Un protocollo per l'identificazione di interazioni proteina-proteina Sulla base di ¹⁵ N marcatura metabolica, immunoprecipitazione, Spettrometria di massa quantitativa e di affinità di modulazione

L'obiettivo generale del seguente esperimento è identificare le proteine che interagiscono specificamente con una determinata proteina bersaglio in estratti cellulari contenenti proteine solubili e di membrana. In primo luogo, si ottiene un'etichettatura metabolica completa delle cellule di Chlamydomonas con azoto 14 e azoto 15 e si generano lisati cellulari contenenti e privi di una TP. Un passaggio opzionale di cross-linking aiuta a stabilizzare le interazioni transitorie tra proteine. Successivamente, si separano i lisati cellulari in frazioni, arricchendo le proteine insolubili e di membrana da cui la proteina bersaglio e i suoi partner specifici di interazione.

Una proteina controllo e proteine contaminanti vengono immunoprecipitate e eluite. Ora, mescolare le proteine immunoprecipitate, digerirle tre volte e analizzarle mediante spettrometria di massa in tandem con cromatografia liquida. I risultati distinguono tra partner d'interazione veri e falsi mostrando rapporti peptidici diversi tra azoto 14 e azoto 15 per le proteine che interagiscono specificamente con la proteina bersaglio e un azoto equilibrato.

Rapporti peptidici azoto 15 per la proteina bersaglio, la proteina di controllo e le proteine contaminanti. Il metodo scelto per analizzare le interazioni proteina-proteina è quello di immunoprecipitare direttamente la proteina di interesse insieme ai suoi partner d'interazione da estratti cellulari in cui entrambi sono presenti nella loro conformazione e concentrazione native.

Tuttavia, procedendo in questo modo, vengono precipitate anche proteine di contaminazione, principalmente perché interagiscono con gli anticorpi utilizzati, dato che gli spettrometri di massa moderni sono estremamente sensibili. Questi identificheranno in modo inequivocabile anche le proteine contaminanti e, di conseguenza, sarà impossibile distinguere gli artefatti dai veri partner d'interazione. Questo problema viene risolto mediante la tecnica qui mostrata, basata sull'etichettatura metabolica con 15 N, sull'immunoprecipitazione, sulla modulazione dell'affinità mediata dallo stato A TP e sulla spettrometria di massa quantitativa.

La tecnica sarà mostrata da Stefan SCH Malinger, che è un dottorando senior nel mio laboratorio. Dopo aver marcato le cellule per 10 generazioni, trasferire due aliquote di cellule di *Chlamydomonas* marcate con azoto 14 e azoto 15 in provette 4G SA, raccoglierle mediante centrifugazione, risospendere i pellet in due millilitri di tampone di lisi freddo su ghiaccio e trasferire le sospensioni in provette Falcon da 15 millilitri. Raccogliere le cellule rimanenti con un ulteriore millilitro di tampone di lisi ciascuna per ogni provetta. Aggiungere 50 microlitri di inibitore delle proteasi 25x e 12,5 microlitri di cloruro di magnesio uno molare; sottoporre i campioni a sonicazione quattro volte per 20 secondi su ghiaccio per una completa lisi cellulare, con intervalli di 22 secondi tra un ciclo e l'altro per il raffreddamento.

Preparare quattro cuscinetti di saccarosio da sei millilitri in provette con pareti sottili SW 41 TI. Applicare con attenzione l'intero volume dei lisati cellulari sui cuscinetti di saccarosio. Bilanciare con il buffer di lisi e centrifugare per separare i complessi proteici solubili dalle membrane.

Trasferire i complessi proteici solubili dalla parte superiore del gradiente in quattro provette falcon da 15 millilitri, avendo cura di evitare il trasferimento di parti del cuscino di saccarosio. Successivamente, aggiungere a ciascun campione Triton X-100 al 10% per ottenere una concentrazione finale dello 0,5%. Mescolare con attenzione e aggiungere il buffer di lisi fino a un volume totale di sette millilitri.

Per analisi SDS-PAGE e immunoblot. Mettere da parte 70 microlitri di ciascun estratto cellulare solubile in una nuova provetta conica da 1,5 millilitri e aggiungere 70 microlitri di buffer campione 2X SDS. Successivamente, scartare i cuscinetti di saccarosio dalle provette sottili per rotore SW 41 TI e aggiungere tre millilitri di buffer di lisi a ciascun pellet.

Aggiungere un millilitro di Triton X-100 al 10% per ottenere una concentrazione finale del 2%. Dopo aver disciolto ogni pellet mediante sonificazione, aggiungere il buffer di lisi fino a un volume totale di cinque millilitri e centrifugare. Come in precedenza, raccogliere le frazioni superiori dei complessi proteici di membrana in provette Falcon da 15 millilitri. Aggiungere il buffer di lisi contenente il 2% di Triton X-100 fino a un volume finale di sette millilitri.

Utilizzare 70 microlitri di questi campioni per analisi mediante elettroforesi SDS-PAGE e immunoblotting. Innanzitutto, equilibrare la proteina legata all'anticorpo. Aggiungere perle di siero con due lavaggi di quattro millilitri ciascuno di buffer di lisi, diluire fino a otto millilitri e aliquotare.

Un millilitro della sospensione in ciascuna delle otto provette falcon da 15 millilitri contenenti complessi proteici solubili o di membrana da cellule marcate con azoto 14 e azoto 15, in presenza o assenza di TP, incubare per due ore a quattro gradi Celsius su un rullo per provette per precipitare i complessi proteici. Pellettizzare le perle mediante centrifugazione, scartare i soprannatanti lasciando un piccolo volume di liquido sulla superficie delle perle per evitare contaminazioni da proteine aderenti alle pareti di plastica. Trasferire i campioni in nuove provette coniche da 1,5 millilitri per raccogliere tutte le perle residue nelle provette falcon. Aggiungere ulteriori 0,8 millilitri di buffer di lisi contenente 0,1% Triton a ciascuna provetta, vortexare delicatamente, centrifugare e trasferire il buffer con le perle residue nelle provette Eppendorf. Dopo diversi passaggi di lavaggio, centrifugare i campioni per 15 secondi a 16.100 ×g e a quattro gradi Celsius.

Rimuovere prima i soprannatanti del campione utilizzando una pipetta normale. Quindi rimuovere completamente qualsiasi residuo di soprannatante con la siringa Hamilton da 50 microlitri. Aggiungere a ciascun campione 100 microlitri di tampone di eluizione appena preparato e incubare in un termomiscelatore a 800 RPM, centrifugare i campioni per 15 secondi a 16.100 ×g e a 25 gradi Celsius.

Ora trasferire ogni sopranatante in una provetta pulita utilizzando una siringa Hamilton da 50 microlitri pulita. Aggiungere inoltre 50 microlitri di buffer di eluizione alle perle, procedendo come con i campioni precedenti, e raccogliere gli eluati corrispondenti. Ricordare di riservare 30 microlitri di tutti i campioni EIT per le analisi mediante SDS-PAGE e immunoblot.

Ora combinare i precipitati eluiti dalle proteine solubili e di membrana marcate con azoto 14 e azoto 15 trattate con A TP positivo e negativo. Eseguire quindi la riduzione e l'alkilazione e la digestione iniziale ad alta concentrazione di urea come descritto nel manoscritto allegato. Procedere quindi con una digestione tripartita su un agitatore rotante per almeno 16 ore.

A 37 gradi Celsius. Pellettare le perle di tripsina mediante centrifugazione per cinque minuti a 16.100 ×g e a 4 gradi Celsius. Trasferire i soprannatanti in nuove provette da due millilitri.

Lavare i vecchi tubi con 50 microlitri di bicarbonato di ammonio 20 millimolare, 0,5% di acido acetico e raccogliere insieme ai primi supernatanti. Per preparare in laboratorio le punte C 18 per la desalazione dei campioni, ritagliare due dischetti dal materiale emcor C 18 utilizzando un ago da siringa e inserirli in una punta da pipetta da 200 microlitri. Successivamente, praticare dei fori nei tappi di quattro tubi einor da due millilitri e inserire le punte; condizionare le punte C 18 con 50 microlitri di soluzione B, centrifugare per tre minuti a 800 ×g e 25 gradi Celsius.

Successivamente, equilibrare le puntine C 18 con 100 microlitri di soluzione, centrifugando per tre minuti a 800 ×g e 25 gradi Celsius. Ripetere questo passaggio di equilibrazione una volta ancora. Procedere quindi con il caricamento di 100 microlitri dei surnatanti campione ottenuti dalle digestioni tripliche sulle puntine C 18, centrifugando per tre minuti a 800 ×g e 25 gradi Celsius.

Ripetere il caricamento sulla colonna per un'applicazione completa dei soprannatanti campione. Dopo aver lavato le punte a stadio C18, eluire i peptidi tripsici in un nuovo tubo einor da 1,5 millilitri con 50 microlitri di soluzione B, centrifugare per tre minuti a 800 ×g e 25 gradi Celsius. Ripetere il passaggio di eluizione una volta, quindi essiccare completamente i peptidi in un evaporatore speed VAC.

Sospendere i peptidi liofilizzati in 20 microlitri di soluzione A e incubare per almeno un'ora sul ghiaccio, interrompendo l'incubazione con due cicli di 15 minuti in bagno a ultrasuoni, seguiti da centrifugazione per 20 minuti a 16.100 ×g e a quattro gradi Celsius, quindi applicare Senna a nano C-M-S-M-S HSP 70. È noto che le proteine da shock termico interagiscano con specifiche co-chaperine e substrati soltanto in assenza di ATP; in questi estratti cellulari marcati con azoto 14, hs P 70 B e CGE uno sono localizzati quasi esclusivamente nella frazione solubile, indipendentemente dallo stato di ATP. Al contrario, CF uno beta è localizzato sia nella frazione solubile che in quella arricchita di membrane.

Dato che la sonica frammenta parte della CF una beta dalla membrana in cui si trova l'ATP sintetasi, essa funge da controllo di caricamento per entrambe le frazioni. Quantità simili di HSP 70 B sono state precipitate con gli anticorpi anti-HSP 70 B da estratti solubili marcati con azoto 14 e azoto 15, indipendentemente dallo stato di ATP. Al contrario, bassi livelli della proteina HSP 70 B sono stati precipitati dalle frazioni di membrana, con quantità leggermente maggiori provenienti da frazioni di membrana prive di ATP rispetto a quelle ricche di ATP, come previsto dall'affinità di CGE E uno per hs.

P 70 B dipende dal contesto. Nessuna CGE è stata co-precipitata con HS P 70 B in frazioni solubili o di membrana ricche di TP. Le quantità di proteina CGE co-precipitate con HS P 70 B da frazioni solubili e da frazioni di membrana prive di TP correlano quantitativamente con la quantità di HSP 70 B precipitata. L'interazione tra CGE e HS P 70 B solo nello stato A DP è osservata anche nell'analisi mediante spettrometria di massa.

In questo esperimento, i precipitati sono stati preparati a partire da miscele di estratti marcati con azoto 14 privi di TP e di estratti marcati con azoto 15 contenenti A TP. Mentre le forme marcate pesanti e leggere del peptide HS P 70 B sono state rilevate con intensità uguali, è stata rilevata soltanto la forma marcata leggera del peptide CGE one negli estratti privi di A TP. Gli stessi peptide provenienti dal precipitato anti HS P 70 D DB, ottenuto da miscele di estratti cellulari solubili marcati in modo reciproco, sono mostrati qui. Di conseguenza, è stata rilevata soltanto la forma marcata pesante del peptide CGE one negli estratti privi di A TP, così come entrambe le forme marcate leggere e pesanti dei peptide HSP 70 B.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona conoscenza su come eseguire un esperimento di co-immunoprecipitazione con preparazione del campione per l'analisi tramite spettrometria di massa. Non dimenticare che le contaminazioni con proteine umane, in particolare cheratina, possono interferire con le misurazioni di profilo nello spettrometro di massa e quindi precauzioni di sicurezza come l'uso di guanti, un ambiente pulito e aree di qualità LCMS sono fondamentali durante l'esecuzione di questa procedura.