Un protocollo per l'identificazione di interazioni proteina-proteina Sulla base di ¹⁵ N marcatura metabolica, immunoprecipitazione, Spettrometria di massa quantitativa e di affinità di modulazione

L'obiettivo generale del seguente esperimento è identificare le proteine che interagiscono specificamente con una data proteina bersaglio in estratti cellulari contenenti proteine solubili e di membrana. In primo luogo, ottenere la marcatura metabolica completa delle cellule di chlamydomonas con azoto 14 e azoto 15 e generare lisati cellulari contenenti e privi di TP. Una fase di reticolazione opzionale aiuta a stabilizzare le interazioni proteiche transitorie. Successivamente, separare i lisati cellulari in frazioni, proteine insolubili arricchite e proteine di membrana da cui la proteina bersaglio, i suoi specifici partner di interazione.

Una proteina di controllo e le proteine contaminanti sono immunoprecipitate e alluse. Ora, mescola le proteine immunoprecipitate e digerile tre volte e analizzale con LCMS in tandem. I risultati hanno distinto tra veri e falsi partner di interazione mostrando diversi rapporti tra azoto, 14 azoto, 15 peptidi per le proteine che interagiscono specificamente con la proteina bersaglio e azoto uguale.

14 rapporti peptidici di azoto 15 per la proteina bersaglio, la proteina di controllo e le proteine contaminanti. Il metodo di scelta per l'analisi delle interazioni proteina-proteina è quello di immunoprecipitare la proteina di scelta direttamente con la sua interazione. Partner da estratti cellulari in cui entrambi si verificano alla loro conferma e concentrazione nativa.

Tuttavia, quando lo si fa, anche le proteine contaminanti vengono precipitate principalmente perché interagiscono con gli anticorpi utilizzati in quanto i moderni spettrometri di massa sono estremamente sensibili. Identificheranno inequivocabilmente anche le proteine contaminanti e quindi è impossibile distinguere i guasti dai veri partner di interazione. Questo problema è superato dalla tecnica qui mostrata, che si basa sulla modulazione dell'affinità di immunoprecipitazione della marcatura metabolica a 15 N qui mediata dallo stato A TP e dalla spettrometria di massa quantitativa.

La tecnica sarà mostrata da Stefan SCH Malinger, che è uno studente di dottorato senior nel mio laboratorio. Dopo aver etichettato le cellule per 10 generazioni, trasferire due aliquote ciascuna di cellule di clamidomonas marcate con azoto 14 e azoto 15 in provette 4G SA, raccogliere mediante centrifugazione Resus, sospendere i pellet in due millilitri di tampone di lisi ghiacciato e trasferire le sospensioni in provette Falcon da 15 millilitri, raccogliere le cellule rimanenti con un ulteriore millilitro di tampone di lisi ciascuna per ogni Eloqua. Aggiungere 50 microlitri di 25 inibitori della proteasi e 12,5 microlitri di campioni di cloruro di magnesio monomolare sonicati quattro volte per 20 secondi su ghiaccio per completare l'ISIS cellulare con 22a pausa intermedia per il raffreddamento.

Preparare quattro cuscini di saccarosio da sei millilitri in tubi a parete sottile SW 41 TI. Appoggiare con cura l'intero volume dei lisati cellulari sui cuscini di saccarosio. Bilancia con lisi, tampone e centrifuga per separare i complessi proteici solubili dalle membrane.

Trasferire i complessi proteici solubili dalla parte superiore del gradiente in quattro provette di falco da 15 millilitri. Facendo attenzione a evitare di trasferire parti del cuscino di saccarosio. Quindi a ciascun campione aggiungere il 10% di Tritone X 100 a una concentrazione finale dello 0,5%Mescolare accuratamente e aggiungere il tampone di lisi per un volume totale di sette millilitri.

Per la pagina SDS e le analisi immuno del sangue. Mettere da parte 70 microlitri di ciascun estratto di cellule solubili in una provetta conica fresca da 1,5 millilitri e aggiungere 70 microlitri di due tamponi per campioni XSDS. Quindi, scartare i cuscini di saccarosio dai tubi a parete sottile SW 41 TI e aggiungere tre millilitri di tampone di lisi a ciascun pellet.

Aggiungere un millilitro di tritton X 100 al 10% a una concentrazione finale del 2%Dopo aver sciolto ogni pellet mediante sonicazione, aggiungere il tampone di lisi per un volume totale di cinque millilitri e centrifugare. Come in precedenza, raccogliere le frazioni superiori dei complessi proteici di membrana in provette di falco da 15 millilitri. Aggiungere il tampone di lisi contenente il 2% di tritton X 100 a un volume finale di sette millilitri.

Utilizzare 70 microlitri di questi campioni per la pagina SDS e le analisi immuno del sangue. Per prima cosa equilibrare la proteina accoppiata ad anticorpi. Un siero, perle con due lavaggi da quattro millilitri di tampone di lisi, diluito a otto millilitri e aliquota.

Un millilitro della sospensione a ciascuna delle otto provette di falco da 15 millilitri contenenti complessi proteici solubili o di membrana da un TP completo e un TP impoverito di azoto 14 e azoto 15 marcati cellule incubare per due ore a quattro gradi Celsius su un rullo di tubi per precipitare i complessi proteici pellettare le perle mediante centrifugazione, Scartare i surnatanti, lasciando un piccolo volume di liquido sopra le perle per evitare la contaminazione da proteine che aderiscono alle pareti di plastica. Trasferire i campioni in provette coniche fresche da 1,5 millilitri per raccogliere tutte le perle rimanenti nelle provette falcon. Aggiungere altri 0,8 millilitri di tampone di lisi contenente lo 0,1% di tritton a ciascun vortice, centrifugare delicatamente e trasferire il tampone con le perle residue nelle provette einor Dopo diverse fasi di lavaggio, centrifugare i campioni per 15 secondi a 16, 100 volte G e quattro gradi Celsius.

Rimuovere prima i surnatanti del campione con una normale pipetta. Quindi rimuovere completamente l'eventuale surnatante rimanente con la siringa Hamilton da 50 microlitri. A ciascun campione, aggiungere 100 microlitri di tampone di eluizione appena preparato e incubare in un termomiscelatore a 800 giri/min, centrifugare i campioni per 15 secondi a 16, 100 volte G e 25 gradi Celsius.

Ora trasferisci ogni surnatante in una nuova provetta usando una siringa Hamilton pulita da 50 microlitri. Aggiungere anche 50 microlitri di tampone di eluizione al processo delle perle come per i campioni precedenti e raggruppare i rispettivi elati. Ricordarsi di riservare 30 microlitri di tutti i campioni di EIT per la pagina SDS e le analisi immuno del sangue.

Ora combina i precipitati elusi da più e meno A TP trattato con azoto 14 e azoto 15 marcato con proteine solubili e di membrana. Quindi eseguire l'alchilazione di riduzione e l'iniziale digerito di urea alta come descritto nel manoscritto di accompagnamento. Procedere a un trittico di riassunto su una ruota di rotazione per almeno 16 ore.

A 37 gradi Celsius. Pellettare le perle tripsine con una centrifugazione di cinque minuti a 16, 100 volte G e quattro gradi Celsius. Trasferire i surnatanti in provette fresche da due millilitri.

Lavare i vecchi tubi con 50 microlitri di bicarbonato di ammonio da 20 millimolari, acido acetico allo 0,5% e accumulare con i primi surnatanti. Per preparare i puntali C 18 fatti in casa per la desalinizzazione dei campioni, ritagliare due dischi dal materiale emcor C 18 con un ago da siringa e inserirli in un puntale per pipetta da 200 microlitri. Quindi praticare dei fori nei coperchi di quattro provette da due millilitri e inserire i puntali per precondizionare i puntali dello stadio C 18 con 50 microlitri di soluzione B centrifugare per tre minuti a 800 G e 25 gradi Celsius.

Quindi, equilibrare le punte dello stadio C 18 con 100 microlitri di soluzione, centrifugare per tre minuti a 800 G e 25 gradi Celsius. Ripeti ancora una volta questo passaggio di equilibrio. Procedere al caricamento di 100 microlitri di surnatanti del campione dalla digestione del trittico sulla centrifuga con puntali dello stadio C 18 per tre minuti a 800 G e 25 gradi Celsius.

Ripetere il caricamento della colonna per l'applicazione completa dei surnatanti del campione. Dopo aver lavato i puntali dello stadio C 18, eluire i peptidi triptici in una provetta fresca da 1,5 millilitri con 50 microlitri di centrifuga B in soluzione per tre minuti a 800 G e 25 gradi Celsius. Ripetere il passaggio eluciano una volta e poi asciugare i peptidi fino al completamento in una velocità VAC reus.

Sospendere i peptidi essiccati in 20 microlitri di soluzione A e incubare per almeno un'ora sul ghiaccio, interrotto da due incubazioni di 15 minuti in una centrifuga a bagno sonicato per 20 minuti a 16, 100 volte G e quattro gradi Celsius e applicare Senna a nano C-M-S-M-S HSP 70. È noto che le proteine da shock termico interagiscono con specifici chaperoni e substrati di cos solo in assenza di un TP in questi estratti cellulari marcati con azoto 14 hs P 70 B e CGE one sono quasi esclusivamente localizzati nella frazione solubile indipendentemente dallo stato A TP. Al contrario, la CF one beta è localizzata sia nella frazione solubile che in quella arricchita di membrana.

Poiché la sonicazione cede parte di CF one beta dalla membrana situata A TP Synthes, funge da controllo del carico per entrambe le frazioni. Quantità simili di H HSP 70 B sono state precipitate con gli anticorpi anti HSP 70 B da estratti solubili marcati con azoto 14 e azoto 15 indipendentemente dallo stato A TP. Al contrario, bassi livelli di proteina HS P 70 B precipitati da frazioni di membrana con quantità leggermente maggiori originate da frazioni di membrana impoverite di TP rispetto a frazioni di TP complete come affinità attesa di CGE E uno per hs.

P 70 B dipende dal contesto. Nessuno CGE è stato coprecipitato con HS P 70 B.In frazioni solubili o di membrana complete di TP. Le quantità di CGE una proteina coprecipitata con HS P 70 B da frazioni solubili impoverite di TP e frazioni di membrana deplete di TP sono correlate quantitativamente con la quantità di HSP 70 B precipitato.

In questo esperimento, sono stati preparati precipitati per miscele di estratti marcati con azoto 14 privi di un TP e estratti marcati con azoto 15 contenenti A TP. Mentre le forme marcate con il peso e la luce del peptide HS P 70 B sono state rilevate a intensità uguali, è stata rilevata solo la forma marcata con la luce del peptide CGE one dagli estratti impoveriti di A TP. Gli stessi peptidi del precipitato anti HS P 70 D DB derivati da miscele di estratti cellulari solubili reciprocamente marcati sono mostrati qui. Di conseguenza, è stata rilevata solo la forma marcata pesante del peptide CGE one in un estratto impoverito di TP, così come i peptidi HSP 70 B marcati sia leggeri che pesanti.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona impressione su come eseguire un esperimento di precipitazione del coun con preparazione del campione per l'analisi della spettrometria di massa. Non dimenticare che le contaminazioni con proteine umane, in particolare la cheratina, disturberanno le misurazioni della profilassi nello spettrometro di massa e quindi le precauzioni di sicurezza come guanti, ambiente pulito e regioni di grado LCMS sono fondamentali durante l'esecuzione di questa procedura.