Name: Un protocollo per lidentificazione di interazioni proteina-proteina Sulla base di 15 N marcatura metabolica, immunoprecipitazione, Spettrometria di massa quantitativa e di affinità di modulazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: Impara a identificare interazioni proteina-proteina specifiche utilizzando marcatura metabolica con 15N, immunoprecipitazione e spettrometria di massa quantitativa su Chlamydomonas. Questo metodo QUICK affinato distingue partner veri da contaminanti.

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Ringraziamo Olivier Vallon per l&#39;antisiero contro CF1β. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Max Planck Society e sovvenzioni della Deutsche Forschungsgemeinschaft (Schr 617/5-1) e il Bundesministerium für Bildung und Forschung (la biologia dei sistemi FORSYS iniziativa, GoFORSYS progetto).

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo recentemente introdotto due miglioramenti del metodo VELOCE: una fase di reticolazione per catturare transitori interazioni proteina-proteina (QUICK-X), e la precipitazione di controllo di normalizzare l&#39;efficienza precipitazioni disuguali 6. Qui vi presentiamo un protocollo contenente due miglioramenti in più di RAPIDO: in primo luogo, si sostituisce SILAC 5 per 15 N marcatura metabolica. I vantaggi sono che 15 N marcatura metabolica è molto più economico rispetto SILAC, se 15 N viene fornito come semplice sale inorganico. Inoltre, con 15 N metabolica etichettatura RAPIDO può essere applicato a prototrofici organismi per tutti gli aminoacidi, come la maggior parte delle piante, funghi e batteri. E infine, arginina-to-prolina interconversione inerente SILAC 5,6 non rappresenta un problema per la quantificazione di 15 N peptidi marcati. Esempi di strumenti idonei per la valutazione quantitativa di 15 proteomica N dati sono 12 MSQUANT o IOMIQS 13. In secondo luogo, si introduce affinità modulazione come mezzo per specificatamente ridurre la quantità di proteine ​​che interagiscono con una proteina bersaglio in un dato campione rispetto all&#39;altro. I vantaggi di questo approccio sono che aggira la costruzione di mutanti knockdown, che per alcuni sistemi modello sono difficili da generare o non può essere generato affatto in caso di proteine ​​bersaglio essenziali. Inoltre, evita fraintendimenti dovuti espressione differenziale proteine ​​potenzialmente presenti come una risposta della cellula a bussare-giù una proteina bersaglio: se altre proteine ​​sono down-regolati come bene e cross-reagiscono con l&#39;antisiero utilizzato per immunoprecipitazione, verrebbero interpretati come partner vera interazione della proteina bersaglio. Finalmente, affinità modulazione sopprime la necessità di trovare un buon anticorpo antigene-to-rapporto. Anche se applichiamo il nostro protocollo di Chlamydomonas reinhardtii come organismo modello, Può essere facilmente adattato a qualsiasi altro organismo che può essere coltivata in coltura cellulare ed è in grado di utilizzare o nitrato di ammonio come fonte di azoto. Modulazione affinità di complessi proteici da ATP / ADP può essere direttamente applicato ad altri accompagnatori cui interazione con i substrati e proteine ​​coorte dipende dallo stato ATP, come i sistemi GroEL/HSP60/Cpn60 o HSP90 chaperone 14,15, o qualsiasi altro sistema in cui affinità di legame sono modulate da ATP. Affinità modulazione dovrebbe funzionare anche per i casi in cui sono alterati affinità tra le interazioni proteina da farmaci specifici, come radicicol geldanamicina o nel caso di sistemi Hsp90 15. Un limite evidente di questo protocollo è che richiede purificati per affinità di anticorpi contro una proteina bersaglio noto per essere sensibili ad un trattamento specifico / farmaco che modula la sua affinità per le proteine ​​partner. Pertanto, non è elevato throughput metodo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Proteina Sepharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> DMP (Dimetil pimelimidate) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8388 </td><td> Conservare essiccato a -20 ° C, sciogliere direttamente prima dell&#39;uso </td></tr><tr><td> Inibitore della proteasi (completo, EDTA-free) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> ATP (adenosina-5&#39;-triphosphat) </td><td> Carl Roth </td><td> K054 </td><td></td></tr><tr><td> Creatina fosfato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 27920 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfochinasi creatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7886 </td><td>; </td></tr><tr><td> DSP ditiobis [succinimidil propionato] </td><td> Sientific Thermo </td><td> 22585 </td><td> Conservare essiccato a 4 ° C </td></tr><tr><td> 15 NH 4 Cl </td><td> Cambridge isotopo laboratori, Andover, MA </td><td> NLM-467 </td><td></td></tr><tr><td> Lys-C (endoproteinasi Lys-C) </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11047825001 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina perline (Poroszyme Immobilized tripsina) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 2-3127-00 </td><td> Mescolare energicamente direttamente prima dell&#39;uso </td></tr><tr><td> Empore C 18 47 millimetri disco </td><td> Varian </td><td> 12145004 </td><td></td></tr></tbody></table>

un protocollo per l&#39;identificazione di interazioni proteina-proteina sulla base di<sup&gt; 15</sup&gt; n marcatura metabolica, immunoprecipitazione, spettrometria di massa quantitativa e di affinità di modulazione

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Interazioni proteina-proteina sono fondamentali per molti processi biologici nella cellula. Pertanto, la loro caratterizzazione svolge un ruolo importante nella ricerca attuale e una pletora di metodi per la loro indagine è disponibile 1. Interazioni proteina-proteina sono spesso altamente dinamico e potrebbe dipendere localizzazione subcellulare, modificazioni post-traduzionali di proteine ​​e dell&#39;ambiente locale 2. Pertanto, essi devono essere esaminati nel loro ambiente naturale, per cui co-immunoprecipitazione approcci sono il metodo di scelta 3. Co-precipitate partner di interazione sono identificati mediante immunoblotting in un approccio mirato, o spettrometria di massa (LC-MS/MS) in modo non mirati. Quest&#39;ultima strategia spesso è influenzata negativamente da un gran numero di falsi positivi scoperte, derivano principalmente dalla sensibilità di moderni spettrometri di massa che con sicurezza rilevare tracce di aspecifico proteine ​​precipitanti. A Recent approccio per superare questo problema si basa sull&#39;idea che ridotte quantità di partner di interazione specifici sarà co-precipitato con una proteina bersaglio in cui la concentrazione cellulare è diminuito di RNAi, mentre le quantità di proteine ​​aspecifico precipitanti dovrebbe essere influenzata. Questo approccio, chiamato VELOCE per immunoprecipitazione quantitativi combinazione con atterramento 4, impiega Etichettatura degli isotopi stabili di aminoacidi nelle cellule in coltura (SILAC) 5 e MS per quantificare la quantità di proteine ​​immunoprecipitate da ceppi wild-type e knock-down. Proteine ​​che si trovano in un rapporto di 1:1 può essere considerata come contaminanti, tali arricchito in precipitati dal tipo selvaggio come partner di interazione specifici della proteina bersaglio. Anche se innovativo, QUICK porta alcune limitazioni: in primo luogo, SILAC è costosa e limitata per gli organismi che idealmente sono auxotrophic per arginina e / o lisina. Risultati di interconversione Inoltre, quando viene alimentato arginina pesante, arginina-to-prolina in additmassa ional sposta per ciascun prolina in un peptide e diluisce leggermente pesante con arginina luce, che rende la quantificazione più noioso e meno accurato 5,6. Secondo, VELOCE richiede che gli anticorpi vengono titolati in modo tale che essi non si satura con proteina bersaglio in estratti di knock-down mutanti. Qui vi presentiamo un protocollo modificato VELOCE che supera i limiti di cui sopra, con Quick sostituendo SILAC per l&#39;etichettatura 15 N metabolica e sostituendo RNAi mediato knock-down per la modulazione affinità di interazioni proteina-proteina. Dimostriamo l&#39;applicabilità del protocollo in base alle unicellulari Chlamydomonas verde alga reinhardtii come organismo modello e il tuttofare HSP70B cloroplasto come proteina bersaglio 7 (Figura 1). HSP70s sono noti per interagire con specifiche co-accompagnatori e substrati solo nello stato ADP 8. Sfruttiamo questa proprietà come mezzo per verificare la specificainterazione di HSP70B con il suo fattore di scambio nucleotidico CGE1 9.

Vi presentiamo una variante del RAPIDO (immunoprecipitazione quantitativi combinazione con smontabile), approccio che è stato introdotto in precedenza per distinguere tra vero e falso interazioni proteina-proteina. Il nostro approccio è basato sulla<sup&gt; 15N</sup&gt; Marcatura metabolica, la modulazione di affinità di interazioni proteina-proteina dalla presenza / assenza di ATP, immunoprecipitazione e spettrometria di massa quantitativa.

Un protocollo per l&#39;identificazione di interazioni proteina-proteina Sulla base di<sup&gt; 15</sup&gt; N marcatura metabolica, immunoprecipitazione, Spettrometria di massa quantitativa e di affinità di modulazione

Le interazioni proteina-proteina sono fondamentali per molti processi biologici all'interno della cellula. Pertanto, la loro caratterizzazione svolge un ruolo importante in...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è identificare le proteine che interagiscono specificamente con una determinata proteina bersaglio in estratti cellulari contenenti proteine solubili e di membrana. In primo luogo, si ottiene un'etichettatura metabolica completa delle cellule di chlamydomonas con azoto 14 e azoto 15 e si generano lisati cellulari contenenti e privi di una TP. Un passaggio opzionale di cross-linking contribuisce a stabilizzare le interazioni transitorie tra proteine. Successivamente, si separano i lisati cellulari in frazioni, arricchendo le proteine insolubili e quelle di membrana da cui la proteina bersaglio e i suoi partner specifici di interazione.Una proteina controllo e proteine contaminanti vengono immunoprecipitate e eluite. Ora, mescolare le proteine immunoprecipitate, digerirle in triplice replicazione e analizzarle mediante spettrometria di massa in tandem con cromatografia liquida. I risultati distinguono tra partner d'interazione veri e falsi mostrando rapporti peptidici diversi tra azoto 14 e azoto 15 per le proteine che interagiscono specificamente con la proteina bersaglio e rapporti uguali di azoto.Rapporti peptidici azoto 15 per la proteina bersaglio, la proteina di controllo e le proteine contaminanti. Il metodo scelto per analizzare le interazioni proteina-proteina è quello di immunoprecipitare direttamente la proteina di interesse insieme ai suoi partner d'interazione da estratti cellulari in cui entrambi sono presenti nella loro conformazione e concentrazione native.Tuttavia, procedendo in questo modo, vengono precipitate anche proteine di contaminazione, principalmente perché interagiscono con gli anticorpi utilizzati, dato che gli spettrometri di massa moderni sono estremamente sensibili. Essi identificheranno in modo inequivocabile anche le proteine contaminanti e, di conseguenza, sarà impossibile distinguere gli artefatti dai veri partner d'interazione. Questo problema viene risolto mediante la tecnica qui mostrata, basata sull'etichettatura metabolica con 15 N, sull'immunoprecipitazione, sulla modulazione dell'affinità mediata dallo stato A TP e sulla spettrometria di massa quantitativa.La tecnica sarà mostrata da Stefan SCH Malinger, che è un dottorando senior nel mio laboratorio. Dopo aver marcato le cellule per 10 generazioni, trasferire due aliquote di cellule di Chlamydomonas marcate con azoto 14 e azoto 15 in provette 4G SA, raccoglierle mediante centrifugazione, risospendere i pellet in due millilitri di tampone di lisi freddo su ghiaccio e trasferire le sospensioni in provette Falcon da 15 millilitri. Raccogliere le cellule rimanenti con un ulteriore millilitro di tampone di lisi ciascuna per ogni Eloqua. Aggiungere 50 microlitri di inibitore delle proteasi 25x e 12,5 microlitri di cloruro di magnesio uno molare; sottoporre i campioni a sonicazione quattro volte per 20 secondi su ghiaccio per una completa lisi cellulare, con intervalli di 22 secondi tra un ciclo e l'altro per il raffreddamento.Preparare quattro cuscinetti di saccarosio da sei millilitri in provette con pareti sottili SW 41 TI. Applicare con attenzione l'intero volume dei lisati cellulari sui cuscinetti di saccarosio. Bilanciare con il buffer di lisi e centrifugare per separare i complessi proteici solubili dalle membrane.Trasferire i complessi proteici solubili dalla parte superiore del gradiente in quattro provette falcon da 15 millilitri, avendo cura di evitare il trasferimento di parti del cuscino di saccarosio. Successivamente, aggiungere a ciascun campione Triton X-100 al 10% per ottenere una concentrazione finale dello 0,5%. Mescolare con attenzione e aggiungere il buffer di lisi fino a un volume totale di sette millilitri.Per analisi immunologiche e SDS-PAGE. Mettere da parte 70 microlitri di ciascun estratto cellulare solubile in una nuova provetta conica da 1,5 millilitri e aggiungere 70 microlitri di buffer campione 2X SDS. Successivamente, scartare i cuscinetti di saccarosio dalle provette sottili SW 41 TI e aggiungere tre millilitri di buffer di lisi a ciascun pellet.Aggiungere un millilitro di Triton X-100 al 10% per ottenere una concentrazione finale del 2%. Dopo aver disciolto ogni pellet mediante sonificazione, aggiungere il buffer di lisi fino a un volume totale di cinque millilitri e centrifugare. Come in precedenza, raccogliere le frazioni superiori dei complessi proteici di membrana in provette Falcon da 15 millilitri. Aggiungere il buffer di lisi contenente il 2% di Triton X-100 fino a un volume finale di sette millilitri.Utilizzare 70 microlitri di questi campioni per analisi mediante elettroforesi SDS-PAGE e immunoblotting. Innanzitutto, equilibrare la proteina legata all'anticorpo. Lavare le perle sieriche con due lavaggi di quattro millilitri ciascuno di buffer di lisi, diluire fino a otto millilitri e aliquotare.Un millilitro della sospensione in ciascuna delle otto provette falcon da 15 millilitri contenenti complessi proteici solubili o di membrana da cellule marcate con azoto 14 e azoto 15, in presenza o assenza di TP, incubare per due ore a quattro gradi Celsius su un rullo per provette per precipitare i complessi proteici. Pellettizzare le perle mediante centrifugazione, scartare i soprannatanti lasciando un piccolo volume di liquido sulla superficie delle perle per evitare contaminazioni da proteine aderenti alle pareti di plastica. Trasferire i campioni in nuove provette coniche da 1,5 millilitri per raccogliere tutte le perle residue nelle provette falcon. Aggiungere ulteriori 0,8 millilitri di buffer di lisi contenente 0,1% Triton a ciascuna provetta, vortexare delicatamente, centrifugare e trasferire il buffer con le perle residue nelle provette Eppendorf. Dopo diversi passaggi di lavaggio, centrifugare i campioni per 15 secondi a 16.100 ×g e a quattro gradi Celsius.Rimuovere prima i soprannatanti del campione utilizzando una pipetta normale. Quindi rimuovere completamente qualsiasi residuo di soprannatante con la siringa Hamilton da 50 microlitri. Aggiungere a ciascun campione 100 microlitri di tampone di eluizione appena preparato e incubare in un termomiscelatore a 800 RPM, centrifugare i campioni per 15 secondi a 16.100 ×g e a 25 °C.Ora trasferire ogni sopranatante in una provetta pulita utilizzando una siringa Hamilton da 50 microlitri pulita. Aggiungere inoltre 50 microlitri di tampone di eluizione alle perle, procedendo come con i campioni precedenti, e raccogliere gli eluati corrispondenti. Ricordare di riservare 30 microlitri di tutti i campioni EIT per le analisi mediante SDS-PAGE e immuno-blot.Ora combinare i precipitati eluiti provenienti dai campioni trattati con ATP e senza ATP, contenenti proteine solubili e membrane marcate con azoto 14 e azoto 15. Eseguire quindi la riduzione e l'alkilazione e la digestione iniziale ad alta concentrazione di urea come descritto nel manoscritto allegato. Procedere quindi con una digestione tripartita su un agitatore rotante per almeno 16 ore.A 37 gradi Celsius. Pellettare le perle di tripsina mediante centrifugazione per cinque minuti a 16.100 ×g e 4 gradi Celsius. Trasferire i soprannatanti in nuove provette da due millilitri.Lavare i vecchi tubi con 50 microlitri di bicarbonato di ammonio 20 millimolare, 0,5% di acido acetico e raccogliere insieme ai primi supernatanti. Per preparare in laboratorio le punte C 18 per la desalazione dei campioni, ritagliare due dischetti dal materiale C 18 emcor utilizzando un ago da siringa e inserirli in una punta da pipetta da 200 microlitri. Successivamente, praticare dei fori nei tappi di quattro tubi einor da due millilitri e inserire le punte; precondizionare le punte a stadio C 18 con 50 microlitri di soluzione B, centrifugare per tre minuti a 800 ×g e 25 gradi Celsius.Successivamente, equilibrare le punte in C18 con 100 microlitri di soluzione, centrifugando per tre minuti a 800 ×g e 25 °C. Ripetere questo passaggio di equilibrazione una volta ancora. Procedere quindi con il caricamento di 100 microlitri dei supernatanti campione ottenuti dalle digestioni tripliche sulle punte in C18, centrifugando per tre minuti a 800 ×g e 25 °C.Ripetere il caricamento sulla colonna per un'applicazione completa dei soprannatanti del campione. Dopo aver lavato le punte a stadio C18, eluire i peptidi tripsici in un nuovo tubo da 1,5 millilitri con 50 microlitri di soluzione B, centrifugare per tre minuti a 800 ×g e 25 °C. Ripetere il passaggio di eluizione una volta, quindi asciugare completamente i peptidi in un evaporatore Speed Vac.Sospendere i peptidi liofilizzati in 20 microlitri di soluzione A e incubare per almeno un'ora sul ghiaccio, interrompendo con due incubazioni di 15 minuti in un bagno a ultrasuoni, quindi centrifugare per 20 minuti a 16.100 ×g e a quattro gradi Celsius ed applicare Senna a nano C-M-S-M-S HSP 70. È noto che le proteine da shock termico interagiscano con specifiche co-chaperine e substrati solo in assenza di ATP; in questi estratti cellulari marcati con azoto-14, hsP 70 B e CGE 1 sono quasi esclusivamente localizzati nella frazione solubile, indipendentemente dallo stato di ATP. Al contrario, CF 1 beta è localizzata sia nella frazione solubile che in quella arricchita di membrane.Dato che la sonica scinde una parte della CF una beta dalla membrana in cui si trova l'ATP sintetasi, essa funge da controllo di caricamento per entrambe le frazioni. Quantità simili di H HSP 70 B sono state precipitate con gli anticorpi anti-HSP 70 B da estratti solubili marcati con azoto-14 e azoto-15, indipendentemente dallo stato di ATP. Al contrario, bassi livelli della proteina HSP 70 B sono stati precipitati dalle frazioni di membrana, con quantità leggermente maggiori provenienti da frazioni di membrana prive di ATP rispetto a quelle ricche di ATP, come previsto dall'affinità di CGE E uno per hs.P 70 B dipende dal contesto. Nessuna CGE è stata co-precipitata con HS P 70 B in frazioni solubili o di membrana ricche di TP. Le quantità di proteina CGE co-precipitate con HS P 70 B da frazioni solubili e da frazioni di membrana prive di TP correlano quantitativamente con la quantità di HSP 70 B precipitata. L'interazione tra CGE e HS P 70 B solo nello stato A DP è osservata anche nell'analisi mediante spettrometria di massa.In questo esperimento, i precipitati sono stati preparati a partire da miscele di estratti marcati con azoto 14 privi di TP e di estratti marcati con azoto 15 contenenti A TP. Mentre le forme marcate pesanti e leggere del peptide HS P 70 B sono state rilevate con intensità uguali, è stata rilevata soltanto la forma marcata leggera del peptide CGE one negli estratti privi di A TP. Gli stessi peptide provenienti dal precipitato anti HS P 70 D DB, ottenuto da miscele di estratti cellulari solubili marcati in modo reciproco, sono mostrati qui. Di conseguenza, è stata rilevata soltanto la forma marcata pesante del peptide CGE one negli estratti privi di A TP, così come entrambe le forme del peptide HSP 70 B marcate leggera e pesante.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona conoscenza su come eseguire un esperimento di co-immunoprecipitazione con preparazione del campione per l'analisi tramite spettrometria di massa. Non dimenticare che le contaminazioni con proteine umane, in particolare cheratina, interferiranno con le tue misurazioni di profilo nello spettrometro di massa e quindi precauzioni di sicurezza come l'uso di guanti, un ambiente pulito e aree di qualità LCMS sono fondamentali durante l'esecuzione di questa procedura.

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Esperimenti di immunoprecipitazione SILAC rappresentano un potente mezzo per scoprire nuova proteina: interazioni proteina. Consentendo l'accurata quantificazione relativa abbondanza di proteine ​​sia nel controllo e campioni di prova, veri interazione può essere facilmente distinto da contaminanti sperimentali e interazioni bassa affinità conservata attraverso l'uso di condizioni di buffer meno stringenti.

Identificazione delle proteine ​​partner di interazione in cellule di mammifero Uso SILAC-immunoprecipitazione quantitativi Proteomica

Qui si descrivono i protocolli di perturbare le cellule di mammifero mediante fresatura a stato solido ad una temperatura criogenica, la produzione di un estratto cellulare dalla polvere di cellule risultante, e isolare complessi proteici di interesse per cattura affinità su perline paramagnetici micron scala anticorpi accoppiati.

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Abbiamo stabilito un metodo per la purificazione di proteine ​​di interazione coregolamentazione utilizzando il sistema LC-MS / MS.

Una proteina metodo di preparazione per l&#39;high-throughput identificazione di proteine ​​che interagiscono con un cofattore nucleare Utilizzando LC-MS / MS Analysis

Vi presentiamo un protocollo per quantificare con precisione le proteine con etichettatura isobarico, vasto frazionamento, strumenti di bioinformatica e procedura di controllo di qualità in combinazione con cromatografia liquida interfacciato ad uno spettrometro di massa ad alta risoluzione.

Proteoma profonda profilatura di etichettatura isobarico, vasto cromatografia liquida, spettrometria di massa e quantificazione assistita da Software

Forniamo un protocollo dettagliato per Spalato-BioID, un'analisi di frammenti-complementazione della proteina basata sulla tecnica di prossimità-etichettatura BioID. Attivato sull'interazione di due proteine specificate, permette l'analisi proteomica dei complessi della proteina contesto-dipendente in ambiente nativo di cellulare. Il metodo è semplice, economica e richiede solo la normale attrezzatura da laboratorio.

Split-BioID — Analisi proteomica dei complessi della proteina contesto specifico in ambiente nativo di cellulare

Interazioni proteina-proteina e proteina-metabolita sono cruciali per tutte le funzioni cellulari. Qui, descriviamo un protocollo che permette l'analisi parallela di queste interazioni con una proteina di scelta. Il nostro protocollo è stato ottimizzato per colture di cellule vegetali e combina purificazione di affinità con proteina basati sulla spettrometria di massa e rilevamento di metabolita.

2 in 1: purificazione di affinità per l'analisi parallela di proteina-proteina e proteina-metabolita complessi in un unico passaggio

Qui, presentiamo un protocollo per una tecnica di digestione su membrana per la preparazione di campioni per la spettrometria di massa. Questa tecnica facilita la comoda analisi delle interazioni proteina-proteina.

Valutazione delle interazioni tra proteine e proteine utilizzando una tecnica di digestione On-Membrane

Questo protocollo si concentra sull'identificazione delle proteine che si legano ai fosfati inositoli o fosforoparassiti. Utilizza la cromatografia di affinità con fosfati inositoli biotinylati o fosforostostodi che vengono immobilizzati tramite streptavidin a agarose o perline magnetiche. Le proteine leganti al fosfato o fosfoinosazione sono identificate da gonfiore occidentale o spettrometria di massa.

Identificazione delle proteine che interagiscono con fosfato inositolo o fosfonositide mediante matricografia affinità accoppiata a Blot occidentale o spettrometria di massa

L'immunoprecipitazioni quantitativa multiplex (QMI) utilizza la citometria di flusso per rilevare sensitivemente le differenze nell'abbondanza di interazioni mirate proteina-proteina tra due campioni. QMI può essere eseguita utilizzando una piccola quantità di biomateriale, non richiede tag geneticamente ingegnerizzati e può essere adattato per qualsiasi rete di interazione proteica definita in precedenza.

Quantificazione delle dinamiche della rete di interazione proteica mediante co-immunoprecipitazioni multiplexate

Descritto è un flusso di lavoro proteomico per identificare i partner di interazione delle proteine da una frazione subcellulare nucleare utilizzando l'arricchimento dell'immunoaffinità di una determinata proteina di interesse e la spettrometria di massa priva di etichette. Il flusso di lavoro include frazionamento subcellulare, immunoprecipitazioni, preparazione dei campioni assistiti dal filtro, pulizia offline, spettrometria di massa e una pipeline bioinformatica a valle.

Flusso di lavoro per spettrometria di massa per l'immunoprecipitazioni nucleari senza etichetta per la profilazione del contraglio nucleare su larga scala

Qui, presentiamo un protocollo per consentire la cattura e l'identificazione di interazioni proteina-proteina specifiche della malattia da cellule e tessuti nativi utilizzando sonde chimiche e spettrometria di massa. I set di dati di interazione risultanti vengono analizzati attraverso una piattaforma web dedicata per rivelare disfunzioni dinamiche della rete e alterazioni del percorso legate alla malattia.

Mappatura delle interazioni disfunzionali proteina-proteina nella malattia

Impara a identificare interazioni proteina-proteina specifiche utilizzando marcatura metabolica con 15N, immunoprecipitazione e spettrometria di massa quantitativa su Chlamydomonas. Questo metodo QUICK affinato distingue partner veri da contaminanti.

Un protocollo per lidentificazione di interazioni proteina-proteina Sulla base di 15 N marcatura metabolica, immunoprecipitazione, Spettrometria di massa quantitativa e di affinità di modulazione (Video) | JoVE Journal

Un protocollo per l'identificazione di interazioni proteina-proteina Sulla base di

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