Name: Analisi di Single-cell trascrizione del gene per lRNA fluorescente In Situ Ibridazione (FISH) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Scopri la tecnica FISH per analizzare i trascritti di mRNA in singole cellule infette da Plasmodium falciparum. Questo metodo rivela l'attività trascrizionale simultanea dei geni var nella malaria.

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Gli autori desiderano ringraziare Michael Alifrangis e Ulla Abildtrup per la genotipizzazione di parassiti e Christina Holm per un&#39;eccellente assistenza tecnica. Questo lavoro è stato finanziato da Howard Hughes Medical Institute (sovvenzione 55.005.511), la Fondazione Lundbeck (sovvenzione R9-A840) e dalla Fondazione Niels Bohr.

1. Generazione di appena selezionati eritrociti infetti Per questo test, i risultati migliori si ottengono utilizzando colture appena selezionati per espressione di superficie di PfEMP1 proteine. In questo esperimento particolare, il P. 3D7 lineage falciparum è stato selezionato utilizzando anticorpi specifici come descritto in precedenza 1. Giorno 1 <ol><li> Harvest 200 pl di globuli confezionati da un P. falciparum coltura contenente 2-5% IE fase tardiva mediante centrifugazione a 800 xg per 8 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere il pellet sangue in 2 ml di 37 ° C caldo soluzione 0,75% di gelatina in una provetta sterile 14 ml, e lasciare per 15-20 minuti a 37 ° C per consentire l&#39;IE non infette e anello fase sedimenti. </li><li> Raccogliere il ritardo-fase IE, cioè la fase superiore, in una nuova provetta 14 ml e lavare due volte con 10 ml di 37 ° C caldi RBC-lavaggio media. </li><li> Diluire 50 ml di anticorpi specifici anti-PfEMP1 anticorpi in 2 ml di 37 ° C caldo RBC-lavaggio mezzi e filtro sterili. </li><li> Mescolare il lavato all&#39;ultimo stadio IE con gli antisieri sterilizzato diluito in un tubo 14 ml sterile e incubare per 30 min a 37 ° C con agitazione. </li><li> Centrifugare a 800 xg per 8 minuti a temperatura ambiente, e lavate due volte con 10 ml di 37 ° C caldi RBC-lavaggio media. </li><li> Lavare 50 pl di proteina Dynabead Una sospensione due volte con RBC-lavaggio supporti tramite un DynaMaq-15 magnete. </li><li> Risospendere le Dynabeads in 300 ml RBC-lavaggio dei media e aggiungerli alla lavato fase avanzata di IE. Incubare per 30 min a 37 ° C con agitazione. </li><li> Trasferire il tubo al DynaMaq-15 magnete. Lasciare agire per 1-2 minuti e rimuovere tutto il liquido. </li><li> Risospendere le Dynabeads in 4-5 ml di RBC-lavaggio dei media. Trasferire il tubo sul magnete e lasciare per 1-2 minuti prima di rimuovere tutto il liquido. Ripetere la fase di lavaggio una volta. </li><li> Trasferire le perle lavate a un cm 25 2 f cultura sterileLASK contenente 200 ul cellule rosse del sangue appena confezionati. Aggiungere 5-6 ml di Albumax supporto nella cultura. Memorizzare una notte a 5% di CO 2 a 37 ° C. </li></ol> Giorno 2 <ol start="12"><li> Rimuovere i Dynabeads dalla cultura in cui il IE selezionato è reinvaded le cellule rosse del sangue fresco, trasferendo tutta la cultura in una provetta 14 ml sterile. Inserire il tubo sul DynaMaq-15 magnete e lasciar riposare per 1-2 minuti. Poi, versare tutto il liquido nuovamente ad un pallone di coltura. </li><li> Cultura per il minor numero possibile di cicli fino ad un parassitemia del 5-10% e parassiti sono al ringstage. </li><li> IE devono essere analizzate mediante FACS per assicurarsi che il fenotipo corretta superficie, cioè l&#39;espressione della proteina di entrambi and/orPF11_0008 PFD1235w è stato ottenuto 1. </li></ol> 2. Preparazione di sonde Le sonde di RNA antisenso sono stati generati dalle regioni più variabili della PFD1235w e la var PF11_0008 &lt;/ Em&gt; geni di P. falciparum 3D7 DNA genomico. DNA è stato amplificato mediante PCR e clonato nel vettore pSPT18 o 19 per la trascrizione, rispettivamente, secondo la descrizione del produttore (Roche). Le sonde (580 paia di basi (bp) e 590 bp di lunghezza) sono state marcate con digossigenina (DIG) o biotina mediante un kit DIG RNA etichettatura o biotina RNA Mix etichettatura, rispettivamente. Abbiamo confermato la specificità delle sonde sia mediante analisi Northern blot e da etichetta singola analisi FISH 1. 3. Striscio sottile e la fissazione di parassiti Prima di ibridazione in situ Giorno 1 Tutte le fasi vengono eseguite in un ambiente privo di RNasi e tutti i reagenti sono RNase-free o pre-trattato con dietil pirocarbonato (DEPC) o RNasi Zap (Invitrogen). Le diapositive e le marze di copertura devono essere puliti con alcool per rimuovere grasso residuo di produzione. È importante eseguire il protocollo senza pausa tra fasial fine di minimizzare il rischio di contaminazione nucleasi. <ol><li> Fare un film sottile di sangue con il metodo standard diffusione 3. Utilizzando la lente obiettivo 100x olio del microscopio, contare il IE e calcolare la percentuale di IE nella cultura. Verificare che le fasi parassiti sono in sincronia approssimativi, sul ring e prime fasi del ciclo di trofozoite IE. Questi sono i pre-replicazione, uni-nucleate fasi, esprimendo mRNA gene var e adatto per le prove singole di trascrizione FISH delle cellule di questo tipo. </li><li> Trasferire 50 microlitri della cultura parassita, ad una parassitemia del 5-10%, 1,5 ml di una RNase-free provetta Eppendorf. Centrifugare per 1 min a 2000 rpm a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il supporto e aggiungere 50 microlitri di PBS pH 7.2 in DEPC-acqua trattata. Agitare delicatamente il tubo. Ripetere il passaggio centrifuga sedimentazione due volte per lavare le cellule prive di mezzi di comunicazione e detriti cellulari. </li><li> Fai quattro buona qualità strisci sottili. Per ogni striscio, fare uno striscio sul&#39;altro di 11 mm di diametro e di una slitta 4 bene, vale a dire quattro lastre di vetro in totale, in una RNasi-free cofano (un passaggio fondamentale). Onda scivola brevemente in aria per asciugare. Effettuare tre diapositive supplementare per diapositiva controlli negativi-one per la colorazione singola sonda per qualsiasi altro gene irrilevante utilizzando una sonda specifica, un&#39;altra diapositiva per il trattamento RNasi e una terza slitta contenente IE non esprime il gene di interesse. Lasciare i vetrini si asciughino in panchina per 10-20 min. </li><li> Fissare i film sottili aggiungendo 60 pl di soluzione di fissazione contenente paraformaldeide al 4% e il 5% di acido acetico glaciale nei pozzetti. Lasciare agire per 10 minuti in panchina a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini in 2x SSPE tampone per 5 minuti agitando con prudenza a temperatura ambiente. Brevemente rimuovere il liquido in eccesso premendo i pozzetti contenenti le cellule delicatamente con un fazzoletto di carta. </li><li> Coprire i vetrini con il 0,01% di pepsina in HCl 0,01 M per 2 minuti a 37 ° C (un passo estremamente critico). Lavare i vetrini in 2x SSPE per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Diluire la soluzione RNasi ad una concentrazione finale di 10 pg / ml. Coprire gli strisci di controllo negativo con il 60 microlitri della soluzione del RNasi. Incubare per 30 min a 37 ° C e poi lavare i vetrini in 2x SSPE per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Procedere immediatamente alla fase di ibridazione. </li></ol> 4. Ibridazione di sonde di RNA a diapositive fisse Giorno 1 <ol><li> Preparare la camera di ibridazione, come ad esempio un Thermostar HC4 100 o una scatola vuota puntale messo in un forno pulito, bagnandoli con RNasi Zap e asciugandosi pulirlo con un fazzoletto di carta. Riempire i canali della camera di ibridazione o il fondo della scatola con acqua trattata con DEPC per assicurarsi che i vetrini non si asciughino durante l&#39;ibridazione. Chiudere la camera e preriscaldare a 48 ° C. </li><li> Diluire le sonde nella soluzione di ibridazione ad una concentrazione finale di 12 ng / pl. Denaturare la soluzione della sonda a 65 ° C per 5 minuti in un blocco di riscaldamento. Immediatamente raffreddare su ghiaccio. </li><li> Brevemente l&#39;aria asciugare i vetrini dopo il lavaggio 2x SSPE. Rimuovere con cura il liquido in eccesso intorno ai pozzetti con un fazzoletto di carta. </li><li> Aprire la camera di ibridazione e posizionare i vetrini nella camera. Applicare una o entrambe le sonde in un volume totale di 60 microlitri per pozzetto. Coprire attentamente la goccia liquido con un RNasi-free coprioggetto utilizzando pinze sterili. </li><li> Chiudere la camera e ibridare i vetrini a 48 ° C per almeno 16 ore durante la notte. </li></ol> 5. Coniugazione anticorpo e Amplificazione Fluorescence Giorno 2 Le seguenti operazioni sono basate sulla TSA Plus System Palette fluorescenza da Perkin Elmer. Tutti i passaggi sono eseguiti a temperatura ambiente. <ol><li> Lavare i vetrini 3 volte in TNT tampone per 5 minuti con agitazione. </li><li> Bloccare i pozzetti in 150 ml di tampone per 30 min TNB. </li><li> Diluire il coniugato HRP-α-DIG anticorpo in tampone TNB in ​​un rapporto di 1:100 e il coniugato HRP-α-biotina in tampone TNB, con un rapporto di 1:500. Rimuovere il tampone in eccesso TNB dai vetrini con un fazzoletto di carta. Quando si rilevano due trascritti simultaneamente, entrambi gli anticorpi può andare in una sola volta. Applicare una quantità totale di 100 microlitri della soluzione di anticorpo-TNB per bene e coprire accuratamente con un vetrino coprioggetti. Incubare i vetrini per 2 ore. </li><li> Rimuovere i vetrini con attenzione. Lavare i vetrini in TNT tampone 3 volte per 5 min. </li><li> Diluire il FITC-fluoroforo nel reagente di amplificazione tiramide in un rapporto di 1:500 e applicare 100 pl della soluzione ad ogni pozzetto. Coprire i pozzetti con i vetrini coprioggetto e incubare per 12 min. </li><li> Togliere il coperchio scivola con cura e lavare i vetrini 3 volte per 5 min in tampone TNT agitando con prudenza. </li><li> Diluire il Cyan3-fluoroforo nel reagente di amplificazione tiramide ad un rapporto di 1:500. Aggiungere 100 microlitri perbene di questa soluzione. Coprire i pozzetti con i vetrini coprioggetto e incubare per 12 min. </li><li> Togliere il coperchio scivola attentamente e poi sciacquare i vetrini rapidamente per immersione in tampone TNT. </li><li> Lavare i vetrini 3 volte con tampone di TNT per 5 min. </li><li> Immergere rapidamente i vetrini in acqua trattata con DEPC. </li><li> Lasciare i vetrini asciugare all&#39;aria. Montare i vetrini con anti-fade reagente contenente DAPI. Sigillare gli angoli dei vetrini coprioggetto con smalto. </li><li> I vetrini sono ora pronti per la microscopia. Conservare i vetrini coperti con un foglio di alluminio e conservare a 4 ° C se l&#39;esperimento deve essere completata il giorno successivo. Una sigillatura completa dei lati dei vetrini possono essere effettuati 24 ore dopo l&#39;applicazione del reagente anti-fade. Ciò permetterà le diapositive da acquisire fino ad una settimana dopo il protocollo è stato completato. </li></ol> 6. Visualizzazione dei prodotti ibridati <ol><li> Accendere il microscopio. Un microscopio standard di immunofluorescenza è sufficient per questo tipo di esperimento, ma se si ha accesso ad un microscopio confocale è possibile utilizzare anche questo per le immagini in 3D o per ottenere i video delle vostre cellule colorate. Lasciare microscopio per riscaldare per 15-30 min. Accendere il computer e il software. </li><li> Verificare la qualità della colorazione sul microscopio immunofluorescenza. Scegli un posto che contiene pochi parassiti. </li><li> Regolare il guadagno di ogni laser manualmente. Regolare il pixel sosta a 4-6 m 1 s-1 e le misure di 512 x 512 pixel. </li><li> Scattare una foto di prova con cornice Lambda. Regolare il guadagno laser. </li><li> Prendete un minimo di 20 belle foto di singole cellule fluorescenti. Almeno 2-5 immagini di un campo contenente 5-20 parassiti sono necessari al fine di ottenere un quadro delle percentuale di parassiti positivi. </li></ol>

<ol><li>Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+co-expression+of+two+different+PfEMP1+antigens+on+single+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+facilitates+binding+to+ICAM1+and+PECAM1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1.</a> PLoS Pathog. 2, 1001083(2010).</li>
<li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li>
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<li>Epp, C., Li, F., Howitt, C. A., Chookajorn, T., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+associated+sense+and+antisense+noncoding+RNAs+are+transcribed+from+the+var+gene+family+of+virulence+genes+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Chromatin associated sense and antisense noncoding RNAs are transcribed from the var gene family of virulence genes of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> RNA. 15, 116-127 (2009).</li>
<li>Freitas-Junior, L. H., Hernandez-Rivas, R., Ralph, S. A., Montiel-Condado, D., Ruvalcaba-Salazar, O. K., Rojas-Meza, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+heterochromatin+propagation+and+histone+acetylation+control+mutually+exclusive+expression+of+antigenic+variation+genes+in+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Telomeric heterochromatin propagation and histone acetylation control mutually exclusive expression of antigenic variation genes in malaria parasites.</a> Cell. 121, 25-36 (2005).</li>
<li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nature Protoc. 2, 1508-1514 (2007).</li>
<li>Li, F., Sonbuchner, L., Kyes, S. A., Epp, C., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+non-coding+RNA+are+transcribed+from+the+centromeres+of+Plasmodium+falciparum+and+are+associated+with+centromeric+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nuclear non-coding RNA are transcribed from the centromeres of Plasmodium falciparum and are associated with centromeric chromatin.</a> J. Biol. Chem. 283, 5692-5698 (2008).</li>
<li>Thompson, J., Sinden, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+Pbs21+mRNA+during+sexual+development+of+Plasmodium+berghei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">In situ detection of Pbs21 mRNA during sexual development of Plasmodium berghei.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 68, 189-196 (1994).</li>
<li>Thompson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+RNA+in+blood-+and+mosquito-stage+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mole+Med%22%5BJournal%5D)">In situ detection of RNA in blood- and mosquito-stage malaria parasites.</a> Methods Mole Med. 72, 225-235 (2002).</li>
<li>Arnot, D. E., Ronander, E., Bengtsson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progression+of+the+intra-erythrocytic+cell+cycle+of+Plasmodium+falciparum+and+the+role+of+the+centriolar+plaques+in+asynchronous+mitotic+division+during+schizogony%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The progression of the intra-erythrocytic cell cycle of Plasmodium falciparum and the role of the centriolar plaques in asynchronous mitotic division during schizogony.</a> Int. J. Parasitol. 41, 71-80 (2011).</li>
<li>Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Analisi FISH RNA, a differenza di metodi come Northern blotting e RT-PCR, permette la discriminazione di mRNA trascritti specifici a livello di singola cellula. Ciò rende possibile discriminare tra cellule trascrizionalmente attiva e inattiva, in questo esempio, P. falciparum protozoi parassiti all&#39;interno globuli rossi umani. Tali cellule intere osservazioni sono spesso necessari e possono svelare modelli trascrizionali importanti e nuovi 1. Sebbene altri metodi FISH...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Acido acetico </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> 338826-100ml </td><td></td></tr><tr><td> Albumax media: RPMI 1640 soluzione Glutammina </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ml RPMI 1640 5 ml di soluzione di glutammina </td></tr><tr><td> Albumax media: Gentamicina solfato Albumax soluzione </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2,5 ml di gentamicina solfato 50 ml di soluzione Albumax </td></tr><tr><td> Albumax-soluzione: ipoxantina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H9377 </td><td> 0,8 g ipoxantina </td></tr><tr><td> Albumax-soluzione: Albumax II </td><td> Ionvitrogen </td><td> 11021-037 </td><td> 200 g Albumax </td></tr><tr><td> Albumax-soluzione: RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 4 litro RPMI 1640 Sciogliere con magnete al max. 50 ° C. Filtro sterilizzare e conservare a -20 ° C in aliquote. </td></tr><tr><td> Amberlite </td><td> Sigma </td><td> A5710-110G </td><td> Resina deionizzare formammide. </td></tr><tr><td> Anti-biotina capra pAb Coniugato perossidasi </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Dig anticorpo </td><td> Novus Biologicals </td><td> NB100-41330 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-fade reagente con DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td> I mezzi di montaggio deve curare per 24 h prima di sigillare il vetrino completamente. </td></tr><tr><td> Biotina RNA Labeling Mix </td><td&gt; Roche </td><td> 11685597910 </td><td></td></tr><tr><td> Fotocamera digitale </td><td> Digitale Nikon vista DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coprioggetto </td><td> Menzel-Glaser </td><td> 631-1570 </td><td></td></tr><tr><td> cultura pallone 25 cm 2 di superficie Nunclon </td><td> Nunc </td><td> 156340 </td><td></td></tr><tr><td> DEPC </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 32490-100ml </td><td> 1 ml DEPC in 1000 ml di acqua deinonized. Aggiungere una barra di agitazione e mescolare per 12 ore. Autoclave per 30 min. </td></tr><tr><td> Macchina fotografica digitale </td><td> Digitale Nikon vista DC-F11 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads proteina A </td><td> Invitrogen </td><td> 10002D </td><td></td></tr><tr><td> DynaMaq-15 Magnete </td><td> Invitrogen </td><td> 123-01D </td><td></td></tr><tr><td> Formammide bioultra 99% </td><td> Fluka/ Sigma </td><td> 47671-1l-F </td><td> Formammide deionizzata: 5 g di resina scambiatrice di ioni per 100 ml di formammide. Mescolare 30 min. Filtrare su carta Whatman. </td></tr><tr><td> . Gelatina 0 soluzione al 75%: Gelatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2500 </td><td> 3,75 g di gelatina in 500 ml di RPMI 1640. Riscaldare a 56 ° C per sciogliere. Filtro sterilizzare quando 56 ° C. Conservare a -20 ° C in aliquote. </td></tr><tr><td> . Gelatina 0 soluzione al 75%: RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 3,75 g di gelatina in 500 ml di RPMI 1640. Riscaldare a 56 ° C per sciogliere. Filtro sterilizzare quando 56 ° C. Conservare a -20 ° C in aliquote. </td></tr><tr><td> Glutammina soluzione: L-glutamina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3126 </td><td> 14,6 g L glutammina in 500 ml di NaCl allo 0,9%. Sciogliere, filtro sterilize e conservare a -20 ° C in aliquote. </td></tr><tr><td> Glutammina soluzione: HCl </td><td> Sigma </td><td> H1758 </td><td> 14,6 g L glutammina in 500 ml di NaCl allo 0,9%. Sciogliere, filtro sterilizzare e conservare a -20 ° C in aliquote. </td></tr><tr><td> Ibridazione soluzione: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x </td><td> Fluka / Sigma </td><td> 47671-1l-F </td><td> Totale 20 ml, mantenere congelato a -20 ° C in aliquote 10 ml di formammide deionizzata </td></tr><tr><td> Ibridazione soluzione: concentrato 50x Denhardt </td><td> Sigma </td><td> D2532 </td><td> 5ml 20xSSC </td></tr><tr><td> Ibridazione soluzione: reagente lievito tRNARoche blocco </td><td> Sigma </td><td> R-6750 </td><td> 2 ml 50x Denhardt 250 microlitri 20 mg al lievito tRNA ml </td></tr><tr><td><td> Fluka / Sigma </td><td> 31149-106GF </td><td> 0.4g Roche blocco reagente 1 ml di 10 mg per ml DNA di sperma di salmone (Critical: denaturano salmone spermDNA a 96 ° C per 5 minuti prima di aggiungere alla soluzione di ibridazione) </td></tr><tr><td> Hybridizer Thermostar 100 HC4 </td><td> Quantifoil Instruments GmbH </td><td> 1004-0011 </td><td> Può essere sostituito da forno di ibridazione e camere di ibridazione RNasi libero imbottiti con acqua DEPC. </td></tr><tr><td> Olio di immersione UV trasparente fluorescenza libero </td><td> Sigma </td><td> 10976-1EA </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio confocale o Immunofluorescenza </td><td> Nikon D-Eclipse TE2000C </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nailpolish </td><td> Disponibile in farmacia </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS 20x: NaCl KCl Na 2 HPO 4 x 2H 2 O KH 2 PO 4 DEPC deionizzata H 2 O </td><td></td><td></td><td> ASOLO pH a 7,4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l </td></tr><tr><td> Paraformaldeide 4% </td><td> Fluka / chemika </td><td> 76240 </td><td> 4 g PFA in 80 ml di PBS / DEPC. Riscaldare a 65 ° C fino alla PFA dissolve. Aggiungere 20 ml di PBS, lasciare che la soluzione si raffreddi. Regolare il pH a 7,4. Filtro. Conservare in aliquote a -20 ° C. </td></tr><tr><td> Paraformaldeide al 4% / acido acetico al 5% </td><td></td><td></td><td> 950 microlitri paraformaldhyde + 50 microlitri di acido acetico </td></tr><tr><td> Pepsina </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> P7000 </td><td></td></tr><tr><td> Perossidasi-coniugato anti-biotina </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> RBC-wash media: RPMI 1640 soluzione Glutammina </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 ml RPMI 1640 5 ml soluzione glutammina </td></tr><tr><td> RBC-wash media: Gentamicina solfato </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> 2,5 ml di gentamicina solfato </td></tr><tr><td> RNasi </td><td> Sigma / Aldrich </td><td></td><td> Fai un 10 mg / ml di soluzione concentrata. </td></tr><tr><td> RNasi libero 1,5 ml tubo </td><td> Ambion </td><td> AM12450 </td><td></td></tr><tr><td> RNasi Zap </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td><td></td></tr><tr><td> Slides 4 pozzetti 11 millimetri </td><td> Thermo Scientific </td><td> MENZXER306W </td><td></td></tr><tr><td> SSC 20x: NaCl </td><td> Sigma / AlAldrich </td><td> S9625 </td><td> 3 M NaCl (175 g / l) 0,3 M Na 3 citrato x H 2 O (88 g / l) Regolare il pH a 7,0 con HCl 1M </td></tr><tr><td> SSC 20x: citrato di sodio diidrato </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> W302600 </td><td> 3 M NaCl (175 g / l) 0,3 M Na 3 citrato x H 2 O (88 g / l) Regolare il pH a 7,0 con HCl 1M </td></tr><tr><td> SSPE 20x: NaCl </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 175,3 g NaCl </td></tr><tr><td> SSPE 20x: NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> S0751 </td><td> 27,6 g di NaH 2 PO 4. </td></tr><tr><td> SSPE 20x: 4 EDTA in polvere </td><td></td><td></td><td> 9,4 g di polvere EDTA Aggiungere acqua DEPC, correggere il pH 7.4. Autospaccò per 20 min </td></tr><tr><td> TNB buffer: buffer di TNT </td><td></td><td></td><td> 10 ml tampone TNT </td></tr><tr><td> TNB buffer: reagente di blocco </td><td></td><td></td><td> 0,05 g di reagente di blocco Per sciogliere il reagente bloccante, riscaldare la soluzione a 60 ° C per un&#39;ora sotto agitazione. Conservare a -20 ° C. (Derivato dalla Perkin Elmer TSA-protocollo.) </td></tr><tr><td> TNT tampone: Tris / HCl </td><td> Sigma </td><td> T1503 </td><td> 1M Tris / HCl, pH 8,0 </td></tr><tr><td> TNT buffer: NaCl </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S9625 </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td> TNT buffer: Tween20 </td><td> Sigma </td><td> 93773 </td><td> 5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH 2 O869 Ml Portare il pH a 7,5 a temperatura ambiente. (Derivato dalla Perkin Elmer TSA-protocollo.) </td></tr><tr><td> TSA più Cyanine3 / fluoresceina sistema </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEL753000IKT </td><td> Leggi il protocollo dal TSA Plus System Palette fluorescenza con attenzione prima di iniziare l&#39;esperimento. </td></tr><tr><td> Tubi 14 ml sterile </td><td> Almeco - CM Aps LAB </td><td> 91016 </td><td></td></tr></tbody></table>

analisi di single-cell trascrizione del gene per l&#39;rna fluorescente<em&gt; in situ</em&gt; ibridazione (fish)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adesione di Plasmodium falciparum eritrociti infetti (IE) per recettori umani endoteliali durante la malaria è mediato dall&#39;espressione di PfEMP1 varianti proteiche codificate dai geni var. Il aploide P. falciparum genoma ospita circa 60 differenti geni var di cui uno solo è creduto per essere trascritto per cella alla volta durante la fase di sangue dell&#39;infezione. Come tale regolamentazione si escludono a vicenda della trascrizione genica var si ottiene non è chiaro, così come l&#39;identificazione di singoli geni var o sotto-gruppi di geni associati con var diversi recettori e la conseguenza del legame differenziale sui risultati clinici di P. falciparum infezioni. Di recente, il paradigma trascrizione si escludono a vicenda è stata messa in dubbio da saggi di trascrizione sulla base di singoli P. falciparum identificazione trascrizione in inf singoloected cellule eritrocitari utilizzando RNA ibridazione fluorescente in situ (FISH) Analisi della trascrizione genica var dal parassita in singoli nuclei di P. falciparum IE 1. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per effettuare la RNA-FISH metodologia di analisi della trascrizione genica var in single-nuclei di P. falciparum infettato eritrociti umani. Il metodo si basa sull&#39;uso di digossigenina e biotina marcato con sonde di RNA antisenso utilizzando il sistema TSA Plus. Fluorescence Palette 2 (Perkin Elmer), analisi al microscopio e appena selezionato P. falciparum IE. Il metodo in situ può essere utilizzato per monitorare la trascrizione e la regolazione di una varietà di geni espressi durante le diverse fasi del P. ciclo di vita falciparum ed è adattabile ad altre specie parassita della malaria e di altri organismi e tipi di cellule.

La figura 1 illustra un diagramma di flusso delle fasi principali e la durata dell&#39;impulso del metodo FISH RNA. Una serie di immagini rappresentative di bene e male esperimenti mRNA conservati colorate FISH utilizzando una singola P. falciparum IE sono mostrati in Figura 2. Questo protozoo intracellulare ha una piccola (1-1,5 micron di diametro), nucleo che è di colore blu con DAPI. Ventiquattro ore dopo l&#39;invasione degli eritrociti in P...

Fluorescente<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; (FISH) per identificare trascritti di mRNA in cellule singole consente analisi dell&#39;attività poligenici come la trascrizione simultanea di più di un membro della<em&gt; Var</em&gt; Multigene famiglia in<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Eritrociti infetti<sup&gt; 1</sup&gt;. La tecnica è adattabile e può essere utilizzato su diversi tipi di geni, cellule e organismi.

Analisi di Single-cell trascrizione del gene per l&#39;RNA fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione (FISH)

L'adesione degli eritrociti infetti (IE) da Plasmodium falciparum ai recettori endoteliali umani durante le infezioni malariche è mediata dall'espressione di varianti della proteina PfEMP1 codificate dai geni var. Il genoma aploide di P. falciparum ospita circa 60 geni var differenti, di cui si riteneva che solo uno venisse trascritto per cellula alla volta durante lo stadio ematico dell'infezione. Non è chiaro come venga raggiunta tale regolazione mutuamente esclusiva della trascrizione dei geni var, né l'identificazione dei singoli geni var o di sottogruppi di geni var associati a diversi recettori e la conseguenza del legame differenziale sull'esito clinico delle infezioni da P. falciparum. Recentemente, il paradigma della trascrizione mutuamente esclusiva è stato messo in discussione da saggi di trascrizione basati sull'identificazione di singoli trascritti di P. falciparum in singole cellule eritrocitarie infette, utilizzando l'analisi di ibridazione in situ fluorescente (FISH) dell'RNA della trascrizione dei geni var da parte del parassita nei singoli nuclei di IE di P. falciparum. In questo lavoro, presentiamo un protocollo dettagliato per l'esecuzione della metodologia RNA-FISH per l'analisi della trascrizione dei geni var nei singoli nuclei di eritrociti umani infetti da P. falciparum. Il metodo si basa sull'impiego di sonde a RNA antisense marcate con digossigenina e biotina utilizzando il sistema TSA Plus Fluorescence Palette (Perkin Elmer), analisi microscopiche e IE di P. falciparum selezionati di fresco. Il metodo di ibridazione in situ può essere utilizzato per monitorare la trascrizione e la regolazione di una varietà di geni espressi durante le diverse fasi del ciclo vitale di P. falciparum ed è adattabile ad altre specie di parassiti della malaria cũng come ad altri organismi e tipi cellulari.

Il mio nome è Elena Rand e lavoro presso il Centro di Patologia Medica dell'Università di Copenhagen in Danimarca. Qui, circa 60 persone provenienti da varie parti del mondo lavorano sulle malaria. Il nostro gruppo si occupa di plasmodium foci, parassiti.Sono i più virulenti tra quelli che causano la malattia della malaria nell'uomo. I foci della camera esprimono proteine di superficie che svolgono varie funzioni, come l'adesione alle cellule dell'ospite. Il gruppo più ampio di proteine adesive è costituito dalla cosiddetta proteina della membrana eritrocitaria di *Plasmodium falciparum* uno, nota come PfEMP1.Esistono almeno 60 varianti delle quali si riteneva che solo una fosse trascritta per cellula contemporaneamente durante la fase ematica dell'infezione. Nel nostro dipartimento riteniamo che più di una proteina possa essere trascritta contemporaneamente nei parassiti. Un metodo per rilevare tale attività è l'ibridazione fluorescente di mRNA mediante tecnica FISH.Di seguito presentiamo un metodo personalizzato per la rilevazione di mRNA, trascritti di due geni diversi, all'interno di un singolo nucleo di eritrociti infettati da odum FCI. Il metodo richiede due giorni per essere completato. Il primo giorno prevede la preparazione delle sonde di RNA, il loro aggiunta ai parassiti fissati su vetrini e l'ibridazione su bagnomaria.Il secondo giorno prevede la congregazione degli anticorpi, l'amplificazione del fluorocromo e la visualizzazione dei parassiti colorati al microscopio confocale. Per fornire una panoramica dell'esperimento, viene mostrato un diagramma di flusso delle operazioni e dei reagenti e materiali critici utilizzati nell'esperimento. Kit di etichettatura RNAs zap dig biotina, mix di etichettatura per RNA, paraformaldeide, acido acetico glaciale, anticorpo pepin anti-dig, anticorpo anti-biotina, sistema di paletta fluorescente TSA PL plus, DPI RNAs, microtubi liberi, etanolo ETH, vetrini in vetro puliti, coprioggetti sterilizzati, strumenti sterili come forbici e pinzette, un barattolo di vetro per accoppiamento.È necessario esaminare gli eritrociti infetti mediante microscopia ottica per assicurarsi che si trovino nella corretta fase di sviluppo, vale a dire le forme a anello dei gametociti in sincronia e in buone condizioni. È fondamentale scegliere con precisione la fase dello sviluppo del ciclo vitale in cui avviene la trascrizione.Poiché le singole specie di RNA sono stazionate, trascritte in modo specifico e degradate rapidamente, le cellule devono essere lavate delicatamente prima di preparare ottimi preparati ematici sottili su vetrini puliti; quindi uno strato monomolecolare uniforme di globuli rossi infetti viene fissato su vetrino in una soluzione al 4% di paraformaldeide e al 5% di acido acetico glaciale per 10 minuti. Successivamente, i vetrini vengono lavati due volte in PBS; rimuovere delicatamente il liquido dai vetrini con carta assorbente. Quindi permeabilizzare le cellule con una soluzione pre-riscaldata di acido cloridrico 10 millimolare prima di aggiungere il Pepsi.Incubare questo a 37 gradi centigradi per due minuti prima dell'ibridazione. I sonde vengono denaturate a 65 gradi centigradi per cinque minuti, quindi rapidamente raffreddate su ghiaccio e successivamente aggiunte alle cellule, che ora sono fissate sul vetrino. Posizionare un coprioggetto sopra le cellule ed eliminare eventuali bolle d'aria utilizzando la punta di una pipetta piccola. Umidificare la camera di ibridazione aggiungendo gocce di acqua distillata doppia alla periferia della camera in modo che i vetrini rimangano umidi all'interno della camera.Durante la procedura di ibridazione, inserire i vetrini nella camera e lasciarli ibridare per tutta la notte a 48 gradi centigradi. Dopo 16-17 ore di ibridazione, i vetrini vengono rimossi con attenzione dalla camera di ibridazione. A partire da questo passaggio, non è più strettamente necessario un ambiente privo di RNAsi.Lavare i vetrini in un barattolo di vetro riempito con tampone TNT, assicurandosi che le lamelle si stacchino dal vetrino. Ripetere la procedura di lavaggio tre volte, quindi bloccarli nel tampone TNB per mezz'ora. Aggiungere agli anticorpi le cellule con anti-dig o anti-biotina marcati con HRP.Entrambi i tipi di anticorpi marcati possono essere aggiunti contemporaneamente. Se l'esperimento ha lo scopo di rilevare due trascritti di mRNA nelle cellule, gli anticorpi devono essere pre-diluiti. Incubare in tampone TNB per una o due ore, lavare tre volte in tampone TNT, quindi aggiungere un fluorocromo alle cellule lavate, un FSE diluito o il ciano.È necessario preparare fresche tre soluzioni. A partire da questo passaggio, è importante non esporre direttamente le lamelle a luce intensa. Incubare le lamelle di vetro per 10-15 minuti con il fluorocromo.Se si rilevano due trascritti di mRNA dopo la prima incubazione, rimuovere il primo colorante con lavaggi e aggiungere il secondo. Eseguire un lavaggio finale in Buffer TNT. Immergere i vetrini in acqua distillata doppia prima di farli asciugare all'aria.Aggiungere il tampone e posizionare un'immersione sopra il vetrino. Rimuovere eventuali bolle d'aria e sigillare i bordi del coprioggetto con uno smalto o vernice per unghie a rapida essiccazione. Qui osserviamo un singolo eritrocita infetto contenente un parassita.Il blu, il DPE rappresenta il DNA del parassita, e il verde rappresenta l'mRNA di un gene in fase di trascrizione. Nell'altra immagine, il colore rosso rappresenta l'mRNA di un altro gene, e nella terza immagine è possibile osservare la doppia colorazione di entrambe le trascrizioni geniche. Le immagini rivelano inoltre che gli mRNA associati sono sovrapposti al DNA nucleare e non si trovano generalmente al di sopra o accanto ad esso.Nel 99% dei eritrociti infetti, possiamo rilevare l'mRNA di due geni in fase di trascrizione. Un aspetto importante di questo esperimento è verificare che le sonde non si appaiano ad altri geni. In questa immagine, abbiamo incubato gli eritrociti infetti con entrambe le sonde, ma solo una sonda è un IE in fase di trascrizione. Gli altri geni non vengono trascritti in questo caso.Questa situazione si inverte in queste altre immagini degli eritrociti infetti visualizzati. I parassiti di odium phos palm presentano generalmente membrane ben preservate con una colorazione ben definita sia del DNA che dell'RNA. Se le cellule sono di scarsa qualità per qualche motivo, anche la colorazione risulterà scadente.Come mostrato in questa immagine, il DNA e l'RNA appariranno diffusi, torbidi e relativamente non definiti. In conclusione, si può affermare che questo metodo può essere facilmente applicato ad altri parassiti trasmessi dal sangue. I nostri dati di trascrizione sono stati inoltre confermati da esperimenti volti a rilevare le proteine tradotte dagli mRNA analizzati, utilizzando anticorpi specifici diretti contro le proteine pf EMP1 espresse sulla superficie delle cellule infette.

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