Analisi di Single-cell trascrizione del gene per l'RNA fluorescente In Situ Ibridazione (FISH)

Fluorescente

Mi chiamo Elena Rand e lavoro presso il Center for Medical Pathology dell'Università di Copenhagen in Danimarca. Qui, circa 60 persone provenienti da varie parti del mondo stanno lavorando con la malaria. Il nostro gruppo sta lavorando con focolai di plasmodio, parassiti.

Sono i più violenti che causano la malaria negli esseri umani in modalità plus. La focolaio esprime proteine di superficie che ospitano varie funzioni come l'adesione alle cellule ospiti. Il gruppo più numeroso di proteine di adesione è la cosiddetta proteina di membrana eritrocitaria della stanza della focaria dell'odos, la cosiddetta PfMP.

Esistono almeno 60 varianti, di cui si ritiene che solo una sia stata trascritta per cellula alla volta durante la fase ematica dell'infezione. Nel nostro dipartimento, riteniamo che più di una proteina possa essere trascritta contemporaneamente nei parassiti. Un metodo per rilevare tale attività è l'mRNA fluorescente nel seme per l'ibridazione dei pesci.

Qui presentiamo un metodo su misura per la rilevazione dell'mRNA, trascritti di due geni diversi in un singolo nuclide di eritrociti infetti da odum FCI. Il metodo richiede due giorni per essere completato. Il primo giorno prevede la preparazione di sonde di RNA, l'aggiunta ai parassiti fissati su vetrini e l'ibridazione su noci.

Il secondo giorno prevede la congregazione degli anticorpi, l'amplificazione del fluoro e la visualizzazione dei parassiti colorati al microscopio confocale. Per dare una panoramica dell'esperimento, viene mostrato un diagramma di flusso delle operazioni critiche Reagenti e materiali utilizzati nell'esperimento. RNA zap dig kit di etichettatura biotina, RNA, miscela di etichettatura, aldeide paraformale, acido acetico glaciale, anticorpo anti-dig pepina, anticorpo anti-biotina, TSA PL plus sistema di fluorescenza del palato, RNA DPI, microprovette libere, etanolo ETH, vetrini puliti, vetrini coprioggetti autoclavati, attrezzature sterili come forbici e pinze, un barattolo di vetro di accoppiamento.

Gli eritrociti infetti devono essere controllati con il sostentamento del gioco per assicurarsi che siano al giusto stadio di sviluppo. Cioè gli stadi dell'anello di trascrizione VAR in sincronia e in buone condizioni. È fondamentale scegliere l'esatta fase di sviluppo del ciclo di vita in cui avviene la trascrizione.

Poiché le singole specie di RNA vengono messe in stadio, specificamente trascritte e rapidamente degradate, le cellule devono essere lavate delicatamente prima di creare film di sangue sottili e di altissima qualità su vetrini puliti, un monostrato uniforme di globuli rossi infetti sul vetrino viene quindi fissato in una soluzione di aldeide paraforme al 4% e acido acetico glaciale al 5% per 10 minuti. Quindi i vetrini vengono lavati due volte in PBS, rimuovere delicatamente il liquido dai vetrini con il fazzoletto. Quindi permealizzare le cellule con una soluzione di acido cloridrico preriscaldante da 10 millimolari prima di aggiungere la Pepsi.

Incubarlo a 37 gradi centigradi per due minuti prima dell'ibridazione. Le sonde vengono denaturate a 65 gradi centigradi per cinque minuti, raffreddano rapidamente il ghiaccio e poi aggiunte alle celle, che ora sono fissate sul vetrino, mettere un vetrino coprioggetti sopra le celle e rimuovere eventuali bolle d'aria con una piccola punta di pipetta. Umidificare la camera di ibridazione aggiungendo gocce di acqua distillata doppia alla periferia della camera in modo che i vetrini rimangano umidi nella camera.

Durante la procedura di ibridazione, mettere i vetrini nella camera di ibridazione per una notte a 48 gradi centigradi. Dopo 16-17 ore di ibridazione, i vetrini vengono accuratamente rimossi dalla camera di ibridazione. Da questa fase in poi, non vi è alcun requisito assoluto per un ambiente privo di RNA.

Lavare i vetrini in un barattolo di vetro riempito con tampone TNT, assicurandosi che i vetrini si stacchino dal vetrino. Ripetere la procedura di lavaggio tre volte, quindi bloccarli nel tampone TNB per mezz'ora. Aggiungere alle cellule gli anticorpi anti-dig coniugati HRP o anti biotina marcata.

Entrambi i tipi di anticorpi marcati possono essere aggiunti contemporaneamente. Se l'esperimento mira a rilevare due trascritti di mRNA nelle cellule, gli anticorpi devono essere pre-diluiti. Nel tampone TNB, incubare per una o due ore, lavare tre volte in tampone TNT, quindi aggiungere un fluorocromo alle cellule lavate, A diluito FSE o ciano.

Tre soluzioni devono essere preparate al momento. Da questo passaggio in poi, è importante non esporre le diapositive direttamente a una luce intensa. Incubare i vetrini per 10-15 minuti con il fluorocromo.

Se si rilevano due trascritti di mRNA dopo la prima incubazione, lavare via il primo colorante e aggiungere il secondo. Effettuare un lavaggio finale in TNT Buffer. Immergere i vetrini in acqua distillata doppia prima di asciugarli all'aria.

Aggiungi il dappy e metti un vetrino coprioggetti sopra la diapositiva. Rimuovere eventuali bolle d'aria e sigillare i bordi del vetrino coprioggetto con smalto o smalto ad asciugatura rapida. Qui vediamo un singolo eritrocita infetto contenente un parassita.

Il blu, il DPE, rappresenta il DNA del parassita e il verde rappresenta l'mRNA di un gene che viene trascritto. Nell'altra immagine, il colore rosso rappresenta l'mRNA dell'altro gene, e nella terza immagine possiamo vedere la doppia colorazione di entrambe le trascrizioni geniche. Le immagini rivelano anche che gli mRNA attaccati sono sovrapposti al DNA nucleare e generalmente non giacciono sopra o accanto ad esso.

Nel 99% degli eritrociti infetti, possiamo rilevare l'mRNA di due geni in fase di trascrizione. Un aspetto importante di questo esperimento è quello di verificare che le sonde non stiano ricottura ad altri geni. In questa immagine, abbiamo incubato gli eritrociti infetti con entrambe le sonde, ma solo una sonda è un IE in ginocchio. Gli altri geni non vengono trascritti qui.

Questa situazione è invertita in queste altre immagini negli eritrociti infetti visualizzati. I parassiti della palma odium phos hanno membrane generalmente ben conservate con colorazione ben definita sia del DNA che dell'RNA. Se le cellule sono per qualche motivo di scarsa qualità, anche la colorazione diventerà scarsa.

Come mostrato in questa immagine, il DNA e l'RNA appariranno diffusi, torbidi e relativamente indefiniti. Per concludere, si può dire che questo metodo può essere facilmente applicato ad altri parassiti trasmessi per via ematica. I nostri dati di trascrizione sono stati anche supportati da esperimenti per rilevare le proteine tradotte dagli mRNA analizzati utilizzando anticorpi specifici che hanno come bersaglio le proteine EMP one espresse in superficie sulle cellule infette.