Name: Proteine ciclica Amplificazione misfolding di prioni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Impara la tecnica PMCA per amplificare ceppi prionici adattati al criceto in vitro. Questo metodo consente di studiare la conversione prionica e sviluppare saggi di rilevazione affidabili.

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Vorremmo ringraziare il Dott. Vesper Fe Marie Ramos per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Center for Research Resources (P20 RR0115635-6, C06-01 e RR17417 G20RR024001) e l&#39;Istituto Nazionale per la Neurological Disorder and Stroke (2R01 NS052609).

1. Preparazione dell&#39;apparecchiatura <ol><li> Utilizzare un 3000 Misonix o Misonix 4000 sonicatore (Farmingdale, NY) collegato ad un bagno di Thermo Electron Neslab EX-7 acqua (Newington, NH) per mantenere una temperatura costante di 37 ° C. Sonicare i campioni in 200 ml a pareti sottili strisce di provette PCR con tappi a cupola ottenuti da Thermo Scientific (Waltham, MA). </li><li> Un sonicatore nuovo richiede un periodo di &quot;rodaggio&quot; di funzionamento continuo 9. A due mesi il periodo di rodaggio è costituito da un 40-secondo scoppio sonicazione e 10 minuti cicli di incubazione con il livello di ampiezza impostato su 10. Si dovrebbero osservare erosione tutta la superficie della micropiastra titanio tromba (figura 1, pannello B). L&#39;acqua che circola sarà bianca, torbida, a causa dell&#39;erosione della micropiastra titanio corno. Sostituire questa acqua al giorno. </li><li> L&#39;amplificazione di PrP Sc varierà in tutto il corno micropiastra. La migliore efficienza di amplificazione PrP Sc può essere ottenuto entroun raggio di 5 cm dal centro del corno micropiastra (vedi figura 1, pannello C). </li><li> Un giro di PMCA consiste 144 cicli. Ogni ciclo è composto di 5 sonicazione secondi e 10 minuti di incubazione. Ciò richiederà a circa 24 ore per ogni turno di PMCA. </li><li> La potenza della sonicazione, visualizzata sul pannello di controllo del sonicatore, la varia con il numero di provette PCR presenti nel rack del sonicatore e la temperatura dell&#39;acqua circolante dal bagno. Garantire che l&#39;acqua è equilibrata a 37 ° C, e non riempire più del 30% del portaprovette del sonicatore (figura 1, pannello C). Allargare le provette PCR tramite la sirena micropiastra. Avere almeno una fila di spazio vuoto tra le strisce di provette PCR e permettono non più di quattro tubi collegati insieme per striscia (figura 1, pannello C). </li><li> La forza di sonicazione è fondamentale per una amplificazione di successo ceppo prione. Mentre sonicating, regolare l&#39;ampiezza di avere una potenzacompresa tra 155 ~ 170 watt. Nel nostro laboratorio il livello di potenza è impostato su sei e sette per il 3000 Misonix Misonix e 4000, rispettivamente. </li><li> Usare acqua distillata nel bagno d&#39;acqua per evitare l&#39;accumulo di macchie d&#39;acqua dura. Sostituire questo settimanale acqua. Durante i cicli di incubazione e sonicazione, condensa si verifica all&#39;interno del coperchio corno micropiastra. Per evitare la formazione di condensa, allegare un piccolo pad termico acquario all&#39;inizio della scatola contenitore del sonicatore come mostrato in figura 1, il pannello A. </li></ol> 2. Preparazione dei campioni <ol><li> Tutte le procedure che coinvolgono animali sono state approvate dal Animal Care Università Creighton istituzionale e uso Comitato e rispettare la Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio. Prima di qualsiasi raccolta del tessuto, l&#39;animale deve essere anestetizzati e perfusi con transcardiaca ghiacciata fosfato soluzione salina tamponata con 5 mM EDTA a pH 7,4 per rimuovere il sangue dal cervello ed evitare l&#39;inibizione dellaReazione PMCA di sangue 7. Raccogliere tessuti animali rapidamente usando tecniche asettiche e dispongono di strumenti di dissezione dedicati per ogni ceppo del prione. Dopo la dissezione, posizionare il tessuto in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, flash congelare il ghiaccio secco, e conservarlo a -80 ° C fino omogeneizzazione. </li><li> Per preparare il substrato PMCA (PrP C) soluzione, omogeneizzare un cervello infetto criceto (ONU BH) per un 10% peso / volume (w / v) con soluzione di tampone ghiacciato di conversione (vedere parte 3) utilizzando una mola tessuto Tenbroeck. Mentre omogeneizzazione, fare attenzione a non far entrare aria all&#39;interno della smerigliatrice per evitare eccessiva formazione di schiuma della soluzione. Chiarire la soluzione per centrifugazione a 500 xg per 30 sec e un&#39;aliquota del surnatante in provette per microcentrifuga 1,5 ml. Conservare a -80 ° C fino ad ulteriore utilizzo. </li><li> Per preparare il seme PMCA (PrP Sc) soluzione, omogeneizzare un materiale infettivo (linfonodi cervello, milza, altri tessuti, o suolo contaminato) ad un 10% w / v soluzione con wate ghiacciatar e aliquota della soluzione in 0,6 ml microprovette. Conservare a -80 ° C fino ad ulteriore utilizzo. </li></ol> 3. Preparazione del buffer di conversione <ol><li> Pesare 0,5093 g di Triton X-100 in un pallone tarato da 50 ml (risultato una concentrazione finale di 1% Triton X-100) (Sigma-Aldrich GmbH, Steinheim, Germania). </li><li> Aggiungere un completo proteasi Tablet (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germania). </li><li> Aggiungere 0,0931 g di EDTA (questo si tradurrà in una concentrazione finale di 5 mM EDTA) (Mallinckrodt Baker Inc., Phillipsburg, NJ). </li><li> Regolare il pH a 7,4 con NaOH 1N. </li><li> Regolare il volume di 50 ml con fosfato di Dulbecco Buffered Saline (DPBS) (Mediatech Inc., Manassas, VA). </li><li> Filtrare la soluzione attraverso membrana da 0,45 micron nitrocellulosa con un apparato di filtrazione sotto vuoto. Il buffer di conversione può essere conservato a 4 ° C per non più di un mese. </li></ol> 4. L&#39;amplificazione dei ceppi di prioni tramite PMCA <ol><li>Diluire il seme PMCA nel substrato PMCA con un rapporto di 01:20 (mix ossia 5 microlitri del seme PMCA e 95 pl di substrato PMCA) in una provetta PCR. Rimuovere e conservare una aliquota 15 microlitri a -80 ° C per il controllo unsonicated; questo controllo unsonicated verrà utilizzato per quantificare l&#39;amplificazione PrP Sc via proteinasi K (PK) digestione seguita da Western blot (WB) analisi. Un ulteriore controllo unsonicated potrebbe essere generato ponendo una seconda aliquota di 15 microlitri a 37 ° C per tutta la durata della reazione PMCA. Un minimo di tre ripetizioni è richiesto per fini statistici. </li><li> Oggetto del resto del campione (70 microlitri) di un ciclo di PMCA come rappresentato in figura 1, pannello A. Agitare tubi ogni 5 ore per evitare la formazione di condensa sul coperchio a cupola del tubo PCR. </li><li> Provette del campione deve essere centrifugati e delicatamente vortex (facendo attenzione che la soluzione non vanno nel tappo a cupola) prima di aprire dopo ogni intervento per garantire la omogenizzazioneeneity ed evitare potenziali contaminazioni. </li><li> Per seriale PMCA (sPMCA) di ceppi brevi periodo di incubazione (cioè HY TME, HaCWD o 263K), diluire il materiale sonicata in un rapporto di 01:20 trasferendo 5 microlitri del campione da sonicato rotonda in 95 pl di uninfected fresca omogenato cerebrale (Figura 2, pannello B). </li><li> Per sPMCA di ceppi lungo periodo di incubazione (cioè DY TME, 139H, 22CH, 22AH, o ME7H), diluire il materiale sonicata in un rapporto di 1:1, trasferendo 50 microlitri del campione da sonicato rotonda in 50 pl di uninfected fresca omogenato cerebrale (Figura 2, pannello B). </li><li> Rimuovere due aliquote da 15 pl della miscela precedentemente diluito con ultrasuoni (passi da 4,4 o 4,5) e memorizzare uno di loro a -80 ° C e l&#39;altro a 37 ° C (soluzioni di controllo unsonicated per PMCA round). Sottoporre i resti di un giro PMCA due. </li><li> Questa procedura può essere ripetuta indefinitamente. Nel nostro laboratorio, abbiamohanno effettuato fino a quindici giri PMCA, con le proprietà di deformazione è rimasto immodificato. </li><li> PK digerire i campioni. Per una tipica WB, mescolare 5 ml di PK 80 ug / ml a 5 l di campione (questa soluzione avrà una concentrazione finale di PK 40 mcg / ml) e incubare a 37 ° C per un&#39;ora. Aggiungere 10 ml di tampone di gel carico. Bollire questa soluzione per 10 min. Lasciate raffreddare la soluzione e caricare 10 microlitri nel gel. </li><li> Per calcolare il successo di amplificazione eseguire un&#39;analisi WB sulle PK-digerito campioni per stimare la quantità di amplificato PrP Sc confrontandole con uno, i controlli unsonicated 20,21 Figura 2, Pannello C o in valori di PK-digerito ricombinante PrP. </li></ol> 5. Evitare contaminazione incrociata Passaggi critici devono essere prese per ridurre al minimo la contaminazione incrociata e l&#39;insorgenza di falsi positivi dovuti alla formazione de novo di prodotti resistenti proteasi. </p&gt; <ol><li> Utilizzare un set dedicato di strumenti di dissezione (cioè pinze, pinzette, forbici) per la raccolta del campione per ogni ceppo del prione. </li><li> Prima di omogeneizzazione cervelli infetti da utilizzare come substrato PMCA, pulire le pipette con 1% di candeggina. Immergere il sonicatore di portaprovette PCR, omogeneizzatori tessuti, PCR e scaffalature di stoccaggio tubo con 1% di candeggina per 10 minuti e risciacquare abbondantemente con acqua distillata. </li><li> Coprire l&#39;area di lavoro con una nuova Versi-Dry Soaker Lab ogni volta che un nuovo campione deve essere omogeneizzato, un nuovo esperimento PMCA deve essere preparata, o quando aliquotandolo tra un round sPMCA. </li><li> Utilizzare guanti nuovi di volta in volta nuovi campioni sono trattati (in particolare durante il trasferimento di aliquote tra un round sPMCA). </li><li> Utilizzare raffiche brevi sonicazione per ogni ciclo PMCA. Cicli su 5 sonicazione sec combinata con 10 minuti di incubazione è sufficiente per amplificare prioni senza generare de novo PrPSc 1,20,21,23,24. Come altri laboratori hanno mostrato, aumentando latempo di sonicazione, aumentando l&#39;ampiezza sonicazione, e aumentando il numero di cicli PMCA aumenta la probabilità di PrP Sc de novo formazione 2. </li></ol>

<ol><li>Ayers, J. I., Schutt, C. R., Shikiya, R. A., Aguzzi, A., Kincaid, A. E., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+strain-encoded+relationship+between+PrP+replication%2C+stability+and+processing+in+neurons+is+predictive+of+the+incubation+period+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">The strain-encoded relationship between PrP replication, stability and processing in neurons is predictive of the incubation period of disease.</a> PLoS pathogens. 7, e1001317(2011).</li>
<li>Barria, M. A., Mukherjee, A., Gonzalez-Romero, D., Morales, R., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+generation+of+infectious+prions+in+vitro+produces+a+new+disease+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">De novo generation of infectious prions in vitro produces a new disease phenotype.</a> PLoS Pathog. 5, e1000421(2009).</li>
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<li>Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+distribution+of+transmissible+mink+encephalopathy+virus+in+mink+inoculated+subcutaneously%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Temporal distribution of transmissible mink encephalopathy virus in mink inoculated subcutaneously.</a> J. Virol. 61, 3235-3240 (1987).</li>
<li>Kocisko, D. A., Come, J. H., Priola, S. A., Chesebro, B., Raymond, G. J., Lansbury, P. T., Caughey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+formation+of+protease-resistant+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-free formation of protease-resistant prion protein.</a> Nature. 370, 471-474 (1994).</li>
<li>Kurt, T. D., Telling, G. C., Zabel, M. D., Hoover, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-species+amplification+of+PrP%28CWD%29+and+correlation+with+rigid+loop+170N%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Trans-species amplification of PrP(CWD) and correlation with rigid loop 170N.</a> Virology. 387, 3235-3240 (2009).</li>
<li>Maddison, B. C., Baker, C. A., Terry, L. A., Bellworthy, S. J., Thorne, L., Rees, H. C., Gough, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+sources+of+scrapie+prions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Environmental sources of scrapie prions.</a> J. Virol. 84, 11560-11562 (2010).</li>
<li>Nichols, T. A., Pulford, B., Wyckoff, A. C., Meyerett, C., Michel, B., Gertig, K., Hoover, E. A., Jewell, J. E., Telling, G. C., Zabel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protease-resistant+cervid+prion+protein+in+water+from+a+CWD-endemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Detection of protease-resistant cervid prion protein in water from a CWD-endemic area.</a> Prion. 3, 171-183 (2009).</li>
<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+proteinaceous+infectious+particles+cause+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie.</a> Science. 216, 136-144 (1982).</li>
<li>Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+detection+of+pathological+prion+protein+by+cyclic+amplification+of+protein+misfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding.</a> Nature. 411, 810-813 (2001).</li>
<li>Saunders, S. E., Bartz, J. C., Vercauteren, K. C., Bartelt-Hunt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzymatic+treatment+of+soil-bound+prions+effectively+inhibits+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An enzymatic treatment of soil-bound prions effectively inhibits replication.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 4313-4317 (2011).</li>
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<li>Schutt, C. R., Bartz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+interference+with+multiple+prion+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Prion interference with multiple prion isolates.</a> Prion. 2, 61-63 (2008).</li>
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<li>Weber, P., Giese, A., Piening, N., Mitteregger, G., Thomzig, A., Beekes, M., Kretzschmar, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genuine+prion+infectivity+by+serial+PMCA%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+microbiology%22%5BJournal%5D)">Generation of genuine prion infectivity by serial PMCA.</a> Veterinary microbiology. 123, 346-357 (2007).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Le sfide di amplificazione proteine ​​prioniche infettive sono i periodi di incubazione lunghi e le spese in esperimenti in vivo. La tecnica PMCA è una soluzione economica per amplificare agenti prioni infettivi. Diversi laboratori hanno confermato la capacità di PMCA di amplificare accuratamente ceppi di prioni in vitro 7, 9, 12, 14, 19,24. Malattie da prioni possono essere trasmessi tra le specie. Bessen e Marsh sono effettivamente inoculato criceti co...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente / attrezzature </td><td> Fabbricante </td><td> Cat. Numero </td></tr><tr><td> Misonix 3000 </td><td> Misonix </td><td> S-3000 </td></tr><tr><td> Misonix 4000 </td><td> Misonix </td><td> S-4000 </td></tr><tr><td> Tenbroeck Tissue Grinder </td><td> Kontes </td><td> 885000-0007 </td></tr><tr><td> Neslab Bagno EX-7 Acqua </td><td> Thermo Electron </td><td> Neslab EX-7 </td></tr><tr><td> PCR da 0,2 ml tubo strisce </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0451 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T9284-100ML </td></tr><tr><td> Proteasi completo </td><td> Roche </td><td> 11 697 498 001 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> JT Baker </td><td> 4040-00 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Mallinckrodt Baker Mediatech </td><td> 21-031-CV </td></tr><tr><td> Versi-Dry Lab Soakers </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 206 28 </td></tr><tr><td> Repti Therm Riscaldatore </td><td> Zoo Med Laboratories, Inc. </td><td> RH-4 </td></tr></tbody></table>

proteine ​​ciclica amplificazione misfolding di prioni

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

I prioni sono gli agenti infettivi che causano l&#39;encefalopatia inevitabilmente fatale spongiforme trasmissibile (TSE) negli animali e nell&#39;uomo 9,18. La proteina prionica ha due isoforme distinte, non infettiva ospitante proteina codificata (PrP C) e la proteina infettiva (PrP Sc), una isoforma anormalmente piegato PrP-C 8. Una delle sfide di lavorare con agenti prioni è il lungo periodo di incubazione prima dello sviluppo dei sintomi clinici dopo l&#39;inoculazione ospite 13. Questo mandato tradizionalmente lunghi e costosi studi di saggi biologici animali. Inoltre, le proprietà biochimiche e biofisiche di PrP Sc sono poco caratterizzati per la loro particolare conformazione e gli stati di aggregazione. PrPSc può seme della conversione della PrP C e PrP Sc in vitro 14. PMCA è una tecnica in vitro che prende ADVAntage di questa capacità con cicli di sonicazione e di incubazione per la produzione di grandi quantità di PrP Sc, ad un ritmo accelerato, da un sistema che contiene una quantità eccessiva di PrP C e piccole quantità di seme PrP Sc 19. Questa tecnica ha dimostrato di ricapitolare in modo efficace la specificità di specie e la tensione di PrP Sc conversione da PrP C, per emulare ceppo interferenze prioni, e di amplificare livelli molto bassi di PrP Sc da tessuti infetti, fluidi, e campioni ambientali 6,7,16, 23. Questa carta dettagli del protocollo di PMCA, comprese le raccomandazioni per minimizzare la contaminazione, la generazione di risultati coerenti, e quantificare tali risultati. Discutiamo anche diverse applicazioni PMCA, compresa la produzione e la caratterizzazione dei ceppi di prioni infettivi, ceppo interferenza prione, e l&#39;individuazione dei prioni nell&#39;ambiente.

Misfolding amplificazione proteina ciclica (PMCA) è utilizzato per amplificare PrP Sc in vitro 7, 12, 14, 19, 24. Un successo PrP Sc amplificazione è indicato da un aumento di intensità banda su Western blot della PK-resistente proteina prionica (migrazione tra 19 e 30 kDa per criceto derivati ​​ceppi di prioni) come mostrato in Figura 3. L&#39;aumento della sua intensità band dopo PMCA indica amplificazione del PK-materiale resistente PrPSc. Avvenuta...

Misfolding amplificazione proteina ciclica (PMCA) è un test in vitro per lo studio della conversione prionica e barriere deformazione e specie. Può anche essere usato come un test di rilevazione prione.

Proteine ​​ciclica Amplificazione misfolding di prioni

I prioni sono agenti infettivi che causano l'inevitabilmente fatale encefalopatia spongiforme trasmissibile (TSE) negli animali e negli esseri umani9,18. La proteina prionica ...

Lo scopo di questa procedura è amplificare con successo in vitro ceppi di PreOn adattati al criceto. Questo viene ottenuto innanzitutto omogeneizzando il cervello di criceto non infetto da utilizzare come substrato, quindi preparando il tessuto infetto da utilizzare come innesco. Il secondo passaggio consiste nel mescolare il substrato e l'innesco in provette per PCR, quindi eseguire l'amplificazione ciclica della proteina malripiegata o PMCA mediante cicli di sonicazione e incubazione.Successivamente, il materiale amplificato viene diluito con substrato fresco ed amplificato in serie in vitro, quindi si esegue la PMCA. Infine, i campioni vengono digeriti con proteinasi K e analizzati mediante western blot. In definitiva, l'aumento dell'intensità della banda nel western blot può essere utilizzato per determinare l'amplificazione in vitro del ceppo di prione.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della PreOn, ad esempio quali sono i cofattori importanti coinvolti nell'amplificazione della PreOn? Generalmente, chi si approccia per la prima volta a questo metodo incontra difficoltà in piccoli ma importanti dettagli della tecnica, nonché nella prevenzione della contaminazione incrociata tra campioni. Prima dell'omogeneizzazione, pulire le pipette con candeggina al 1%, saturare con candeggina il porta provette PCR, i dispositivi per l'omogeneizzazione tissutale e i porta provette per la conservazione dei campioni PCR.Dopo 10 minuti, risciacquare accuratamente ogni pezzo di attrezzatura con acqua distillata, quindi coprire l'area di lavoro con un nuovo tappetino assorbente Verly dry lab Soaker. Utilizzare ora un omogeneizzatore tissutale da 10 buric e un buffer di conversione appena preparato e ghiacciato per omogeneizzare un cervello di criceto non infetto fino a ottenere una soluzione al 10% peso/volume. Per utilizzi successivi la soluzione substrato PMCA, trasferire l'omogeneato in provette coniche da 15 millilitri e chiarificare la soluzione omogeneizzata mediante centrifugazione a 500 ×g per 30 secondi.Successivamente, avendo cura di evitare l'aliquota del pellet di grandi dimensioni, trasferire il surnatante risultante in provette microcentrifuga da 1,5 millilitro. Per preparare la soluzione di seme per la PMCA, omogeneizzare il materiale infettivo raccolto fino a ottenere una soluzione al 10% peso/volume come appena illustrato, ma utilizzando soluzione salina tamponata al fosfato di Daros o DPBS invece del buffer di conversione, quindi aliquotare la soluzione in provette microcentrifuga da 0,6 millilitro. Prima di iniziare la procedura di amplificazione, coprire l'area di lavoro con un panno da laboratorio asciutto e pulito, aggiungere il substrato PMCA a una striscia di tubi PCR da 200 microlitro con pareti sottili e diluire il seme PMCA in un rapporto di uno a 20; preparare un totale di quattro replicati in provette contrassegnate con etichetta rossa.Posizionare due replicati di un'aliquote da 15 microlitri di ciascun campione in provette PCR etichettate in blu da utilizzare come controllo non sottoposto a trattamento a meno 80 gradi Celsius. Posizionare altri due replicati di un'aliquote da 15 microlitri di ciascun campione in provette PCR da conservare a 37 gradi Celsius come ulteriore controllo non sottoposto a trattamento. Successivamente, inserire i controlli non sottoposti a trattamento a meno 80 gradi Celsius in un congelatore a meno 80 gradi Celsius e posizionare gli altri controlli non sottoposti a trattamento in un incubatore a 37 gradi Celsius per tutta la durata della reazione PMCA.Ora iniziare il primo ciclo di amplificazione PMCA posizionando la striscia di tubi PCR contenente i restanti 70 microlitri di ogni campione in un sonicator collegato a un bagno a circolazione d'acqua impostato a una temperatura costante di 37 gradi Celsius. Un tubo PCR contenente solo il substrato PMCA può essere incluso come controllo fittizio per verificare la contaminazione incrociata, riempiendo non più del 30% dei tubi del sonicator distribuendo uniformemente i tubi PCR nell'alveolo della micropiastra. Lasciare almeno una fila di spazio vuoto tra le strisce di tubi PCR e non collegare più di quattro tubi per striscia.L'amplificazione di P-R-P-S-C varia in tutta la piastra microformato. L'efficienza massima di amplificazione di P-R-P-S-C si ottiene entro un raggio di cinque centimetri dal centro della piastra microformato. Un ciclo di PMCA consiste in 144 cicli, ciascuno con cinque secondi di sonificazione e dieci minuti di incubazione, per una durata di circa 24 ore per ogni ciclo di PMCA; durante l'esecuzione, regolare l'ampiezza in modo da ottenere una potenza compresa tra 155 e 170 watt.Posizionare un tappetino riscaldante per acquari sul coperchio del sonicator per evitare la condensazione dell'acqua, che potrebbe causare contaminazione incrociata tra i campioni. Agitare le provette ogni cinque ore per evitare la condensazione dell'acqua sui tappi bombati delle provette PCR dopo il completamento del ciclo. Rimuovere la striscia di provette dall'ator e centrifugare i campioni.Poi vortexare delicatamente le provette, mantenendo la soluzione lontana dal tappo per evitare contaminazioni quando i tappi vengono aperti, riducendo ulteriormente il rischio di contaminazione durante l'apertura delle provette. Evitare di toccare il bordo e appoggiare il tappo su un fazzoletto Kim pulito. Successivamente, per la PMCA in serie del ceppo PreOn, trasferire cinque microlitri del campione sonificato in 95 microlitri di substrato PMCA fresco.Utilizzare guanti nuovi per ogni campione. Successivamente, prelevare due aliquote da 15 microlitri da ciascun campione sonificato e conservare un'aliquote a meno 80 gradi Celsius e l'altra a 37 gradi Celsius. Per le soluzioni di controllo non sature per il secondo giro di PMCA, sottoporre i residui a un secondo ciclo di PMCA come appena illustrato.Questo passaggio può essere ripetuto tutte le volte desiderate. Un tubo PCR contenente il substrato PMCA proveniente esclusivamente dal cervello non infetto può essere incluso per verificare la contaminazione incrociata. Dopo aver sottoposto i campioni al numero desiderato di cicli, mescolare cinque microlitri di proteinasi K a 18 microgrammi per millilitro con cinque microlitri del campione sonicato, del controllo a meno 80 gradi Celsius e del controllo a 37 gradi Celsius, in tubi PCR separati, e digerire il campione a 37 gradi Celsius per un'ora.Quindi aggiungere 10 microlitri di buffer di carico per gel al campione digerito e far bollire la soluzione per 10 minuti. Dopo che si è raffreddato, caricare 10 microlitri della miscela di campione e buffer di carico sul gel Western block. Per determinare la quantità di P-R-P-S-C amplificato, confrontare la quantità di campione digerito con proteinasi K nel blotting occidentale con i controlli non trattati o con quantità note di proteinasi.K ricombinante non digerito. P-R-P-C-P-M-C-A viene utilizzato per amplificare P-R-P-S-C in vitro; un'efficace amplificazione della proteina PreOn adattata al criceto, CWD del criceto e TME sonnolento, può essere osservata in questa analisi Western BLO confrontando le intensità delle bande prima e dopo la digestione con proteinasi K PMCA di P-R-P-S-C seguita da analisi Western BLO, che mostra una banda superiore, intermedia e inferiore corrispondenti rispettivamente alla forma di-glicolizzata, mono-glicolizzata e non glicolizzata della proteina prionica. Alcuni ceppi di PreOn possono essere differenziati in base alla loro mobilità elettroforetica.Ad esempio, esiste una differenza di migrazione di due chilodalton tra le ceppi di CWD del criceto e di TME sonnolento PreOn. Questa amplificazione ad alta fedelt&agrave; &egrave; osservata mediante una migrazione elettroforetica simile della ceppa PreOn di CWD del criceto amplificata mediante PMCA rispetto al suo corrispondente seme di CWD del criceto, cos&igrave; come per la ceppa di TME sonnolento rispetto al suo seme di TME sonnolento. Se non si verifica alcuna contaminazione incrociata o formazione de novo di P-R-P-S-C, l'analisi mediante Western blot dei campioni di controllo OFM di PMCA dovrebbe rimanere priva di segnali dopo la digestione con proteinasi K.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di pulire ogni strumento prima di utilizzare un nuovo campione, evitando così contaminazioni incrociate.

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