverla delicatamente dalla soluzione di taglio e porla in una camera di incubazione riempita con A CSF ossigenato mantenuto a 32 gradi Celsius a bagnomaria. In questa procedura, posizionare con cura la fetta nella camera di imaging del microscopio per evitare la deriva della fetta durante l'imaging.

Stabilizzarlo posizionando con cura una rete di nylon sulla parte superiore. Assicurarsi che la fetta sia continuamente perfusa con A CSF. Quindi, usa un obiettivo 10 x per trovare un campo di interesse.

Apri il software metamorph e verifica che la rete di nylon non ostruisca il campo di imaging. Quindi agganciare l'obiettivo 40 x e regolare la messa a fuoco. Assicurati che ci sia abbastanza soluzione tra l'obiettivo e la fetta.

Utilizzando il software metamorph impostare i parametri di acquisizione time-lapse, come la durata dell'eccitazione, il numero di piani Z, la distanza tra ciascuna sezione Z, l'intervallo di tempo e la durata della registrazione. Quindi avviare l'acquisizione time lapse. I dati vengono salvati automaticamente da Metamorph come file tiff Con ogni file corrispondente a un punto temporale del video time lapse acquisito per aprire il filmato in Mrs.Load

le immagini acquisite semplicemente trascinando e rilasciando l'immagine del primo punto temporale del video nell'icona del programma. Una volta caricato il filmato, regolare la luminosità e il contrasto del segnale nella finestra di regolazione del display. Imposta i parametri del video acquisito, come la dimensione del voxel e l'intervallo di tempo nelle proprietà dell'immagine, e imposta finestre di punti temporali equidistanti.

Dopo aver specificato la dimensione del voxel, è possibile vedere il fotogramma in 3D, nonché il tempo e la scala del video per tracciare automaticamente le celle registrate. Crea un punto per ogni cella nel campo nella finestra di superamento scegliendo la funzione spot, misura il diametro della cella da tracciare nella finestra di sezione. Imposta i parametri per il tracciamento e procedi.

Ispeziona l'affidabilità degli oggetti rilevati nel tempo. Se tutte le celle in migrazione non vengono rilevate automaticamente, modificare la soglia di rilevamento e assicurarsi che tutte le celle siano state selezionate con macchie in tutti i punti temporali. La distanza massima e la dimensione massima dello spazio tra due punti che rappresentano punti temporali vicini della stessa traccia devono essere specificati in modo che il programma possa collegare i punti temporali.

Una volta create le tracce, è possibile filtrarle e rimuovere le tracce irrilevanti semplicemente eliminandole. Le tracce possono essere corrette collegando e disconnettendo diverse tracce e diversi punti temporali della stessa traccia non appena tutte le correzioni sono state effettuate. Dai un'occhiata finale alle tracce ed esporta i dati, inclusi lo spostamento delle celle per punto temporale, la lunghezza della traccia, la lunghezza dello spostamento e la durata della traccia in un file Excel.

Questo video mostra l'imaging in time lapse della migrazione dei neuroblasti verdi lungo i vasi sanguigni etichettati con il rosso destrano, Texas. Si noti che i neuroblasti migratori mostrano un comportamento saltatorio quando le fasi migratorie sono interrotte da periodi stazionari. E questo video mostra il tracciamento della migrazione dei neuroblasti da parte del software imas.

Le sfere e le linee indicano rispettivamente i corpi cellulari e le tracce di migrazione per le singole cellule. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che è necessario ottenere fette di vita acuta di buona qualità del proencefalo di topo adulto. Inoltre, le fette devono essere ben stabilizzate nella camera di imaging posizionando con cura una rete di nylon per evitare la deriva della fetta durante l'imaging.

Qualsiasi variazione della velocità di perfusione del liquido cerebrospinale A, perfusione irregolare o drastica variazione di temperatura può causare deriva e cambiamenti nel piano focale durante l'imaging. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come registrare e analizzare la migrazione dei neuroblasti nelle fette adulte acute. Si consiglia di utilizzare un breve intervallo medico nell'ordine di 15-30 secondi per identificare in modo affidabile l'inizio e la fine delle fasi migratorie e stazionarie.